Method Article

球状​​エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成

DOI:

10.3791/54278

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August 13th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Bionanoscience, Delft University of Technology

In This Article

Summary

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有糸分裂紡錘体の組み立てと位置は、微小管のダイナミクス、モータータンパク質、および架橋剤によって生成される複合的な力に依存します。ここでは、球状エマルジョン液滴の幾何学的閉じ込めを基本的な有糸分裂紡錘体のボトムアップ再構成に使用する最近開発された方法を紹介します。

Abstract

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有糸分裂紡錘体の組み立て、位置、および配向は、微小管のダイナミクス、微小管モータータンパク質、および架橋剤によって生成される複合的な力に依存します。成長する微小管は押す力を発生させることができますが、解重合する微小管は、微小管の収縮からのエネルギーを、たとえば皮質のダイニンや染色体に付着したときに引っ張る力に変換できます。さらに、紡錘体内のモータータンパク質と拡散性架橋剤は、反平行微小管を結合して摺動することにより、紡錘体の構造に貢献します。In vivoでは、個々のプレーヤーが全体的な力のバランスに相対的に貢献していることを解明することは困難であることが証明されています。ここでは、基本的な有糸分裂紡錘体をin vitroでボトムアップで再構成するために最近開発した方法を紹介します。マイクロ流体技術を用いて、セントロソームとチューブリンを油中水型エマルジョン液滴に封入し、幾何学的に閉じ込められた(二重の)微小管アスターを形成します。さらに、皮質に固定されたダイニン、プラスエンド指向性微小管モーター、拡散性架橋剤を導入することにより、このシステムは紡錘状構造の再構成に使用されます。ここで紹介する方法は、より完全な有糸分裂紡錘体を再構成するための出発点を提供し、個々のコンポーネントの寄与を詳細に研究し、有糸分裂紡錘体内の力とバランスの統合的な定量的ビューを得ることができます。

Introduction

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有糸分裂の間、複製されたゲノムの染色体は新たに形成された娘細胞の上に姉妹染色分の平等な分配を確保するために、セル赤道で編成されています。染色体の位置および分離は、二つの対向の中心体から発するスピンドル微小管への結合によって媒介されます。忠実な染色体分配を確保することに加えて、有糸分裂紡錘体の配向は、細胞分裂面1を決定します 。細胞分裂の協調姿勢は、開発の多くの段階中および組織の恒常性2に必須です。具体的には、規制紡錘体の位置は、細胞内容の非対称分布が生じ、あるいは異なるサイズ2の娘細胞を生成することができます。紡錘体アセンブリおよび向きは、前期に開始し、協力し力発電機3,4に拮抗するとの間の複雑な相互作用によって編成されています。発生する力は、Bから構成されOTH引っ張り、押す力。これらの力は、細胞の皮質とスピンドルの連絡先からだけでなく、スピンドル内の両方から発信され、微小管ダイナミクスによってだけでなく、分子モーターとクロスリンカー（ 図1）によって生成することができます。

微小管は、細胞皮質のような剛性の構造に対して成長時押圧力を発生させることができます。システム内で発生する総抵抗力に応じて、これは、有糸分裂紡錘体（低力）の再配置をもたらすか、微小管の座屈や大惨事（強い力）5-8をトリガすることができます 。長さは、微小管座屈9の強力な決定因子であるので、押すことによって発生させることができる力の量は、微小管の長さに依存します。さらに、1つの中心体に由来微小管は、他の中心体に対して早期前期3,10に中心体分離を駆動するために提案された機構を押すことができます。

広告で成長している微小管によって発生した力を押す、微小管が接触し末端細胞表層へのditionも力11を引っ張っ媒介することができます。複数の研究室からの研究は、皮質力発電機の制御された活性は、インビボ 1 で紡錘体の非対称の位置決めのために必要であることを示しています。これらの引っ張り力にエッセンシャル（以下「ダイニン」という）皮質局在細胞質ダイニン、マイナスエンド向かう微小管モーター蛋白質8,12,13です。例えば、酵母、皮質14に沿ってスライドモーター依存微小管における微小管の格子結果に皮質ダイニンの横方向の相互作用を出芽インチしかし、皮質引っ張り力はまた、微小管8を解重合する末端にアタッチメントを形成するダイニンの機能によって生成することができます。微小管収縮によって発生するエネルギーは、一般的により高い一桁力につながる可能性があり（〜50 PN（15を参照16））によって生成される力より））>アップ。脱重合微小管への皮質ダイニンのエンド上の結合は出芽酵母17およびCで主軸の位置決めを促進しますエレガンス 13。モーター依存スライドおよび微小管脱重合駆動の両方皮質引っ張る力が協力またはin vivoで相互に排他的であることができるかどうかを現在不明です。

微小管押圧力とダイニン媒介皮質引っ張り力に加えて、中心体の位置決めは、多くの他のタンパク質によって有糸分裂紡錘体の中から制御されます。キネシン-5モータは、例えば、外側にスライド力18-20の生成をもたらす、逆平行極間微小管を架橋することができる四量体として存在します。キネシン-5モーターファミリーのメンバーは、Cの例外を除いて、研究した全ての真核生物における中心体分離およびバイポーラスピンドルアセンブリのために必要とされますエレガンス （参照21に概説されています）。

