方法論記事

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

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DOI：

10.3791/54255

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2016年8月12日

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1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University

この記事について

サマリー

単球は、活性化時に解糖代謝に依存する人間の自然免疫系の不可欠な構成要素です。新鮮な全血中の全単球および単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現とグルコース取り込みを測定するためのフローサイトメトリープロトコルについて説明します。

要約

単球は、特定の慢性炎症性疾患に関連する病原体および炎症によって活性化することができる自然免疫細胞です。単球の活性化は、エフェクター機能と増加したグルコース輸送体発現によって達成される解糖代謝への酸化から付随シフトを誘導します。この増加した解糖代謝はまた、訓練を受けた単球の免疫、先天性免疫記憶の形態で観察されます。単球によるグルコーストランスポーターの発現とグルコース取り込みを調べるインビトロプロトコルが記載されているが、いずれも全血マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって検討されていません。 （中間体（CD14 ++ CD16 +）および非古典-私たちは、総単球および古典（CD14 ++ CD16）によって全血における蛍光グルコースアナログ2-NBDGの取り込みを測定するためのマルチパラメトリックフローサイトメトリープロトコルを記述しますCD14 + CD16 ++）、単球亜集団。この方法は、恒常性および炎症性疾患の間の総単球及び単球亜集団のためのグルコーストランスポーターの発現及びグルコース取り込みを調べるために使用することができ、容易に血液中の他の白血球および白血球亜集団のためのグルコース取り込みを調べるために改変することができます。

概要

単球は、急速に感染し、炎症1の部位に動員されている人間の自然免疫系の主要な構成要素です。単球の活性化は、病原体による急性の損傷を制限するために重要であり、また、アテローム性動脈硬化症2、癌3、およびHIV 4,5を含むいくつかの慢性疾患の病因の中心です。

休止および活性化単球の代謝は休止単球は、解糖代謝（乳酸へのグルコースの、すなわち 、発酵）を利用した酸化的代謝および活性化単球を利用することで、劇的に異なる6。単球の活性化は、解糖系代謝7増加したグルコース取り込みを可能にするグルコース輸送体の発現を誘導します。単球のグルコーストランスポーター1（GLUT1）は、活性化の間にアップレギュレートさそのような輸送体であり、その発現は、Vにおける前炎症性サイトカインの産生をもたらすことが示されていますITROと肥満マウス8の脂肪組織インチカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスによって単球細胞株の感染はGLUT1 9の細胞のアップレギュレーションにつながる、と私たちは最近、慢性HIV感染の間にGLUT1を発現する単球の増加割合が未処理と併用抗レトロウイルス療法で処置した感染の10の間に存在していることを示しました。まとめると、これらの研究は、単球によるグルコース取り込み及び解糖代謝は、多くの炎症性疾患の重要な側面であることを示しています。従って、簡単な方法は、恒常性中単球GLUT1発現およびグルコース取り込みを測定し、炎症性疾患は、研究者の幅広い使用の可能性が高いです。

ヒト単球は、細胞表面マーカーCD14及びCD16 11,12の発現差によって調べることができる3つの別個のサブセットで構成され、不均一です。クラシック単球は、CD14の高いレベルを発現するが、CDを発現しません16（CD14 ++ CD16 - ）、中間の単球は、CD14の高レベルおよびCD16（CD14 ++ CD16 +）の中間レベルを発現し、非古典的単球は、CD14の低レベルとCD16の高レベル（CD14を発現し+ CD16 ++）。 CD16を発現する単球は、CD16に比べCD16 +単球を、と呼ばれる-単球は、高い炎症性サイトカインの発現とをより効果的に存在する抗原13,14能力を持っています。単球の約10％は、炎症15の間に観察されたより高い割合との恒常性の間にCD16を発現します。単球の亜集団は、特定の疾患状態と関連していると、病気や疾患の進行16の有用な生物学的マーカーである可能性があります。

私たちの目標は、PHYに近い条件でのヒト単球と単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現とグルコースの取り込みを測定することができる方法を同定することでしたできるだけsiological条件。これらの方法は、生理学的条件19に比べてタンパク質の発現が変化していることができ、単離された単球を検討しても以前の研究では、単球のグルコース輸送体の発現とグルコースの取り込み17,18を測定し、以前の研究では、ヒト単球亜集団を検討していません。フローサイトメトリーのマルチパラメトリックフローを使用して、我々は全体の未操作の血の中に（CD14およびCD16の発現に基づく）総単球及び単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現と蛍光グルコースアナログ2-NBDGの取り込みを調べるための方法を説明します。

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プロトコル

注：HIV感染およびHIV非感染被験者は、メルボルンのアルフレッド病院で感染症のユニットから募集した、VIC、オーストラリア、そして地域社会から、それぞれ。インフォームドコンセントは、全ての参加者から入手した、と研究はアルフレッド病院研究倫理委員会によって承認されました。

