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方法論記事

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

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DOI：

10.3791/54244

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2016年6月30日

 , 
1Experimental Atherosclerosis Section, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

この記事について

サマリー

マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF)分化ヒト単球由来マクロファージの細胞培養のためのプロトコールが提示されます。このプロトコルは、単球の凍結保存とマクロファージへのバルク分化を組み合わせて利用します。その後、回収したマクロファージを、実験に必要な細胞密度の培養ウェルに播種することができます。

要約

マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF)分化ヒト単球由来マクロファージの細胞培養のためのプロトコールが提示されます。実験を開始するために、新鮮または凍結した単球をフラスコでM-CSFとともに1週間培養し、マクロファージへの分化を誘導します。その後、マクロファージを回収し、実験に必要な細胞密度の培養ウェルに播種することができます。実験のためにマクロファージ培養を開始するために、定義された数の単球ではなく、定義された数のマクロファージを使用すると、目的の細胞密度をより一貫して達成できるマクロファージ培養が得られます。凍結保存された単球を使用すると、ドナーの利用可能性への依存が減り、より均質なマクロファージ培養物が作出されます。

概要

培養マクロファージの研究は、アテローム性動脈硬化性プラークで発生するような炎症におけるこれらの細胞の機能を理解するための有用なモデルです。マクロファージが関与するヒトの疾患に研究の焦点が当てられている場合、種の違いを避けるためには、ヒト以外のマクロファージではなく、ヒトの一次マクロファージを研究することが有用です。また、細胞形質転換の影響は、マクロファージ細胞株ではなく初代マクロファージを使用することで回避できます。この目的のために、ヒト血液から単離された単球から分化したマクロファージは、一次ヒトマクロファージを得る手段として役立つ。

組織マクロファージは、組織内に常在するか、または組織に移動してマクロファージ1に分化する単球に由来するかもしれません。ヒト単球由来マクロファージには、形態だけでなく遺伝子発現や細胞機能も異なる2種類のマクロファージが定義されている2。これらの2つのタイプは、M-CSF+ウシ胎児血清(FBS)の存在下でマクロファージに分化した単球と、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)+FBS2-6の存在下でマクロファージに分化した単球から得られます。我々の経験(未発表の観察)では、分化培地にM-CSFまたはGM-CSFが含まれているかどうかに関係なく、FBSではなくヒト血清を使用するとGM-CSFタイプが生成されます。M-CSF型マクロファージは、GM-CSF型マクロファージよりも細長い傾向があり、目玉焼きに似た形態をしています。研究者は、ヒト M-CSF および GM-CSF 単球由来マクロファージは、いわゆる M1 および M2 マウス骨髄由来マクロファージ 6 と同じではないことを認識する必要があります。

ヒト単球由来のM-CSF分化マクロファージを用いた研究では、実験を開始するための単球の利用可能性と、単球がマクロファージに分化する際にマクロファージの得られる細胞密度の変動に関連する困難を経験しました。これらの問題を克服するために、単球を必要になるまで凍結し、単球をバルクで分化させてマクロファージにし、それを培養フラスコから取り出して所望の細胞密度でプレーティングすることで、実験ごとにより均一な培養を得るというプロトコルを開発しました。

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プロトコル

白血球搬出は、保健機関審査委員会の国立研究所によって承認されたヒト被験体の研究プロトコルの下で行いました。

1.単離と単球の凍結保存

  1. 人間のドナーの白血球搬出によって単核細胞を得る、および参考文献7,8に記載されているように、単核細胞の連続向流遠心水簸によって単球を豊かにします。製造業者が指定する水簸バッファに- （90％単球約80）約100×10 6簸細胞を得ます。血球計数器を用いて細胞を数えます。
  2. 300×gで15ミリリットルポリプロピレンチューブで遠心分離した単球 室温で5分間。
  3. 上清を除去し、穏やかに90％FBS / 10％ジメチルスルホキシド、50×10 6細胞/ mlの最終濃度を達成するようにジメチルスルホキシド、続いFBSで細胞を再懸濁します。
  4. 細胞懸濁液tの各ミリリットルを加えます個々のクライオバイアルO。
  5. セル冷凍コンテナ内のクライオバイアルを置き、に転送-80℃のフリーザー24時間長期保存のために液体窒素クライオバイアル貯蔵タンクに移す前に。

単球からマクロファージへの2分化

  1. すぐに37℃の水浴に移し、細胞懸濁液は、約70％を解凍したときにすぐに除去することによって細胞のクライ​​オバイアルを解凍します。
  2. すぐに室温で完全に融解時、37の50ミリリットルに1ミリリットルをクライオバイアル内容を転送°Cは、2 mMのL-グルタミン、50 ngの/ mlのM-CSF、25 ngの/ mlのロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地を温めインターロイキン10（IL-10）、及び10％FBS（完全培地）。
  3. 移送2 75cm 2のプラスチック製の細胞培養フラスコのそれぞれへの単球の懸濁液を25ml。
  4. 48時間、5％CO 2/95％空気で37℃で細胞培養インキュベーター中で培養物をインキュベートします。
  5. 立方をすすぎますRPMI 1640培地を穏やかに任意の緩く付着した細胞を取り除く回避するために、培養培地を除去し、（37℃に予め温めておいた）mlの10でltures 3回。
  6. 単球が分化し、コンフルエントになるまで十分に増殖するまで2日毎に培地を交換し、新鮮な完全培地を追加し、すすぎに続いて。これは文化の約1週間が必要です。