また、ASE1 / PRC1ファミリーの拡散性架橋剤はまた、 インビボおよびインビトロ 22-27 に極間微小管の微小管重複領域に局在することが知られています。重複微小管領域のASE1主導の展開によって発生する力は、in vitro 28,29 にキネシン-14媒介スライディング力を相殺するのに十分な大きさです。細胞では、ASE1 / PRC1は、スピンドル中間帯25-27,30で微小管の重複領域を拡散性架橋剤によって発生する力が大幅にスピンドル組織に貢献できることを示唆しているの安定形成に必要です。最後に、有糸分裂クロマチンからの力および動原体は、種々の経路3を介して紡錘体のアセンブリおよび位置決めに影響を与えます。これらのコンポーネントは、ここで説明する再構成アッセイの一部ではないので、詳細には説明しません。

jove_content ">別の理論は、異なる分子成分と力がスピンドルアセンブリと位置決めに協力、私たちはまだ遠い定量的理解からである上記の方法に存在する。生細胞での実験に加えて、精製された成分を用いたin vitroの実験の強力なを提供しますこの目標を達成するのに役立つルート。ここでは、最近公開された方法（ロスら 31）の適応と拡張版の視覚ガイドを提示し、基本的なスピンドルが始まる、油中水型エマルジ ​​ョン液滴中で再構成されていますマイクロ流体技術を使用してコンポーネントの最小数は、球状液滴が分裂細胞に匹敵するサイズで生成される。これらの液滴内で、精製された中心体およびチューブリンは、微小管アスター動態を研究発生及びアスター・アスター相互作用を強制するために組み合わせることができる。で皮質（例えば、ダイニンなど）およびインター極性（例えば、キネシン5 / ASE1）力発電機を導入し、我々in vivoの状況に似ていると起動し、ますます複雑紡錘状の構造を再構成します。

Protocol

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マイクロ流体チップの作製

注：スピンドルアセンブリのボトムアップ研究のために、球状の油中水型エマルジョン液滴が使用されます。これらは、リン脂質と界面活性剤の単層によって周囲の油相から分離し、水性微小液滴です。これらのエマルジョンの液滴は、マイクロ流体、ポリジメチルシロキサン（PDMS）チップ内で生成されます。チャネルの形状および流量の変化は、調整液滴サイズに使用することができます。ここで説明するマイクロ流体設計では、液滴は、哺乳類の有糸分裂細胞の幾何学的な閉じ込めを模倣するために約15μm​​の直径で生成されます。

  1. フォトマスクの設計・金型製作
    1. 3の入口チャネル31を含むフォトマスクを設計します。入口チャネル1は、（「基本的な微小管アスターを再構成する」のセクション3を参照）、液滴の内容が含まれている水相に接続します。入口チャネル2は、油相（see節2.1「脂質/油-PHAに接続しますSEの準備」）。観察（オプション）（ 図2a-bの前に追加の脂質/油相とのエマルジ ​​ョン液滴を希釈するために導入路3を使用してください）。
      注：すべての入口チャネルがトラップほこり、PDMS粒子と（タンパク質）の凝集体に防塵フィルタ（2ミクロンのチャネルの迷路）が続いているとマイクロ流体チャネル（ 図2d）を遮断するからそれらを防ぐために。チャンネルは、75ミクロン幅で、乳化液滴が（ 図2c）を形成する12.5ミクロン幅の広い接合部の脂質/油相と水相出会います。
    2. 負極性で（フォトマスクが透明に設計された構造と暗くなる）、注文し、フィルム基板上に印刷されたフォトマスクを得ます。
  2. 金型製作
    1. クリーンルーム環境でスピンコーター（1800rpmで続いて500rpm、10秒、45秒）を使用して、4インチのシリコンウェハ上にスピンコートSU-8 3025フォトレジストで金型を製作してください。
    2. SU-8コーティングされたを公開フォトマスクを介してシリコンウェハ。 〜40ミクロ​​ンの厚さのチャネルを作成するには、製造元の指示に従ってウェーハを開発します。
  3. マイクロ流体チップを作ります
    1. プラスチック製のスパチュラを用いてボート型容器に1部硬化剤（合計〜40グラム）と10部のPDMSプレポリマーを混ぜます。約30分間の真空チャンバ内のボート状容器を含む場所PDMS。気泡を除去します。エッジを直立〜1センチメートルとのカップを形成する金型の周りにアルミホイルを包みます。
    2. 金型にPDMS（全容積の〜75％）を注ぎ、別〜30分間、真空チャンバー内に残します。 （気泡を除去するため）、オーブン中で100℃で1時間硬化させます。
    3. スピンコート100℃で1時間硬化させたガラススライド上に残ったPDMS（4,000 rpmで30秒間、続いて200rpmで5秒）。圧縮空気/ N 2 -flowは、前洗浄を必要としない使用してガラススライドからほこりを取り除きます。
      注：PDMS被覆したガラススライドを、両方のマイクのために使用することができますrofluidicチップおよびフローセル生産（また、2.2を参照のこと）。
    4. 軽く数秒間の実験室コロナ表面処理機を使用して.Corona-治療マイクロ流体チップ及びPDMSコーティングされたガラススライド（インレット用0.5ミリメートル、コンセントの0.75ミリメートル）カミソリの刃を用いて、金型のオフにPDMSを除去し、穴を開け。
    5. スライドガラス（下に向けチャンネル）上にマイクロ流体チップを置き、O / N 100°C（ 図3a）でチップを焼きます。ほこりのない環境で、数ヶ月のためのマイクロ流体チップを保管してください。

