方法論記事

ギャップ結合細胞間コミュニケーション：毒物および毒素の有害効果を評価するための機能バイオマーカー、および天然物の健康上の利点

DOI：

10.3791/54281

⸱

2016年12月25日

 ,  , 
1Department of Pediatrics & Human Development, Institute for Integrative Toxicology, Michigan State University, 2RECETOX — Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Faculty of Science, Masaryk University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ギャップ結合チャネルを介して細胞間通信を測定メスローディング蛍光色素転写技術が記載されています。ギャップジャンクション間の通信は、組織の恒常性を維持し、この細胞シグナル伝達の破壊は健康への悪影響がありますされる主要な細胞プロセスです。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、組織の恒常性が維持されることにより、主要な細胞間プロセスであるギャップ結合チャネルを介して細胞間の通信を、測定メスローディング蛍光色素転写（SL-DT）技術が記載されています。 などの毒物、毒素、薬物によるギャップ結合細胞間コミュニケーション（GJIC）の中断は、多くの健康への悪影響にリンクされています。多くの遺伝ベースのヒト疾患は、ギャップジャンクション遺伝子の変異にリンクされています。 SL-DT技術は、細胞の大集団におけるGJICの同時評価のためのシンプルな機能アッセイです。アッセイは、簡単に細胞集団を介して手術用メスの刃を有する細胞膜を摂動することによって蛍光色素でプレローディング細胞を含みます。蛍光色素は、その後、指定された時間のための隣接セルにギャップ結合チャネルを介して通過することを許可されています。アッセイは、その後、細胞にホルマリンを添加することによって終了されます。 FLUOの広がり細胞の集団を通じrescent染料は、落射蛍光顕微鏡で評価され、画像はパブリックドメインで検出されたフリーソフトウェアパッケージを含む利用可能である形態計測ソフトウェアパッケージ、任意の数を用いて分析されています。このアッセイはまた、処置された動物からの種々の臓器からの組織切片を用いたin vivo試験のために適応されています。全体的に、SL-DTアッセイは、in vitroでの薬理学的および毒物学的ニーズの広い範囲を提供することができ、潜在的に、より短い時間でより多くのサンプルを解明するために、自動化蛍光顕微鏡イメージングおよび解析の高スループットセットアップシステムに適合させることができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この方法の全体的な目標は、化合物の潜在的毒性を評価するために、単純な包括的かつ比較的安価な技術を提供することにあります。これは、複数の細胞株において使用することができるインビトロアプローチです。落射蛍光顕微鏡を搭載した標準的な細胞生物学研究所は、このアッセイを使用して研究を行うことができます。

細胞機能の私達の基本的な知識は、in vitroバイオアッセイに大きく依存してきた、医薬品、環境汚染物質、食品生まれ汚染物質の毒性評価に不可欠な要素となっています。残念ながら、総合的にすべての毒性学的評価のための要求を満たすことができない単一のin vitroバイオアッセイ系はありません。 in vitroアッセイの多くは、特定の生化学的または分子のエンドポイントを評価するだけでなく、評価するために設計され、最適化されています。これらは、かなり頻繁に摂動を反映するように設定し、高スループットで結合されますそのような1シグナリングエストロゲン受容体などの特定のシグナル伝達経路、。この戦略は非常に成功しているが、遺伝子発現に関与するシグナル伝達経路の豊富な数は非常に複雑評価するために、特定のシグナル伝達経路を選択する作業を行います。ハイスループットプロトコルが現在開発と同時に、単一のアッセイのいくつかの制限を克服するための一つのアプローチをされている多数のシグナル伝達経路を測定するために使用されています。ただし、すべてのシグナル伝達経路が正常より包括的なアプローチに組み込まれている、プラス新しいシグナル伝達経路は、絶えずさらに、この評価プロセスを複雑にすることが発見されています。特に、高スループットシステム、in vitroでのアプローチの大規模な番号を使用して、総合的な毒性学的評価も非常に高価であり、ほとんどの単一の研究者につながらないための研究プロジェクトを主導しました。

