ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

サマリー

私たちは、保存可能な、可搬型の脂質二重層形成システムを実証します。凍結した膜前駆体を周囲温度にしたときに脂質二重膜は、80％以上の成功率で1時間以内に形成することができます。このシステムは、イオンチャンネルに関連した面倒なプロセスと専門知識を軽減します。

要約

人工脂質二重層、または黒色脂質膜（BLM）は、イオンチャネルおよびタンパク質相互作用を研究するため、ならびにバイオセンサー用途のための強力なツールです。しかし、従来のBLM形成技術は、いくつかの欠点を持っており、彼らはしばしば、特定の専門知識と手間のかかるプロセスを必要とします。具体的には、従来のBLMsは低形成の成功率と一貫性のない膜形成時間に苦しみます。ここでは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）に、従来から使用されるフ​​ィルム（ポリテトラフルオロエチレン、ポリオキシメチレン、ポリスチレン）を交換することによって制御間引き時間と強化されたBLM形成速度で貯蔵可能と搬型BLM形成システムを実証します。この実験では、このようなPDMS薄膜として多孔構造ポリマーが使用されます。また、低粘度で、従来から使用される溶媒とは対照的に、スクアレンの使用は、膜の寿命を延長する、PDMSによって遅く溶媒吸収を介して制御間引き時間を可能にしました。広告でditionは、スクアレン及びヘキサデカンの混合物を使用して、脂質溶液の凝固点は、無期限に保存され、容易に輸送することができ、膜前駆体を作製した。加えて、（〜16℃）に上昇させました。これらの膜前駆体は、<1時間のBLM形成時間を減少させ、〜80％のBLM形成速度を達成しています。また、グラミシジンAとイオンチャンネル実験は、膜システムの実現可能性を実証しました。

概要

人工脂質二重膜、または黒色脂質膜（BLM）、細胞膜、およびイオンチャネルのメカニズムを解明するため、ならびにイオンチャネル及びイオン/分子間の相互作用を理解するための重要なツールである。パッチクランプ法が^、1-7多くの場合、細胞膜の研究のためのゴールドスタンダードとみなされ、それは面倒であり、イオンチャネル測定のための高度に熟練したオペレータを必要とする^。8人工的に再構成された脂質二分子膜は、イオンチャネルの研究のための代替的なツールとして浮上してきたが^、9,10、それらも面倒に関連付けられていますプロセスおよび特定の専門知識。さらに、膜は機械的な摂動の影響を受けやすいです。したがって、これまでに導入された脂質二重層の技術は、実際の用途が限られている^。11

脂質二重膜の堅牢性と寿命を向上させるために、コステロら ^12、およびIDEと柳田 ^{13は、ヒドロゲルでサポートされている自立型脂質二重層を考案しました。しかし、強化された長寿にもかかわらず（<24時間）、二層堅牢性が改善されませんでした。チョンら 14は、（数日まで）強化された寿命で、その結果、親密なヒドロゲル脂質二重層の接触でハイドロゲルカプセル化された膜（HEM）を考案しました。さらにHEMの寿命を向上させるために、Malmstadtとチョンらは、ヒドロゲル脂質が両方のシステムではその場で共有結合（cgHEM）。15を介して結合を持つハイドロゲルカプセル化膜を作成し、膜の寿命が大幅に増加した（> 10日） 。しかし、膜形成システムが十分に強固ではなかった、と脂質二重層の使用のための専門知識を解放するために必要な場合保存したり、配信することができませんでした。}

脂質二重層プラットフォームの開発は、主に増加堅牢性とBLMsの寿命を中心に展開しています。 BLMsの寿命は、suコマンドであったがbstantially最近強化され、そのアプリケーションが原因で輸送及び保存性の欠如に限られていました。これらの問題を克服するために、チョンら貯蔵可能な膜システムを作成し、MPを構築するために、膜前駆体^{（MP）16を}導入^し 、それらを3％DPhPC（1,2- diphytanoyl-を含むN-デカン、ヘキサデカンの混合物を調製し錫 -glycero -3-ホスファチジルコリン）は、〜14℃（室温下、典型的な冷蔵温度以上）で凍結なるように、脂質溶液の凝固点を制御します。この実験では、MPは、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）膜の小さな開口部に広がるし、続いて4℃で冷蔵庫に凍結しました。 MPを室温にしたときに、MPを解凍し、脂質二重層を自動的に形成し、典型的には膜形成に関連する専門知識を排除します。しかし、MPから作られたBLMの成功率は、〜27％と低く、膜構成体nは時間がその実用的なアプリケーションを制限する、（24時間まで30分）矛盾していました。

以前にリュによって報告されたように、本研究では、ポリジメチルシロキサン（PDMS）薄膜の代わりに（A）コントロール製造時間及び（b）BLM形成の成功率を高めるために、従来の疎水性薄膜（PTFE、ポリオキシメチレン、ポリスチレン）で使用されら ¹⁷ここで、膜形成は、PDMSの多孔性の性質に起因する溶媒抽出によって促進された、膜形成に要する時間が正常にこの研究で制御しました。脂質溶液は、PDMS薄膜中に吸収されたように、このシステムでは、一貫性のある膜形成時間が達成されました。また、膜の寿命はPDMS薄膜、脂質溶液のスクアレンの加算結果に起因する溶媒の遅い吸収を延長しました。我々は、この技術を用いて形成された膜は私に適していることを確認するために光学的及び電気的測定を実施しましたチャネルの研究に関する。