2.マイクロ流体セットアップ

注：油中水型エマルション滴がマイクロ流体セットアップ、上述のマイクロ流体チップを使用して生成されます。脂質/油相の組成は、実験条件に応じて変化させることができます。油溶化脂質は、内部に水に面し、その極性頭部基を有する水 - 油界面で単分子層を形成します。タンパク質を標的化するために（ 例えばダイニン）液滴境界に、ビオチニルホスファチジルエタノールアミン（ビオチニル-PE）脂質の低量を追加することができます。これは、ストレプトアビジン媒介多量体を経由して（セクション4.1「液滴皮質へのターゲティングダイニン」を参照）、ビオチン化ダイニンの動員を可能にします。液滴は界面活性剤を添加することによって安定化し、PDMSコーティングされたフロー・セルに格納されています。

  1. 脂質/油相の調製
    1. （広く前クロロホルムピペットをリンスガラスピペットを用いてガラス管中：1のモル比4でクロロホルムに溶解し、1,2- dioleoyl- SN-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン（DOPS）およびビオチニル-PE脂質を混合つかいます）。 〜0.5 mg / mlでの脂質濃度で、その結果、〜250μgの脂質の合計を準備します。
    2. 注意深くN 2 -flowて脂質混合物を乾燥し、続いて約1時間、真空チャンバです。 0.5mg / mlの（〜500μLを加える）に鉱油と2.5％界面活性剤中で乾燥した脂質を溶解します。
    3. 中の脂質/油試料を置き、超音波浴で30分間超音波処理。 40 kHzで完全に脂質を溶解します。
  2. フローセルの準備
    1. スピンコートPDMSカバーガラスの上に（4000 rpmで30秒間、続いて200rpmで5秒）（また、セクション1.3を参照）、ガラススライド均質な層を堆積させるために（30秒間1500rpmで、続いて100rpmで5秒） PDMSの。
      注：最適な撮像品質を得るには、顕微鏡の対物レンズと一致​​する厚さでカバーガラスを使用してください。この場合：1.5（〜0.17ミリメートル）。
    2. オーブン中で100℃で1時間、PDMSコーティングされたカバーガラスとスライドガラスを治します。密接に間隔によってフローセルを作る（〜2ミリメートル）実験用封止膜の薄いスライス（〜幅3mm）PDMSコーティングされたガラススライド上。埃のない環境で保存した場合、使用されていないチャネルは、他の時間に使用することができます。
    3. 〜1分実験用封止膜を溶融することにより、PDMSコーティングされたカバーガラスとシールでフローセルをカバー。 100℃で、プレス優しく（ 図3c）。 Valap（ 図3c）で実験用封止膜-ガラス-境界を閉じます。ほこりのない環境での数ヶ月のためのストアフローセル。
  3. PDMSカップの準備
    1. 長期的なイメージングのために、PDMSのスライス（〜3mm厚）で直径4mmの穴を打ち抜いて、PDMSカップを作ります
    2. PDMSスライスとPDMSコーティングされたカバーガラスをコロナ処理し、互いの上にそれらを配置。 O / N（100℃で）PDMSカップ（ 図5a）焼きます。
  4. エマルジョン液滴の形成
    1. 倒立明視野顕微鏡での液滴形成を監視します。 （ 図3a）：PEEKチューブ（510ミクロン（外側）と125ミクロン（内側）直径）を使用して、マイクロ流体チップに圧力コントローラを接続します。入口2からの脂質/油相で完全にマイクロ流体チップを埋めます。
    2. MRB80ベースの水相を導入（セクション3「再構成する基本的な微小管アスターを参照してください。4;）入口1.コントロール滴サイズから直径（ 図3b）で〜15ミクロンの液滴を作成するには、脂質/油相と水相の圧力を変化させることでは。
      注：この設定を使用して、所望のサイズの液滴を作成するために、水相のための脂質/油相と〜200ミリバールのために〜800ミリバールを使用します。
    3. 所望の液滴サイズと必要な量（サンプル当たり〜10μl）を取得した後、出口チャネルから液滴を収集し、（完全にフローセルを記入）フローセルにロードします。
    4. 慎重Valapを使用してフローセルの両端を閉じます（不完全クローズドフロー細胞は、画像彼らにそれを困難に、液滴の大規模な運動をもたらすことができます）。また、液滴の移動を生じる気泡の形成を防止します。
    5. サンプルの交差汚染や目詰まりを防止するために、前と使用後にイソプロパノールで徹底的にPEEKチューブを洗浄します。

3.再構成する基本的な微小管アスター

注：実験の要件に応じて液滴の内容を変化させることができます。すべての緩衝液はMRB80ベース（80ミリモルPIPES、1mMのEGTA、4mMのMgCl 2を液（pH 6.8））であり、すべてのサンプルを氷上で調製します。一般的には、液滴は常に中心体、微小管重合、脱酸素剤システムとブロッキング剤に必要なコンポーネントが含まれている（3.1節を参照）。必要であれば、微小管の力発電機と、必要な補因子および標的因子を含めることができます（セクション4.1と4.2を参照してください）​​。