GJICは、プロセスのtigですhtly膜と細胞骨格タンパク質2,3との主要な細胞内シグナル伝達経路との相互作用によって調節される電圧の変化、カルシウム濃度、pH、酸化還元バランスによって制御されます。したがって、GJICの阻害は、細胞ストレス、異なる細胞機能の破壊、または別のシグナル伝達経路の摂動の種類を反映することができます。制限されたシグナル伝達バイオアッセイの使用を克服するための別のアプローチは、多くの、そうでない場合は、ほとんどのシグナル伝達経路は、さらに、ギャップ結合チャネル4-8を介して協調細胞間シグナル伝達系によって調節されることが生物学的現象を利用することです。細胞間シグナル伝達系も多数あり、複数の経路の制御下にあるが、ギャップ結合チャネルを介したシグナル伝達間は、最終的には、部分的に閉じたまたは完全に閉鎖開かれているチャネルの機能です。これは、簡単に様々な使用して測定することができるエンドポイントを提供します試験管内バイオアッセイシステム7インチ組織の恒常性のセットポイントは、オープンチャネルが必要であることを考慮すると、ギャップジャンクション間コミュニケーション（GJIC）に対する化合物の効果を決定することは、化合物4,8の潜在的な毒性作用を決定する上で、より包括的なアプローチです。本質的には、遺伝子発現を制御する複数のシグナル伝達事象を調整において中心的役割を果たし、この重要な生物学的現象は、毒性作用の広範な評価を可能にします。したがって、GJICを評価するバイオアッセイは、化合物の毒性を評価するための優れた出発点です。

GJICを評価するために使用される最も広範な技術は、蛍光プローブで細胞をプレロードした後、隣接するセルにロードされた細胞または細胞からの染料の移行の監視に基づいています。染料をプリロードする技術は、プローブ11のロード10、およびメチルエステルをこすり、マイクロインジェクション9を含んでいました。メスローディング蛍光色素転写（SL-DT）メソッドは、かき取り負荷の変形例である-エルFouly 10によって開発された転移アッセイを染めます。むしろ、より侵襲的なこすりよりも、この報告書のメスローディング方法は、侵襲的な損傷を最小限に抑える細胞の単層を介して、丸刃（ 図1）とメスの穏やかなロールを伴います。この技術の利点は、細胞ではなく、マイクロインジェクションアッセイの単一細胞の集団の毒性学的評価です。さらに、このアッセイの単純さは、蛍光プローブのメチルエステルを使用するマイクロインジェクション技術及び技法を使用する方法が大幅に多くの時間がかかるのに対し、短時間で複数のプレートの迅速な検出を可能にし、かなり高いスキルレベルを必要とします。

GJICを研究するすべてのニーズを満たすために単一の方法がありませんが。 SL-DTアッセイができる簡単な、かなり安価で汎用性の高いアッセイであります様々な化合物の毒性の初期評価のためのニーズの多くを満たします。主な利点としては、単純さ、そのようなマイクロインジェクション、（FRAP）アッセイおよび分子蛍光プローブアッセイの局所的活性化を光退色後蛍光回復、大規模でGJICの迅速かつ同時評価などの他の方法に必要とされる機器やスキルの特別な必要性をin vivo試験のための自動化された蛍光顕微鏡イメージングおよび分析、ならびにその適応性と高スループットセットアップに資する細胞の数、。

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プロトコル

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この研究のためのプロトコルは、in vivo実験は、ラットを安楽と苦痛の軽減のために関連して処理したことを確実にするために、行われた場所である日本の健康科学の国立研究所の動物実験と利用委員会によって承認されました。

