役割に関連する労働者の生理機能を解析するための便利なツール - ここでは、単一コホートミツバチコロニーの製造のための私達の詳細なプロトコルを記述します。また、労働者の行動および/または生理の調節におけるこれらのホルモンの関与を評価するために、幼若ホルモンおよびエクジソンで労働者を治療するための詳細なプロトコルを記述します。
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この記事について
サマリー
要約
ミツバチの働きバチは、コロニー活動の維持に関連する様々な仕事に従事しています。労働者の業務は年齢によって変わります(年齢別分業)。若い労働者はひなの世話(ナースミツバチ)に従事し、年配の労働者は蜜と花粉の採餌(採餌者)に従事しています。労働者の生理機能は、この役割の変化に関連して変化します。例えば、下咽頭腺(HPG)の主な機能は、主要なローヤルゼリータンパク質(MRJP)の分泌から炭水化物代謝酵素の分泌に変わります。典型的なコロニーでは、働き手のタスクは働き手の年齢とともに変化するため、加齢に伴って発生する生理学的変化と役割シフトに伴って発生する生理学的変化を区別することは困難です。役割シフトに関連したHPGを含む働きバチ組織の生理学的変化を研究するためには、ほぼ同じ年齢の働きバチが異なるタスクを実行する単一コホートコロニーを準備することにより、ミツバチのコロニー集団を操作することが有用である。ここでは、この分析のために単一コホートコロニーを調製するための詳細なプロトコルについて説明します。単一コホートのコロニー準備から6〜8日後、通常よりも早く採餌作業を行う早熟な採集者がコロニーに現れます。代表的な結果は、HPG遺伝子発現の役割に関連する変化を示し、役割に関連するHPG機能を示唆しています。コロニー集団の操作に加えて、内分泌系の分析は、役割に関連する生理機能を調査するために重要です。ここでは、アクジソンの活性型である 20-ヒドロキシエクジソン (20E) と若年ホルモン類似体であるメトプレンで労働者を治療するための詳細なプロトコルについても説明します。処理されたミツバチの生存率は、HPGの遺伝子発現を調べるのに十分であり、20Eおよび/またはメトプレン治療に応答して遺伝子発現の変化が観察され、ホルモン処理がHPGの生理学的変化を誘導することを示唆しています。ここで説明するホルモン治療のプロトコルは、労働者の生理機能に対するホルモンの影響を調べるのに適しています。
概要
ヨーロッパミツバチ、 ミツバチは 、高度に組織化された社会1と真社会性昆虫です。ワーカーミツバチ（労働カーストは）労働2-4の年齢関連部門と呼ばれる、コロニー活性を維持するためにさまざまなタスクに従事し、かつ、これらのタスクは、羽化後ワーカーミツバチの年齢に応じて変更されています。若年労働者（<13日齢）高齢労働者がいる間、ローヤルゼリー（看護師蜂）を分泌することによりハイブのひなの世話をする（> 15日齢）はハイブ（飼料収穫機）2-4の外に蜜や花粉を集めます。労働者の生理機能は、この役割のシフトに関連して変化します。例えば、下咽頭腺（HPGs）の機能は、頭部に位置する外分泌腺、2,5を採餌する看護か らロールシフトに関連して変化をペアリング。ナース蜂HPGsは、主に蜂のミルクの主要な構成要素である主要なローヤルゼリーのタンパク質を合成します。一方、飼料収穫機HPGs主ブドウ糖と果糖にショ糖を変換することによって蜂蜜に蜜を処理するために、このようなαグルコシダーゼIIIなどの炭水化物代謝酵素を合成。我々の以前の研究では、α-グルコシダーゼIIIをコードする主要なローヤルゼリータンパク質、およびHBG3、ロールシフト6-9中の変更をエンコードするmrjp2の発現、ことを明らかにしました。
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プロトコル
シングルコホートコロニーの調製
- 2つの単一コホートコロニーを作成するために、3つのミツバチのコロニーを準備し、新たに出現した労働者の十分な数を取得します。
- 櫛でキャップされた末梢細胞内のいくつかの蛹は、ピンセットを使用してキャップされた櫛を開くことによって、茶色の目と着色されたキューティクルを持っていることを確認してください。これらの蛹が周辺コーム細胞に存在する場合、全体の櫛で蛹のほとんどは約1-3日で出てきます。
- その後、すべての付着大人のミツバチをブラシで除去された後にこれらの蛹を含む櫛を収集し、コロニー間のばらつきを最小限にするために3個のコロニーから櫛を混ぜます。
- 空の巣のボックスに集めコームを置き、高湿度（> 60％の相対湿度）下で33℃でインキュベートします。収集した櫛から3日（コロニーあたり3,000労働者）で約6000新興労働者を集めます。
- workeの量を決定5新たに出現した労働者の重量に基づいて、RSはランダムに操作されていないコロニーから集めました。
- ランダムに計量機を使用して操作されていないコロニーから収集した5新興労働者を計量。
注：5新興労働者の量は、一般に500から600 mgです。 - 5新たに出現した労働者の平均重量によって収集された労働者の重量を割ることによって収集した労働者の量を推定します。
- ランダムに計量機を使用して操作されていないコロニーから収集した5新興労働者を計量。
- 水ベースの....