  1. エマルジ ​​ョン液滴中アスター形成のための一般的なセットアップ（ 図3d）
    1. -80℃で小分けに予め、店舗内のグルコースオキシダーゼ（200mMのDTTおよび10mg / mlのカタラーゼ中の20mg / mlのグルコースオキシダーゼ）ミックスを調製します。
    2. 小さ ​​なaliquo予め、店舗内（ 表1参照）（中性マーカーとして）κカゼイン、ウシ血清アルブミン（BSA）、ツイーン20および蛍光デキストランを含有する「ブロッキングミックス'を調製します-80℃でのts。凍結融解の繰り返しを防ぎます。すべてのコンポーネントが新たに調製していることを確認します。
    3. 少量ずつ-150℃でMoudjou ら 32や店舗によって記載されているようなヒトリンパKE37細胞株由来の中心体を精製します。
    4. 室温で中心体を解凍し、〜37℃で20分間インキュベートします。使用前に適切な微小管の核形成を確保します。
      注：これは実験中の微小管の核形成を促進します。
    5. 尚、チューブリン（蛍光および「暗い」）、グアノシン三リン酸（GTP）、酸素スカベンジャー系を含む、「アッセイミックス 'を調製する（グルコース、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼおよび1,4-ジチオスレイトール（DTT））、分子力発生器（ 例えば、微小管モーター/架橋剤）、アデノシン三リン酸（ATP）とATP再生系（ホスホエノールピルビン酸（PEP）、ピルビン酸キナーゼ（PK）および乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH））、氷上で（ 表2参照）。
    6. 事前冷却氷上でairfugeローター。冷却airfugeローター（3分30 PSI）.Add予備加熱した中心体（1-2中心体を含む液滴を目指すために中心体の量を最適化）でサンプルをスピンダウン。
    7. 2.3節で説明した方法を用いて乳化液滴を生成するために結合ミックスを使用してください。
成分 ストック濃度 最終濃度（アッセイ中） ボリューム コメント
デキストラン、647nm 75μM 3.75 uMの（0.6μM） 5μlの
κカゼイン 20 mg / mlで 12.5 mg / mlで（2 mg / mlで） 62.5μlの
Tween-20を 5％ 0.375パーセント（0.06％） 7.5μlの
BSA 200 mg / mlで 12 mg / mlで（1.9 mg / mlで） 6μlの
MRB80 19μlの
100μlの最終 2μlの分量を保存します

表 1：「ミックスブロッキング」の成分混合物をブロックの成分、油中水型エマルジ ​​ョン滴における紡錘状構造の再構成のために必要。詳細については、「基本的な微小管アスターを再構成する「メインテキストセクション3を参照してください。材料の詳細については、「 材料表を参照してください。

成分 在庫concentration個 最終濃度 ボリューム コメント
ブロッキングミックス 1.6μlの
チューブリン 500μM 30μM 0.6μlの
チューブリン-561分の488 50μM 3μM 0.6μlの
GTP 50 mMの 5 mMの 1.0μlの
ダイニン-TMR 178 nMの 30 nMの 1.7μlの
ストレプトアビジン 5 mg / mlで 200 nMの 0.4μlの皮質ダイニンの場合のみ
キネシン-5 1.6 mMの 80 nMの 0.5μlの
ATP 25 mMの 1 mMの 0.4μlのモータの場合のみ
PEP 0.5 M 25.6 mMの 0.5μlのモータの場合のみ
PK / LDH 800 U / 1100 U 23 U / 32 U 0.3μlのモータの場合のみ
ASE1-GFP 400 nMの 80 nMの 2.0μlの
グルコース 2.5 M 50 mMの 0.3μlの最終段階
グルコースオキシダーゼ 50倍 1.0倍 0.3μlの最終段階
MRB80 バツ
9μlの最終

表 2：「アッセイミックス」の成分。 油中水型エマルジョンの液滴中の紡錘状構造の再構成に必要なアッセイ混合物の成分。詳細については、「基本的な微小管アスターを再構成する「メインテキストセクション3を参照してください。材料の詳細については、 材料表を参照してください。

4.スピンドルアセンブリ因子を導入

注：ここで説明するアッセイでは、緑色蛍光タンパク質（GFP）は、Sの切断バージョンをタグ付きセレビシエダイニンは、人工的に33 -tagアミノ末端グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）を用いて二量体化されたものを使用しました。このタンパク質は、タンパク質のIgG結合ドメインの2つのコピーを含有する親和性タグを介して精製しました。ここで使用される変異体は、カルボキシ末端およびN末端SNAPタグは、精製タンパク質をビオチン化するために使用されにテトラメチルローダミン（TMR）標識で標識されています。 。構文の詳細については、Roth氏ら 31を参照してください。精製詳細については、録音を参照してくださいK-ピーターソンら。33。 GFP-ビオチンダイニン-TMRは、ダイニンするビオチニル-PE脂質（ 図3E）にリンクビオチン-ストレプトアビジン複合体の形成を介して液滴皮質を標的とすることができます。