1. SL-DTバイオアッセイ

  1. イーグルスを含む種子3×10 5 WB-F344ラット肝上皮細胞35へのミリの直径の培養プレートを37ºC、100％の相対湿度（RH）、5％のインキュベーター内で培地+ 5％ウシ胎児血清、培養細胞を改変しましたCO 2。
  2. それらは100％コンフルエンス（典型的には、2日）に到達し、以下に記載されるように、細胞の所望の実験的治療を行うまで、培養細胞。
    1. 用量応答実験を実施
      1. 10μlの100％アセトニトリルおよび4μlを、6μlの中のフェナントレンの2 mMストック溶液20μl、およびphenanの20mMストック溶液を8μlを添加しますストック溶液の各添加量の成長培地2mlを含有する細胞の三プレート100％アセトニトリルでスレン。
      2. 4μlを、6μlの、8μlを、10μlの、および車両制御として機能するアセトニトリル溶液の追加された各ボリュームの成長培地2mlを含有する細胞の3プレートへのアセトニトリルの100％溶液20μlを追加します。
      3. 37℃、100％RHおよび5％CO 2に設定したインキュベーター中で15分間、プレートをインキュベートします。
      4. 1.3に進みます。
    2. 行動時間応答実験
      1. 各時点（ すなわち 、0、1、2、3、4、5、10分）のために増殖培地2mlを含有する細胞の三プレート100％アセトニトリル中のフェナントレンの20mMストック溶液の7μlを添加します。
      2. ビヒクル対照として機能する各時点で増殖培地2mlを含有する細胞の三プレート100％アセトニトリルの7μlを添加します。
      3. 各指定時間pのプレートをインキュベート37℃、100％RHおよび5％CO 2のインキュベーターでOINT。
      4. 1.3に進みます。
    3. Timeリカバリの実験を行います
      1. 15分間の成長培地2mlを含む細胞の3プレートに100％のアセトニトリル中のフェナントレンの20mMストック溶液を7μlを添加します。
      2. ビヒクル対照として15分間増殖培地2mlを含有する細胞の三プレート100％アセトニトリルの7μlを添加します。
      3. フェナントレンまたはアセトニトリルのいずれかを含有する培地をデカントし、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）3mlで3倍にそれぞれのリンス。
      4. 希望の回復時間（ すなわち、25、35、45、60、90、120、150、180、240、360分）37℃のインキュベーター中で、100のために各プレートに新鮮な増殖培地2mlを加え、インキュベート％RHおよび5％CO 2。
      5. 1.3に進みます。
    4. 行動のメカニズムの実験
      1. シグナル伝達阻害剤を追加、 すなわち
      2. ビヒクル対照として15分間増殖培地2mlを含有する細胞の三プレート100％アセトニトリルの5μLを加えます。
      3. さらに15分間、増殖培地+ D609の2ミリリットルを含む細胞の3プレートに100％のアセトニトリル中のフェナントレンの20mMストック溶液を7μlを添加します。
      4. 2増殖培地1mlを加えた車両制御として機能する追加の15分間100％アセトニトリルを含有する細胞の三プレート100％アセトニトリルの7μlを添加します。
      5. 1.3に進みます。
  3. いずれかの培地に穏やかにオフ注ぐことによって、または真空吸引によって培養液を捨てます。
    注：適切に有害廃棄物を含む培地を廃棄してください。
  4. 3 mlのPBSとbetweeデカントまたは吸引のいずれかで細胞を3回ずつすすぎますn個のリンス。
  5. 各細胞プレートにPBS（LY）に溶解した1mg / mlのルシファーイエロー色素のピペット1ミリリットル。
  6. 静かにプレートの三つの異なる領域で細胞の集団を介して丸みを帯びたエッジに＃20手術用鋼の刃を回転させることにより、細胞への色素をプリロード。
    1. 垂直メス（90°の角度）と培養プレートの端から5mmを置くことによって開始し、その後、15°（ 図1参照）の角程度にこの垂直な角度からメスをロールバックします。
      注：これは、人差し指と親指の間にメスをつまんで達成されます。メスは静かに（丸みを帯びたブレードは、単に細胞転がるように）90°〜15°の位置から行くことができるように重力を使用してください。この運動は、視覚的に目立つインデント行を残します。
  7. 室温で3分間LY溶液で細胞をインキュベートします。
  8. デカントまたはLYを吸引し、すべてのextraceを除去するためにPBSの3ミリリットルで3回すすぎllular細胞外のバックグラウンド蛍光を除去するために染料。
  9. 細胞を固定するために、10％リン酸緩衝ホルマリン溶液の0.5ミリリットルを追加します。
    注：ホルマリンで固定した後、空気は、細胞を乾燥し、LY色素の最小光退色と最大2つの年間暗所で保管してください。必要な場合には、蛍光色素の前面を視覚化するために10％ホルマリン溶液で再水和します。
  10. 200Xの倍率で536分の428 nmでの励起/発光ピークのためのダイクロイックキューブを装備した落射蛍光顕微鏡を用いて固定した細胞を表示します。インデントラインはビジョンの水平磁場に平行になるようにすべてのプレートの位置を合わせます。
    注：FITCのダイクロイックキューブはうまく動作します。
    1. CCDカメラとサポートするソフトウェアで画像をキャプチャします。
      1. CCDカメラ用のサポートソフトウェアを開いて、自動露出の設定を使用します。デジタルで画像を取得する「捕獲」ボタンを使用します。 「保存」ボタンを使用して.tifファイルとして画像を保存します。