プロトコル

1.溶液の調製

1. 緩衝液の調製：
   1. 緩衝液を処方するために、蒸留水で1 MのKCl（塩化カリウム）、10mMのトリス-HCl（トリス - 塩酸塩）、及び1mMのEDTA（エチレンジアミン四酢酸）を溶解し、pHを8.0に調整します。
   2. 0.20μmのフィルターを使用してソリューションをフィルタリングします。滅菌するために、15分間121℃で溶液をオートクレーブ。
2. プレ塗装のための脂質溶液の調製：
   1. 8 のn -デカン及びヘキサデカン（V：2の混合物中：プレ絵画、3％を溶解DPhPC（1,2- diphytanoyl- のsn -glycero -3-ホスファチジルコリン）脂質（V w）のための脂質溶液を策定するために、 V）。回転子を使用して、一晩撹拌しました。
3. 膜形成のための脂質溶液の調製：
   1. 膜形成のための脂質溶液を調合するために、DPhPC 0.1％を溶解させ（1、2-diphytanoyl- SN -glycero -3-ホスファチジルコリン）（W：V）脂質：8 SQ 2の混合物でualene及びヘキサデカン（V：V）。回転子を使用して、一晩撹拌しました。

PDMS薄膜の2形成

1. PDMSプレポリマーを形成するために、混合カップ1（w / w）の比：9にPDMSと硬化剤を混合します。 （ - 厚さ250μm200）PDMS薄膜を形成するためのペトリ皿にPDMSプレポリマーの5グラムを追加します。薄膜を形成するために10秒間800rpmでスピンコーターを用いて、PDMSプレポリマーを広げます。
2. 気泡を除去するために2時間100ミリトールの圧力で真空デシケーターにペトリ皿を置きます。プレポリマー薄膜、70℃で5時間、オーブンで焼くを重合させます。
3. 正方形PDMS薄膜を作るために、2×2 cm ²の正方形に重合PDMS薄膜を切りました。 PDMS薄膜の中央に開口部を作るために500μmのマイクロパンチを使用してください。 8 のn-デカン、ヘキサデカン：2で混合し、3％DPhPCの脂質溶液による前ペイント開口。

3.チャンバーの作製とASSEmbly

1. BLM室を製造するために、4センチメートルのx 1.5センチメートル×1センチ、X 1.3センチメートルのx 0.8センチメートル¹⁷ 1.5センチメートルの内側のウェルの寸法の外形寸法と3D描画ソフトウェアを使用して、チャンバの設計2対称ブロック。
2. CNCマシンとPTFEブロックを用いてチャンバを作ると、製造元の指示に従ってください。

4.商工会議総会

1. 室を組み立てるために、2つのPTFEブロック間塗装済み-PDMS薄膜を配置するPDMS薄膜上に開口部がチャンバーの穴と一致するように。
2. （光学観察を容易にする）グリースでカバーガラスを用いてチャンバの外縁をシール。ナットとボルトを使用して組み立てられたチャンバーを固定化します。
   メモ：液漏れがないように、チャンバは、よく密封されていることを確認します。

速め自己組織形成と膜前駆体の5形成（MPES）

1. ピペットを使用して、0.5を堆積8 のn -デカン：2で混合し、0.1％DPhPC脂質μlの室で組み立てPDMS薄膜の開口部の上にヘキサデカン。
2. 使用前に、冷凍庫または10℃以下の冷蔵庫にチャンバを格納します。

6.膜形成と検証

1. MPESとBLMを形成するためには、冷蔵庫からチャンバーを撤回し、チャンバーの各側面に緩衝液2mlを一時停止します。凍結した膜前駆体が解凍されるまで、<10分間脇室を設定します。
2. 正確には、光源と顕微鏡に対する仰角を制御するためにマイクロマニピュレーターの上室を置きます。 BLM形成プロセスの光学観察用PDMS薄膜の開口部を明るくするためにハロゲン光ファイバ照明装置を用いた光源として、チャンバの一方の側を照明します。
3. 他の側では、（20によって拡大BLMの形成を観察するために、光源に対して垂直にデジタル顕微鏡を配置0X）。
4. BLMの形成を確認するために、色が弁輪よりも明るくなる開口部の中心を観察します。

7.電気的記録

1. 電気的測定のために、> 1分間の次亜塩素酸ナトリウムで208ミクロンの厚さの銀線や漂白剤を使用したAg / CL電極を準備します。十分な深室の各側面に銀/ CL電極を配置するには、緩衝液中に浸漬されます。
2. 微小電極増幅器に電極を接続します。電気生理学ソフトウェアを使用して、方形波を取得するために膜を横切って±10 mVの三角波形を適用します。 V_clamp（MV）に示されている矢印をクリックすることで、電圧を印加することに設定します。
3. 録音ボタン（赤い点のアイコン）をクリックすることにより、膜の電気的特性を記録します。均一な方形波が観察されるまで記録を続行します。黒い四角いアイコンをクリックして録音を終了します。