  1. ドロップレットのCortexにターゲティングダイニン
    1. 「アッセイミックス」にGFP-ビオチンダイニン-TMRを含め30nmの最終液滴濃度である （ 表2を参照）。 200nmの最終液滴濃度で（ 表2参照）」アッセイミックス」にストレプトアビジンが含まれます。
      注：ダイニンは微小管上の段階的運動のためのATP加水分解に依存しています。したがって、ATP及び「アッセイミックス'に（PEPおよびPK / LDHを含む）ATP再生系が挙げられる（ 表2参照）。
      注：組換え完全長S.ポンベ GFP-Cut7（キネシン-5）が親切にディーツラボ（モレキュラー・バイオエンジニアリング、工科大学ドレスデン、ドレスデン、ドイツセンター）から提供された、参照してください。組換えフルリットルengthヒスチジンタグS.ポンベ GFP-ASE1は親切ヤンソンスラボ（ワーゲニンゲン大学、ワーゲニンゲン、オランダ）から提供され、80 nmの濃度で「アッセイミックス」に追加されました。

5.イメージング

注：実験の間、微小管の成長温度を変えることによって制御することができます。撮影条件を選択する際に、トレードオフは、高品質画像と長い時間にわたってスピンドルアセンブリを監視する能力との間で行われなければなりません。異なる条件下での紡錘体形成の動態を比較するために、異なる内容の液滴は、同じ流路内で混合して撮像することができます。

  1. 基本的なイメージング設定
    1. 密閉チャンバを使用して、温度制御された環境での画像。 26℃で〜30分後に個々の微小管を可視化します。イメージングしながら、30°C〜まで温度を上昇させることによって微小管成長を促進します。
      注：■以下ettingsは、私たちの顕微鏡のセットアップに固有であり、異なるシステムや異なるオペレーティングソフトウェアに応じて変化することができます。ここに記載のアッセイのすべては、スピニングディスク共焦点ヘッドを備えた電動反転システム上に結像し、そのようなアンドールiQの3.1としてイメージングソフトウェアを使用して操作されます。 100X油浸対物レンズとEMCCDカメラですべての画像を取得します。
    2. 設定励起レーザ488、561及びおよそ〜10％の強度に641 nmの。 「買収」パネルに移動し「AOTF」タブをクリックして、10％にレーザー強度をスライドさせます。設定を保存するには、「記録」をクリックします。
    3. zの -projectionsについては、1μmの間隔（〜20枚/液滴）を使用したスタックを取ります。 '、パネルをクリックして「メイン」カメラに行く編集Z'と設定Z 'ステップ'を1.0に。をクリックして「設定を保存するには、「次。
    4. 「買収」パネルで「カメラ」タブをクリックすることにより、最大線のEMゲインを設定し、300セットの暴露にEMゲインバーをスライドさせ同じタブで200ミリ秒に倍。設定を保存するには、「記録」をクリックします。
  2. ライブイメージング
    1. ライブイメージングのために、使用してソフトウェアのコントロールは、z -projectionsごとに2分を作ります。約100ミリ秒までの露光時間を減少させることによって1〜2時間の期間。 （5.1.3に記載されているように）（5.1.4で説明したように）と2μmのzの -intervalsを高めます。 「リピートトン」をクリックして、2分に設定し、メイン「カメラ」パネルに時系列を設定します。 120分の合計時間のための間隔。
    2. ライブアッセイのために、液滴はできるだけ不動であることを確認するためにPDMSカップの代わりに、通常のフローセルを使用しています。
  3. 2条件の組み合わせイメージング
    1. マイクロフルイディクスを使用して液滴を生成し、氷上でPDMSコーティングされたスライドガラスの上に格納します。小滴の第二のセットが形成されるまでこれが微小管の核形成を防止します。液滴の第2のセットを生成する前に、PEEKチューブとを有するマイクロ流体チップを洗浄MRB80と完全に脂質/油相とマイクロ流体チップを補充します。
    2. 異なる色の液滴とを区別するために、蛍光デキストラン（または異なる波長の蛍光体でデキストランを使用する）場合とない場合の液滴を生成します。液滴の第二のバッチを製造した後、穏やかにピペッティングすることによって液滴を混合し、単一のフローセル/ PDMS-カップにロードします。
  4. 画像解析。
    1. フィジー（オンライン利用可能なオープンソースソフトウェア）34を使用して画像を分析します。
    2. 「hyperstackするスタック ' - ' hyperstacks ' - ライブアッセイのために、「イメージ」を使用してhyperstacksにスタックを変換します。 zスライスおよびタイムフレームの正しい数を設定します。
    3. Z-予測を行うために、「イメージ」を選択します - 'スタック' - 'zのプロジェクトを」。 「最大強度」投影を選択してください。
    4. 「プロパティ」ととの適切なピクセルを設定し、ピクセルheigth、ボクセルの深さとFR - 3D-再構成のために、最初の「画像」にアクセスしてくださいAME間隔。 「OK」をクリックします。 「イメージ」を選択してください - 'スタック' - '3Dプロジェクト」、「補間」ボックスをチェックし、「OK」をクリックします。

Results

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前のセクションで提示される方法は、油中水型エマルジョン液滴の幾何学的な閉じ込めを使用して複雑さを増加させると、スピンドル状構造の再構成を可能にします。このセクションでは、質的にこれらのアッセイの能力を実証する代表的な結果を説明しています。