肝臓組織へのSL-DTアッセイの2適応

  1. 解剖ハサミを使用して、5週齢、雄のフィッシャー344ラットの肝臓の左葉から約2×2cmのスライスを削除して、プラスチックの上に置き、ウェットガーゼ12で覆われたプレートの重量を量ります。
  2. ピペット0.5の1mgを含有するPBS溶液のミリリットル/ mlのルシファーイエローおよびローダミン - デキストラン（RD）プラスチック中の肝臓切片の表面上に計量プレートの各。
    注：RDはギャップ結合チャネルを横断することはできませんし、ロードした細胞をマークする色素です。
  3. 鋭い刃を持つ計量プレート内の色素溶液を持つ肝臓切片の表面に約1cmの長3〜5切開を行い、その後、切開部を満たすのに十分な追加の染料を追加します。
  4. プレートの重量を量るプラスチック上に室温で3分間組織をインキュベートします。
  5. 5mlのPBSで3回洗浄します。
  6. 組織オベを修正しました。室温で暗所で50ミリリットルコニカル遠心チューブ中の10％リン酸緩衝ホルマリンの30ミリリットルでrnight。
  7. 次の日は、1×1×0.5 cm 3を短冊状にはさみを解剖して切開部の周りの組織をトリミングし、水でスライスを洗浄した後、パラフィン13でスライスを埋め込むための標準的な技術を使用しています。
  8. 節のスライス厚さ5μmに切開線に対して垂直と準備がミクロトーム13と標準切片技術を使用して画像化されるまで暗所でサンプルを保管します。
  9. セクション1.10 7に記載の蛍光色素の前線の画像を視覚化し、キャプチャするために、CCDデジタルカメラを搭載した落射蛍光顕微鏡を使用してください。

3.定量化GJIC

  1. （ 例えば 、ImageJの）形態計測ソフトウェアパッケージを使用して、蛍光色素の広がりを測定します。
    1. 「ファイル」タブをクリックし、開くために、「開く」をクリック保存した画像。
    2. 色素の先端の輪郭をトレースするツールバータブにある「フリーハンドツール」をクリックします。
    3. 「分析」タブをクリックし、「測定」をクリックします。
      注：これにより、必要に応じて、他のスプレッドシートプログラムにコピーすることができますスプレッドシート内の面積値を生成します。
  2. スプレッドシートプログラムを使用して、染料は、以下の式を用いて、制御プレートに移動した領域によって、実験プレートでの色素の広がりの面積を分割して制御（FOC）の割合を計算します。
    figure-protocol-1
    E =そのような特定の用量または時間で、化学的に処理された細胞などの実験変数に暴露された細胞、中の色素の広がりの面積
    細胞は、興味のある化学物質を溶解するために使用されるビヒクルで処置された対照色素の広がりのC =面積
    注意：車両の影響を判断するには、eは車両とcで処理した細胞中の色素の広がりの面積は、車両によって処理されていない細胞中の色素の広がりの面積となるであろう。車両の効果は、好ましくは10％未満であるべきです。