8.イオンチャネル設立

NOTE：GAは脂質溶液に直接添加されているようグラミシジンA（GA）の取り込みは、BLMの形成時に自然に起こります。

1. ジョージアチャネル活動を観察するために、膜の保持電位を測定するために、5 kHzでのサンプルレートで膜を横切って100 mVのに適用します。 V_clamp（MV）に示されている矢印をクリックすることで、電圧を印加することに設定します。
2. 録音ボタン（赤い点のアイコン）をクリックしてのGA取り込みの電気的特性を記録します。現在のジャンプが観察されるまで記録を続行します。黒い四角いアイコンをクリックして録音を終了します。
3. 電気的データ収集の後、電気生理学ソフトウェアを使用して100Hzでローパスベッセルフィルタでデータをフィルタリングします。
4. フィルタリング潜在的なデータを保持するには、現在のジャンプを観察したGaの取り込みを確認するために（〜0.15 NS、それぞれ現在のジャンプを、Gaイオンチャネルの二量体化を表します）。

結果

MPES液組成の最適化
脂質および溶媒の異なる組成が正常MPESの脂質二重膜を再構成するために試験しました。 DPhPC ¹⁴ 3％を含有するN-デカン、ヘキサデカンの混合物MPシステムは、膜形成（〜27％）の低い成功率を示しました。 PDMS膜を連続的に脂質溶液を抽出したように加えて、無傷の脂質二重膜を維持するために、溶媒組成を最適化する必要がありました。従って^{、20℃、18}で12センチポイズの粘度を有するスクアレンは、代わりに20℃で0.92センチポイズの粘度を有するN-デカン、を使用した^。19スクアレンが原因に増加し、安定性と寿命の両方を用いた場合PDMSによる溶媒吸収の減少率。 表1は、間引き時間、寿命、および異なる溶媒組成を有する膜の成功率を比較します。

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ディスカッション

当社のBLM形成技術は、産業用途の可能性が限られている従来の技術とは対照的に、細胞膜およびイオンチャネル研究のための強力なツールを提供します。PDMS薄膜を用いた膜前駆体を開発し、迅速な自己組織化を有する凍結膜前駆体を考案しました。

膜形成が膜と脂質溶液の間の表面相互作用によってのみ起こる疎水性フィルムによる従来の膜形成法とは対照的に、²⁰ PDMSフィルムの膜薄化は、PDMS膜による表面相互作用と溶媒抽出によって起こります。PDMSの細孔への溶媒の吸収、およびPDMS薄膜の表面に沿った溶媒の濡れにより、脂質二重層の迅速かつ一貫した形成が促進されました。また、粘度の高いスクアレンと凝固点の高いヘキサデカンを配合することで、膜形成時間を制御することができました。このシステムにより、BLM形成の成功率(<80%)を高めると同時に、膜形成時間(<40分)を短縮することができました。凝固点の高い溶媒を使用したため、膜前駆体の保管と輸送が可能でした。さらに、緩衝液を添加すると膜形成が自動的に促進されるため、高度な訓練を受けた専門知識を必要とする複雑な膜形成プロセスを排除...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化カリウム	Sigma-Aldrich	P9333	緩衝液用
トリス塩酸塩	Sigma-Aldrich	1185-53-1	緩衝液用
エチレンジアミン四酢酸	Sigma-Aldrich	60-00-4	緩衝液用
n-decane	Sigma-Aldrich	44074-U	脂質溶液用
ヘキサデカン	Sigma-Aldrich	544-76-3	脂質溶液用
スクワレン	Sigma-Aldrich	S3626	脂質溶液
用 グラミシジンA	Sigma-Aldrich	11029-61-1	膜タンパク質
1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356	membrae形成用
シルガード184aおよび184bエラストロマーキット	ダウコーニングアジア		PDMS薄膜
0.2 μm フィルター	Satorius stedim	16534----------K	濾過用緩衝液
Rotator	FinePCR	AG	脂質を均一に溶解する
オートクレーブ	バイオフリー	BF-60AC	緩衝液を滅菌する
スピンコーター	Shinu Mst	SP-60P	PDMSプレポリマーを広げる
真空デシケーター	ウェルチ	2042-22	気泡を除去するPDMSプレ
ポリマー500 μm パンチ	ハリス ユニコア	0.5	PDMS薄膜CNCマシンに開口部を作るには
	SME取引 SME	2518	膜形成チャンバーを製造するには
ハロゲン光ファイバーイルミネーター	Motic	MLC-150C	光学観察用PDMS薄膜の開口部を照らすには
デジタル顕微鏡	デジタルブルー	QX-5	脂質二重膜を光学的に観察するには形成
電極	AMシステム		膜形成を電気的に観察する
微小電極増幅器(Axopatch amplifier)	Axon Instruments	Axopatch 200B Amplifier	膜の静電容量を測定するため(原稿では微小電極増幅器として記載されています)