バイポーラスピンドルが組み立てられたとき、有糸分裂の間、細胞はヒト細胞のために測定されるように、約15ミクロンの直径を有する球を形成するために切り上げます。この特性有糸分裂細胞の形状が制限され、両方がスピンドルサイズや向き35,36を指示する幾何学的境界を提供します。マイクロ流体技術は、正確に生きた細胞で観察された状況に似ているため、in vitroでの紡錘体のボトムアップ再構成を可能にする幾何学的封じ込めのレベルを提供します。

図4a、左パネル）内に拡散します。約20〜30分後、最初の微小管は微小管がすべての方向に皮質に対して成長するにつれて拡散が制限となり、可視および中心体になります。中間の長さ（液滴直径の約50％）の微小管とアスターは、（立体的に）、他の中心体および皮質互いに押し微小管と、それぞれ別のを撃退することができます。これは、互いに（ 図4a、中央のパネル）二つの対向中心体を有する典型的な「バイポーラ」紡錘状の配置になります。微小管は、液滴直径の〜50％以上成長するとメーターは、中心体を液滴皮質（ 図4a、右パネル）に沿って成長している微小管と、液滴の対向する境界にさらにプッシュされます。これらのアッセイにおける微小管の成長率は温度とチューブリン濃度の両方に非常に敏感であることに注意することが重要です。これらのパラメータは、したがって、強く核生成が最初に観察され、定常状態のアスター位置に達したときの時間に影響します。

細胞では、皮質引っ張る力が微小管プラス端と皮質関連ダイニンとの間に耐荷重添付ファイルの形成を介して生成されます。動物細胞では、この関連はのGαi1のN末端 ​​ミリストイル化を経由して、原形質膜を標的とするのGαi/ LGN / NuMAの複合体に依存します。これらの再構成アッセイでは、のGαi/ LGN /のNuMA複合体の要件を直接介して、ビオチン化脂質とダイニンを結合させることによりバイパスされますビオチン - ストレプトアビジン - ビオチン複合体の形成。これらの結合は比較的安定（K D〜10 -14 M）37であり、急速に形成する（通常は微小管の核形成が明らかになる前に、エマルション滴形成後10分以内）（ 図4b）。ダイニンの非存在下で、中心体を液滴皮質（ 図4c）の反対側に押され、一方の皮質ダイニンの存在下では、中心体は、典型的には、複数の中央位置を保持します。私たちは、これを防止し、微小管押す力に対抗する二つの効果の結果である理由。 （1）ダイニンは直接それによって微小管の長さを制限し、過度の微小管の座屈を防止し、微小管の大災害を促進し、（2）皮質引っ張る力は、アスター、アスター反発力に対抗個々アスター8、上の正味のセンタリング力につながります。

拡散性架橋剤ASE1がfを誘導します逆平行微小管29の重なり領域を増大させる傾向があるorces。これと一致し、ASE1の存在（とダイニンの不在）で中心体は、ASE1がバンドルさ極間微小管（ 図4d）にローカライズと密接一緒に発見されました。キネシン-5ファミリーのメンバーは、（導入を参照）スピンドル内から押し出す力を提供することにより、中心体の分離を駆動します。 Cut7（S.ポンベキネシン5オルソログ）の存在下では、中心体であってもASE1（ 図4e）の存在下で、エマルション液滴の反対側に押し出されます。皮質およびインター極性力発生器を組み合わせることによって、複雑さのレベルは、さらに最終的には双極性有糸分裂紡錘体の包括的な理解をもたらす、これらの実験で増加させることができます。これらの結果の詳細な定量的記述は、将来的に利用できるようになります（ロスら、原稿準備中）。

図5c）に。これは、両方の定常状態の挙動とスピンドルアセンブリ動態の研究を促進します。同一試料中の異なる内容の小滴を組み合わせることによって、そのままでおよび皮質力発生器（ 図5b）なしで小滴に中心体の位置決め及びスピンドルアセンブリ動態を比較するために、例えば、可能です。


図1： 紡錘体に作用する力 、いくつかの力を発生する分子は紡錘体の形成および位置決めを促進するために、紡錘体の微小管に作用します。細胞表層に成長する微小管は中心体に押圧力を発生させます。 （紫）皮質ダイニンは、脱重合微小管をキャプチャし、中心体に引っ張り力を発生させます。 PRC1 / ASE1ファミリーのクロスリンカーは、対向する外側にスライドする力を発生に対し、スピンドル内では、キネシン-5 / Cut7モータータンパク質は、反平行微小管を外側にスライドする力を与える。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。

マイクロ流体チップのレイアウト、希釈チャネルを含む設計回路図、交差の詳細、チャネル幅。
図2：4マイクロ流体チップを含む4インチのフォトマスクのマイクロ流体チップの設計 （A）設計。 （B）シングルチップの詳細な表現。チップは、1つの出口チャネルとダストフィルタが続く3の入口チャネルが含まれています。入口チャネル1が水相を含有し、脂質/油相とチャネル3 2チャネルは、追加の脂質/油相で形成された液滴を希釈するために使用することができます。 （C）（上下から来る）脂質/油相（左から来る）水相に会う接合部の詳細な表現。ジャンクショ​​ンで、液滴が形成され、右側の出口流路に向かって流れます。 （D）2ミクロンチャネルを有する防塵フィルタの詳細な表現。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