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結果

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GJICの中断が広く健康への悪影響14を誘導する遺伝子制御の非遺伝毒性、エピジェネティックなレベルで有毒な化合物を同定するためのバイオマーカーとして使用されてきました。例えば、多環芳香族炭化水素（PAH）は、環境の遍在の汚染物質があるが、それらの分子構造15の関数としてのエピジェネティックな毒性に変化します。低分子量のPAHは、典型的には、タバコの煙15,16と汚染された河川の堆積物のような多くの多様な環境でのより高い分子量のPAHよりも相対的に高い濃度で見出されます。フェナントレンは、ベイ領域と呼ば角度ポケットが3のベンゼン環を有し、低分子量のPAHの一例です。 図2は、フェナントレンの漸増用量で処置されたWB-F344ラット肝上皮細胞のSL-DTの一連の画像です。移行Oの減少に注意してください。用量の増加と蛍光色素、ルシファーイエロー、F。スキャンした画像の領域が制御（FOC）の割合として決定することができます。 図2

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ディスカッション

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SL-DTアッセイはGJICを測定する際の、シンプルで汎用性の高い手法であるが、適切な実験プロトコルを設計する際に考慮されるべきいくつかの重要な懸念があります。 SL-DTアッセイを用いてGJICの堅牢な測定のために細胞のギャップ結合を介して、LYの良い染料の広がりが存在しなければなりません。最低でも、十分な時間は色素が両方向でメス負荷細胞からの細胞の8行以上を介して拡散することを確実にするために選択されるべきです。また、色素がメス負荷細胞から移行距離の測定を容易にするため、コントロールプレートの色素広がりが視野の70〜90％を満たす保証倍率を選択します。 WB-F344ラットの肝臓上皮細胞では、色素の先端が4セル行を越えて移動するのLY溶液で3分間のインキュベーションで十分であり、200Xの倍率は最適です。細胞はLOADIするのは非常に修正可能である、直径35mmのプレート上で増殖していますメスで細胞内に色素をngの。しかし、細胞は、小さなウェルで増殖させることができるが、メスの使用は、特に、96ウェル培養プレートに、不可能です。小さな井戸について、ウェルに適合し、そして再び、ローリングアクションを使用することができます小さな丸いひ...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIEHS助成金 #R01 ES013268-01A2によってサポートされており、内容は著者の責任であり、必ずしもNIEHSの公式見解を表すものではなく、CETOCOEN UPgradeプロジェクトNo.によってサポートされています。CZ.1.05/2.1.00/19.0382.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
WB-F344 ノースカロライナ大学(ノースカロライナ州チャペルヒル)のJ.W.グリシャム博士とM.S.ツァオ博士からなしJ.W.グリシャム博士とMSツァオ博士から提供されましたノースカロライナ大学チャペルヒル-ノースカロライナ
35 mm培養プレートコーニング430165
25 cm2培養フラスココーニング430639
75 cm2培養フラスココーニング430641
D-medium、イーグルス修正培地 サーモフィッシャー/GIBCO 処方 No. 78-5470EF
ウシ胎児血清サーモフィッシャー/GIBCO 10437
0.25%トリプシン-EDTA サーモフィッシャー/GIBCO 15050
リン酸塩緩衝生理食塩水自家製成分cat#の137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2PO4、2 mM KH2PO4
KClJTベイカー-Mallinckrodt 3040-01
NaClJTベイカー - マリンクロット 3624-05
Na2HPO4JTベイカー-マリンクロット 3819--01
KH2PO4JTベイカー-マリンクロット 3246-01
ルシファーイエローCH、リチウム塩Sigma-Aldrich ChemicalL0259
rhodamine-dextranSigma-Aldrich ChemicalR9379
1-メチルアントラセンSigma-Aldrich Chemical
フェナントレンSigma-Aldrich ChemicalP11409
レスベラトロールSigma-Aldrich ChemicalR5010
D609トクリス・バイオサイエンス 1437
アセトニトリルEMDAX0145-1
37%溶液ホルムアルデヒドJTベーカー - マリンクロット 2106-01
#20 手術用刃物 ファインサイエンスツールズ株式会社 10317-14
50 ml円錐形滅菌チューブThermoscientific 
ニコン落射蛍光顕微鏡 ニコン-Mager ScientificEclipse TE300
Nikon FITC 二色性キューブニコン-Mager Scientific96107
CCDカメラニコン-Mager ScientificニコンクールスナップEZのCCD
イメージングシステムニコン-Mager ScientificニコンNIS-Elements F2.2イメージングシステム。
画像J国立衛生研究所http://imagej.nih.gov/ij/
ラット肝臓上皮細胞州339652

参考文献

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