単球及び単球亜集団1. GLUT1細胞表面検出

  1. クエン酸ACD-B抗凝固剤チューブに血液を収集し、収集の1時間以内に生物学的安全キャビネット内で実験を開始します。
  2. ポリプロピレンチューブに血液の100μLを加えます。氷の上で、ピペッティングを穏やかに混合する一方でソリューションを溶解1×2 mlを加え、チューブに（ 材料表を参照してください）。氷上で15分間インキュベートします。 5分間、220×gで遠心分離します。
  3. デカントし、約2〜4ミリリットルの洗浄溶液（1×PBS中0.5％BSA）のを添加し、5分間220×gで遠心分離することによって、二回洗います。
  4. パイプを使用してください慎重にできるだけ洗浄液の限りを削除します。場所チューブは氷の上に洗浄溶液100μlに再懸濁します。
  5. 5μlの抗CD3-PE、5μlの抗CD14-APC、5μlの抗CD16-PECy7、5μlのGLUT1：特定の単球の亜集団は、ステップ1.4で調製した100μlの細胞懸濁液あたりの抗体の以下の容量で細胞を染色同定するために、 -FITCまたはIgG2bの-FITC（アイソタイプコントロールチューブ）。
  6. 暗所で30分間氷上に置きます。洗浄溶液で2回洗浄します。 1×PBSで行われた0.5％ホルムアルデヒドの200から300μlの修正。
  7. FITC（488、530）、PE（488、575）、PECy7（488、780）、APC（633、660）10：以下、励起および発光波長内に24時間以内に4色を検出することが可能なフローサイトメーターで分析します。

単球2.グルコース取り込み

  1. ポリプロピレンチューブにステップ1.1で採取した血液のピペットを90μl。 14.60μM2-NBDGワーキング溶液10μlに追加血液90μlの（1.46 mMの最終濃度）と混合するために穏やかにフリック。アルミホイルでチューブを被覆することにより光2- NBDGの露出を制限することが重要です。
  2. 15〜30分間、暗所で37℃でインキュベートし、その後直ちに氷上に置きます。氷の上ながら、チューブへの解決策を溶解1X FACSの4ミリリットルを追加します。 4で220×gで遠心分離 5分間°C。
  3. 洗浄溶液4ml（1×PBS中0.5％BSA）を添加することにより1回洗浄。 4で220×gで遠心分離 5分間°C。デカントし、氷の上の場所。
  4. 抗体を用いた染色細胞：5μlの抗CD3-PE、5μlの抗CD14-APCおよび5μlの抗CD16-PECy7。混合し、暗所で30分間氷上に置きます。
    注：この期間中は、フローサイトメーターは、即時分析のための準備ができていることを確認してください。以下の励起および発光波長内の細胞を買収：2-NBDG（488、530）、PE（488、575）、PECy7（488、780）、APC（633、660）。
  5. チューブに氷冷洗浄緩衝液（1×PBS中0.5％BSA）の4ミリリットルを追加します。4で220×gで遠心分離することによって1回洗浄 5分間°C。デカントし、氷古いPBSの200から300μlを添加し、暗所で氷（アルミ箔で覆われた）に保ちます。ステップ2.4​​のように励起および発光波長設定を使用して10分以内にフローサイトメーターで分析します。

3.データ収集と分析

注：フローサイトメトリーデータ分析の知識が仮定されます。

  1. 染色されていない個別染色したサンプルを使用して補正を設定し、少なくとも4色の分析が可能なフローサイトメーターを使用して。
    注：FITC標識CD4及びCD14を使用して単一の染色はGLUT1及び2-NBDGの補償のために使用することができます。
  2. 設定し、サンプルを取得する前に、適切なウィンドウにラベルを付けます。単球集団の周りにゲートを描き、中速度でサンプル100,000 300,000イベントを取得します。補償サンプルあたり50,000イベントで十分です。
    注：補正前の試料に行ってもよいです標準的な手順に従って取得又は単一細胞解析ソフトウェアで、。
  3. 適切な場所にデータをエクスポートし、保存します。指定されたように、単一のそのようなFlowJoソフトや他の解析ソフトウェアなどの細胞解析ソフトウェア（ 補足図1）とドラッグ＆ドロップのサンプルを開きます（ 補足図2）。
  4. ファイルを開くにはダブルクリックして（ 補足図3）。 図1Aおよび補足図4に示すように、ゲート順に基づいて、単球および側方散乱特性をに円を描く。単球集団をダブルクリックします。 CD3の周りにボックスを確認し、描く-人口（ 補足図4）。
  5. ダブルCD3をクリックします-人口を。単球亜集団を観察するには、 'X'軸上のCD14-APCを選択し、CD16-PECy7 'Y'軸上、及び（ 補足図5）に応じてラベルを付けます。
  6. 明確な存在しない場合には正と負の集団は、特定の単球亜集団におけるGLUT1の発現または2-NBDGの取り込みを測定します。アイソタイプなし2-NBDGの背景（ 補足図6）を引いGLUT1と2-NBDGの平均蛍光強度（MFI）を決定します。
  7. ここで定義された集団は、ゲートを設定し、パーセント陽性細胞（ 図3）を決定するためのIgG2b-FITCを使用し、存在します。
    注：総CD14 +単球を分析するために、この手順を使用します。 2-NBDGの取り込みは、通常、蛍光のシフトによってマークされているので、データは最高のMFIとヒストグラムで表される強度。