マイクロ流体チップ図:PDMSセットアップ、中心体-チューブリン追跡、ダイニン相互作用研究。
図 3： 油中水滴型エマルジ ​​ョン液滴形成のための方法論 （A）明視野顕微鏡上のマイクロ流体チップとマイクロ流体チューブ。水及び脂質/油相の管の両方が、それぞれチップ口1,2に接続されています。 （B）水と脂質/油相が満たすマイクロ流体チップの制限。圧力を変化させることにより、液滴サイズを制御することができます。 PDMSコーティングされたフローセルの（C）設計。フローセル内への液滴をロードした後、開放端部には、追加Valapで閉鎖されています。 （D）液滴形成の概略図。液滴は、中心体、チューブリンおよび紡錘体形成のために必要な追加の構成要素を封入するために使用されます。皮質ダイニンターゲティングの（E）の回路図。ビオチン化（バイオ）ダイニンは、ストレプトアビジン（STRP）を介してビオチン化脂質を標的とします。

微小管構造に対するチューブリンとダイニンの効果。免疫蛍光顕微鏡、タンパク質局在化。
図4： 複雑さの増加に伴ってスピンドル・再構成はの代表的な結果 （A）、短い、中間、及び長い微小管の一例を示す2中心体を含む液滴の最大強度投影。中心体と微小管10％HiLyte-488チューブリン標識の添加により可視化されます。スケールバー=10μmです。 （B）非存在下でのGFP-ビオチンダイニン-TMRのローカライズ（ - 、左）とストレプトアビジンの存在（+、右）（STRP）。皮質GFP-ビオチンダイニン-TMRのまたは存在（+、右） - （C）微小管アスター不在の位置決め（左）。 （D）微小管アスター（左パネル、GRASE1の存在下でEEN）ポジショニング（中央のパネル、赤）。 ASE1とCut7（キネシン-5）（中央のパネル、赤）の存在下で、（E）微小管アスター（左パネル、緑）ポジショニング。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

PDMSのセットアップ;641nmでの拡散実験のための油滴のマイクロマニピュレーションを経時的に示した図。
図 5：in vitroでの イメージングアスターポジショニングダイナミクス （A）、数時間までのために液滴イメージングを可能にするPDMSカップのデザイン。異なる内容を含む液滴の（B）の生成、ストレージおよびイメージング（送信）は、不在蛍光デキストランの（左）インクルージョン（右）（アレクサ647）によって示されています。広告のzスタック（2μmの距離）から取られた60分のタイムラプスの（C）シングル平面画像（2分間隔）単一の中心体を含むroplet。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

方法は、ここで油中水型エマルジョンの液滴中の基本的な紡錘体を再構成することが、本の最近の取り組みを説明しました。幾何学的境界内にスピンドル・アセンブリを研究することは、多数の利点を提供します。重要なフィードバック機構は、有糸分裂紡錘体の微小管と、それらが組み立てられた幾何学的制約の間に存在します。微小管は、それらが、紡錘体の変位をもたらすことができる幾何学的境界に成長時に力を押し生成することができます。また、物理的な障壁に成長する微小管災害を誘発することができます。また、制限された形状内のスピンドル・アセンブリは、順番に直接微小管の成長率36に影響を与えるようなチューブリンなどの個々のコンポーネント、の漸進的な枯渇につながることができます。これらは、ここに記載のアッセイを用いて研究することができるスピンドル・アセンブリの全ての必須の決定要因です。

記載のアッセイは、低濃度のdiffereに非常に敏感です液滴コンポーネントのNCES。これは、マイナーな濃度差がいずれか遅すぎるか、あまりにも急速な微小管の成長をもたらすことができるチューブリン、の場合です。この場合には、微小管の成長率は、多くの場合、依然として実験の最初の約30分の間に温度を調整することによって補正することができます。有糸分裂紡錘体の組み立て及び位置合わせは、（皮質）力発生の濃度の変化に非常に敏感です。これは、精製された成分の濃度、純度および活性に依存する可能性があり、すべての新たに精製されたタンパク質のために慎重に滴定される必要があります。

また、特定のトレードオフは、アッセイの性質に応じて、撮像設定で行われなければなりません。最初は、水溶性の蛍光チューブリン二量体の高レベルは、画像の個々の微小管にそれを困難にします。微小管が長く成長し、可溶性チューブリンを徐々に枯渇しているように、信号対雑音比が徐々に高くなり、individuのイメージングを可能にしますアル微小管。オープンシステムでセットアップとは対照的に、幾何学的な閉じ込めは重要漂白が得られ、バルクリザーバ内の蛍光分子及び酸素スカベンジャー系の成分の交換を防止します。特に経時スピンドルアセンブリと位置を監視するために、それがあっても強力な酸素スカベンジャー系の存在下で、低い光強度で画像に必要とされます。