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結果
単一コホートコロニーを調製するための手順の概要を、図1Aに示されています。サンプルコレクションに単一コホートコロニーを調製から実験の時間経過を、 図1Bに示されています。看護の動作や採餌行動のための行動基準を満たした労働者は、シングルコホートコロニーから回収し、HPGの開発はこれらの労働者に推定された表1は、3つのグループにHPG開発の分類を示しています。サイズに応じて「開発」、「中級」、および「縮みました」。 HPGsこれら3つのクラスを示す代表的な写真を図2に示されている。結果は、看護師の蜂と早熟飼料収穫機の両方が、プロトコルに記載された基準に従って、またシングルコホートコロニーで観察されたことを示しています。 HPGsでmrjp2とHBG3の発現したアンHPG機能は労働者の役割（ 図3）16に関連付けられていることを示す、それぞれ、看護師の蜂.......
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ディスカッション
シングルコホートコロニーの調製
ここでは、働きバチの役割の変化に関連したHPG生理学の分析のための単一のコホートのコロニーを準備するために私たちの以前の研究16で使用されるプロトコルを説明しました。手順1.6から1.7と図2に記載された基準を満たした看護師蜂と早熟飼料収穫機は、シングルコホートコロニー（ 表1）で観察されました。 図2の写真は、基準とHPG状態の分類に有用であろう。労働者の行動とHPG開発の両方に基づいた基準は、典型的なコロニーで看護師蜂や飼料収穫機を定義するための有効です。徐々に採餌への看護の役割のシフトは、これらのコロニーで進行：それは採食行動に徐々に役割シフト2の間に増加しながら、看護の行動に費やされる時間の量が徐々に低下します。したがって、排他的にその労働者を収集することは困難です唯一の行動基準によって、看護や採餌を行います。 HPGsでmrjp2とHBG3の発現は労働者の役割に関.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、文部科学省の科学研究費補助金(B)および新学術領域研究「システム分子行動学」の支援を受けました。T.U.は日本学術振興会の若手研究者のための科学研究
費補助金を受けました。....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ユニポスカ | 三菱鉛筆 | PC-5M | ミツバチ用マーカーペン |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| 繁殖ケース昆虫 | アイリス 大山 | CP-SS | |
| エレクトロモーション ミクシエ | ISO | 23M-R25 | 組織の均質化 |
| TRIZol 試薬 | Invitrogen | 15596-026 | 全 RNA 抽出用試薬 |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT試薬キット | Takara | RR037A | 逆転写試薬 |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | リアルタイムPCR用試薬 |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | リアルタイムPCR用機器 |
| LightCycle キャピラリー (20μl) | ロシュ | 4929292001 | リアルタイムPCRの材料 |
参考文献
- Wilson, E. O. The insect societies. , Harvard university press. (1971).
- Winston, M. L. The biology of the honey bee. , Harvard university press. (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zu....
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再版と許可