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結果

補償は、蛍光波及を防ぐために、個々の蛍光色素のために実行する必要があります。単球は、最初の前方および側方散乱に基づいてゲートすることによって濃縮されます。以前に10を報告したように提示したプロットは、6人以上の参加者からの全血で行われ、少なくとも6つの独立した実験の代表で、図1Aは、CD3以内ゲーティングによるT細胞の細胞散乱及び排除による単球の初期ゲーティング示している- 。人口。単球は、次いで、 図1B及び図1Cに示すように、それぞれ、総単球又は単球亜集団を同定するために、単独で、またはCD16と組み合わせて、CD14発現についてゲートされます。約100倍高いCDを表現しなければならない-古典的な単球（CD14 ++ CD16）：前回12に記載されているように 、単球亜集団の分析のために、次の命名法が適用されるべきで...

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ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、全血における単球及び単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現と蛍光グルコースアナログの取り込みを調べるための簡単​​な方法を詳しく説明します。全血中の2-NBDG取り込みを評価することにより、この技術は、 インビボでのものと同様の条件を可能にします。以前の研究では、密度遠心分離17によって、全血から分離した単球で6-NBDGの取り込みを調べました。しかし、この研究は、単球の亜集団を検査せず、全血からの単球の分離は、潜在的に、特定の細胞表面分子19の発現を変化させることができます。重要な安全措置を必要とする放射性グルコースのトレーサーは、グルコース20,21の単球の取り込みを測定するために使用されてきたが、単球は、以前に放射能のこの方法と使用のために分離する必要があります。私たちのプロトコルは、日常バイオセーフティ手順を使用するため、2-NBDGのフローサイトメトリー測定を可能にする、最小限の操作的です生体内条件で模倣単球および単球の亜集団による取り込み。

2-N...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、サポートされている賞番号AI027757の下エイズ研究のためのワシントン大学のセンター（CFAR）、NIH資 ​​金提供プログラムからHIVや肝炎ウイルス学研究（ACH 2）オーストラリアセンター、2010発達グラント（CNIHR）によって賄われていました以下のNIH研究所およびセンター（NIAID、NCI、NIMH、NIDA、NICHD、NHLBI、NIA）によります。 CSPはCNIHRとACH 2助成金の受取人です。 SMCは、オーストラリア国立保健医療研究評議会（NHMRC）主な研究フェローシップの受領者です。作者は感謝しバーネット研究所によって受信されたビクトリア朝の運用インフラ支援プログラムのこの作業への貢献を認めます。私たちは訓練と技術的なアドバイス、フローサイトメトリーのためのAMREPフローサイトメトリーコアファシリティから下座PaukovicとエヴァOrlowski - オリバーの支援を認めます。私たちは、メディアのコーチングやビデオ撮影の組織のためのアンガス・モーガンに感謝します。私たちの感謝の気持ちジェシーマッソンとジハード・アブドゥルアジーズK. Alzahraniにビデオ撮影時のラボの支援のために。我々は重要な方法論的なアドバイスを提供した医学研究科で博士デビッドSimar、UNSW、オーストラリアの努力に感謝します。 CSPは感謝したいと思いwww.nice-consultants.comをグラフィック協議するため。

レビューアの貢献：

CSPは、設計と実験を行い、分析し、データを解釈し、プロジェクトを考案し、原稿を書きました。 JJAは、データを解釈し、原稿を書きました。 TRBは、原稿を書きました。 JMMは、データを解釈し、重要な知的な提案を行い、原稿をレビューしました。 SMCは、データを解釈し、重要な知的提案を行い、原稿をレビューしました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
VACUETT チューブ 9 ml ACD-B 抗凝固チューブGreiner Bio-One GmbH455094
5 ml 滅菌ポリプロピレンチューブBD Biosciences352063
牛血清からのアルブミン (BSA)Sigma-AldrichA7906
16% ホルムアルデヒド溶液電子顕微鏡 Science15710
BD FACS 溶解液 (10x)BDBiosciences349202BD FACS溶解液1/10を脱イオン水で希釈し、作業濃縮を行います(4°Cで最大1週間保存してください。C)
抗CD3-PEBD Biosciences555340
抗CD14-APCBD Biosciences555399
抗CD16-PECy7BD Biosciences557744
anti-Glut1-FITCR &DシステムズFAB1418F
IgG2b-FITCR &D SystemsIC0041F
2-NBDGLife technologiesN13195mg の 2-NBDG を 1 ml の脱イオン水に懸濁して 14.60 mM のストック溶液を作ります (4 °C で最大 6 か月間保持します。2-NBDG濃度を機能させるには、ストックを1x DPBSで1/100に希釈します。ホイルで覆います。(4°Cで最大1週間保管します。C)
ダルベッコS Phosphate Buffered Saline (1x)Life technologies14190-144洗浄液を作るには、100 ml DPBSあたり0.5 g BSAを追加します(4°Cで最大2週間保存してください。C)
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参考文献

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2 NBDGCD14 CD16HIV

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