これらの方法には、in vitroでの簡素化紡錘状構造のボトムアップ再構成を可能にします。ここで紹介成分に加えて、他の多くの要因は、双極紡錘体形成、位置決め、方向付け、成形、 等 3に影響を与えることが記載されています。このシステムは、さらに、追加の力発生器の個々の及び組み合わせの効果を研究するために拡張することができます。このシステムから、現在存在しない紡錘体形成に重要な貢献者は、有糸分裂染色体です。有糸分裂クロマチンに示されていますいわゆる「極性吐出軍3 ' を生成することができます （1）chromokinesins、クロマチン結合RanGEF RCC1 38によってRanGTPと勾配の（2）の形成、（脱重合と相互作用することができる（3）動原体による直接紡錘体形成）微小管39及び（4）の対向する微小管40との間における機械的バネとして機能することができるクロマチン自体。

最後に、記載されたシステムは、現在、限られた時間的・​​空間的な活動を制御し、導入力発電機の局在を提供します。細胞では、多数のスピンドル・アセンブリの要素は、特定のコンパートメントに局在化または制限された時間ウィンドウ内で活性です。顕著な例は、具体的にはCの後側に濃縮されるダイニンの活動であり、非対称の主軸位置と細胞分裂を促進する1細胞期胚をエレガンス 。このシステムでは、我々は現在、トンを模倣する可能性を模索しています光遺伝学的手法から借用した方法を用いてemporalと非対称活動。また、Cの場合と同様エレガンス胚と剛性細胞壁を有する細胞は、多くの細胞が有糸分裂に切り上げていません。幾何学的な閉じ込めの形状は、スピンドル41に作用する力の基礎影響を与えることになります。したがって、潜在的に整形し、エマルジ ​​ョン液滴42,43の記憶許可より複雑なマイクロ流体システムを使用して、同様に非球形の小滴にスピンドル・アセンブリと位置を再構成することが重要であろう。最後に、組織において、細胞 - 細胞および細胞 - 基質シグナリングおよび付着は、多くの場合、上皮細胞において観察されるように、指向軸方向に変換することができる外部の手がかりを提供し、幹細胞。これらの特殊な側面のすべては、この現在の研究では考慮されておらず、紡錘体assembのin vivo様より再構成は向かって構築するための今後の課題を提供するかもしれませんLYとポジショニング。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

貴重な議論をしてくださったドグテロム研究室のメンバーに感謝します。試薬についてはStefan Diez氏とMarcel Janson氏、ダイニンの精製にはSamara Reck-Peterson氏に感謝します。この研究は、欧州研究会議(ERC Synergy助成金:MODEL-CELL)からの資金提供によって支援されました。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<ストロング>1.マイクロ流体チップの調製
Photomask (フィルム基板上のフォトマスク)Selba S.A. Switzerland
SU-8 3025MicroChem
Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0>10-20 &オメガ;-cm, 500-550 μm, SSP, フラット2個付)WRS Materials4P0SSP-005
スピンコーター ポロスSPIN150I
PDMSのプレポリマーRVT615 A+BLubribond9481
コロナのtreaterの電気technicプロダクトBD-20ACV
2。マイクロ流体セットアップ
名前会社カタログ番号コメント
DOPS (1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン)Avanti Polar Lipids840035
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(ビオチニル))アバンティ 極性脂質870285
クロロホルムシグマ・アルドリッチ650498
ガラスピペット
ガラスチューブ
真空ポンプラボポートKNF
真空チャンバーカルテルポリプロピレン 真空デシケーター
鉱物油Sigma-AldrichM5904
界面活性剤 (Span80)Sigma-Aldrich85548
SonicatorBransonM2800H
カバースリップ24 mm x 60 mm、厚さ 1.5
スライド26 mm x 76 mm
パンチャーハリス ユニコア135840/135841/135843
ラボ用シーリングフィルムパラフィルム
Valap(ワセリン、ラノリン、パラフィンワックスを等濃度で溶かした)自家製
明視野顕微鏡ライカPMIRB 反転明視野があれば十分です
圧力コントローラーFluigentMFCS-FLEX-4C-1000
PEEK チューブCluzeau Info. Labo, France
Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)VWR, The Netherlands
3.スピンドルの形成と位置決めの再構成<
strong>名前会社カタログ番号コメント
Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)Life Technologies
Tween-20Sigma-Aldrich
BSA - ウシ血清アルブミンSigma-Aldrich
グルコース (D-(+)-グルコース)Sigma-AldrichG8270
グルコースオキシダーゼ (Aspergillus niger 由来のグルコースオキシダーゼ)Sigma-AldrichG6125
DTT (DL-ジチオールテイトール)Sigma-Aldrich646563
Catalase (ウシ肝臓のカタラーゼ型)Sigma-AldrichC9322
Tubulin(ウシ脳由来チューブリン)Cytoskeleton Inc.
Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)株式会社サイトスケルトン
GTP (グアノシン-'5-三リン酸、ナトリウム塩水和物)Sigma-Aldrich51120
κ-カゼイン(κ-カゼイン、ウシ血清ミルク由来)Sigma-AldrichC0406
Airfuge (空気駆動超遠心分離機)Beckman-CoulterCLS
4.スピンドル組立因子の紹介
名前会社カタログ番号コメント
ニュートラビジンSigma-AldrichA2666
ATP(アデノシン-'5-三リン酸、二ナトリウム塩水和物)Sigma-AldrichA9187
PEP (リン酸化(エノール)ピルビン酸 monosodium salt hydrate ≥97%(酵素))Sigma-AldrichP0564
PK / LDH -(ウサギ筋肉由来のピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ酵素)Sigma-AldrichP0294
ガラス

References

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