3.収穫マクロファージ実験を開始します

  1. 10mlのフラスコ中で3回分化マクロファージリンス予め温めた37℃の0.25％トリプシン-エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液10 mlで添加する前に、Ca 2+及びMg 2+ を含まない37℃のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水を予熱しました。
  2. マクロファージの約90％は四捨五入と切り離されている必要があり、その時点で15分 - 10のための細胞培養インキュベーターにフラスコを置きます。フラスコの顕微鏡検査することによってこれを確認してください。
  3. 10％FBSを含むRMPI 1640培地10 mlのSへの追加トップトリプシン処理。
  4. 5分間の遠心分離器、50ミリリットルのポリプロピレンチューブにフラスコから300×gでのマクロファージ細胞懸濁液を移し、上清を捨てます。
  5. 静かに完全培地の1ミリリットル中にマクロファージを再懸濁します。
  6. 10μlのトリパンブルー溶液を用いてマクロファージ細胞懸濁液10μlを混合し、血球計数器を使用して、マクロファージ細胞数および生存率（典型的には> 95％）を決定します。
  7. 細胞数に基づいて、（通常は約15から18×10 5マクロファージ）、目的の播種細胞密度を達成するために追加の完全培地を追加します。注：12ウェルプレートのウェル当たり1.5ミリリットル培地中で1×10 5マクロファージを、近コンフルエント文化を生成します。
  8. 播種後、細胞の付着を可能にするために、5％CO 2/95％空気で37℃で細胞培養インキュベーターで一晩マクロファージインキュベートします。次に、目的の実験を開始します。

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結果

トリパンブルー染色9で決定されるような新鮮または凍結保存した単球の生存率は95％以上であった。 図 1および図2は 、それぞれ、より低いおよびより高い倍率でマクロファージへ新鮮で凍結保存した（ すなわち 、冷凍）単球分化の進行状況を比較します。凍結保存した単球と比較して、新鮮なが広がっていないが、丸みを帯びたまま、単球を区別するの亜集団を示していることに注意してください。フェーズ・ルーセント空胞は、両方の条件で単球由来のマクロファージで起こります。以前に10,11を説明したように、これらの小胞は、M-CSF型マクロファージのマクロピノソーム特性を表します。

彼らは、単球から分化されたフラスコからの彼らの収穫後の凍結保存マクロファージは（成功したマクロファージ培養物を生成しませんでした

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ディスカッション

定義されたマクロファージの種類を生成することは、マクロファージの生物学を研究する研究者によって得られた相反する結果のいくつかを明確にすることができます。初代ヒトマクロファージを生成するために、さまざまな培養条件および分化因子の使用は、非常に異なるマクロファージタイプに研究者によって理解されなくてもよいことを導くことができます。例えば、マクロファージは、時には何血清、単独でヒト血清、FBS単独でM-CSF、またはM-CSFまたはGM-CSFを含むFBSを補充したヒト血清を使用していないヒト単球から生成されます。以前、我々はまた、観察しているように報告したように、単球が追加された分化せずに、無血清またはFBSで一週間培養した要因は、生存3残りません。上記のように、単球を単独で、ヒト血清とともに培養またはFBSを加えたGM-CSFを用いて分化した単球の「目玉焼き」形態の特性を示すマクロファージを生成するM-CSFを補充しました。このように、ヒト血清M-の存在下で、単球は、M-CSFと区別されているにもかかわらず、より細長い形態を示すCSF型マクロファージが得られません。

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

国立衛生研究所臨床センター輸血医学部門は、溶出物を用いた単球を提供しました。この研究は、国立衛生研究所の国立心臓・肺・血液研究所の学内研究プログラムの支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Cellbind 12ウェル培養プレートCorning3336
CELLSTAR、T-75フラスコ、組織培養処理Greiner Bio-One North America658157
RPMI 1640 培地Cellgro Mediatech15-040-CM37°C;C
L-グルタミンセルグロ メディアテック25-005-CI
ウシ胎児血清ギブコ16000-036
M-CSFペプロテック300-25
GM-CSFペプロテック300-03
IL-10 PeproTech200-10
DMSOSigmaD2650
クライオバイアル サーモサイエンティフィック 
Ca2+およびMg2+ コーニングセルグロ21-031-CV
0.25%トリプシン-EDTA Gibco25200-056
50 ml ポリプロピレン円錐管Falcon352070
Trypan BlueLonza17-942E
Neubauer-improved bright light hemocytometerPaul Marienfeld GmbH & Co. KG610031http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX cell freezingコンテナBioCisionBCS-405他の凍結容器も このステップに適切であるべきです
液体窒素貯蔵システム、CryoPlus 1Thermo Scientific 7400任意の液体窒素タンクで十分であるべきです
375418

参考文献

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