細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

Summary

この原稿は、細胞外マトリックスに囲まれた定義された幾何学的形状の3次元（3D）上皮組織の均一な配​​列を操作するソフトリソグラフィーベースの技術が記載されています。この方法は、細胞の種類および実験の文脈の多種多様に適していると同一の​​複製のハイスループットスクリーニングを可能にします。

Abstract

肺、腎臓、乳腺などの分岐器官の構造は、微小環境におけるさまざまな可溶性および物理的シグナルによって調節される分岐形態形成の発達過程を通じて生じます。ここでは、細胞外マトリックス(ECM)内に完全に埋め込まれた、定義された形状とサイズの人工三次元(3D)上皮組織を形成することにより、分岐形態形成のプロセスを研究するために作成された方法を説明します。この方法により、同一の組織のアレイの形成が可能になり、組織の形状、間隔、ECM組成など、さまざまな環境要因の制御が可能になります。この方法は、牽引力顕微鏡(TFM)などの広く使用されている技術と組み合わせて、細胞とその周囲のECMとの間の相互作用についてより多くの情報を得ることもできます。このプロトコールは、がんの浸潤を含む、分岐形態形成以外のさまざまな細胞および組織プロセスを調査するために使用できます。

Introduction

分枝形態形成として知られている分枝状の上皮組織の発達は、細胞由来の、物理的、及び環境因子によって調節されます。乳腺では、分枝形態形成は、細胞の遊走は、ツリー状のアーキテクチャを作成し、集団導かれ、それを通して反復的なプロセスです。最初のステップは、分岐開始および伸長^1,2に続いて、乳管からの一次芽形成です。周囲の間質への枝の浸潤は思春期でのステロイドホルモンの全身放出によって誘発されます。新しいプライマリ芽は、既存の枝の末端から開始し、このプロセスは、上皮ツリー^3を作成し続けています。多くの重要な生化学的シグナルが同定されているが、この複雑な発達過程を導く細胞生物学的メカニズムの包括的な理解が現在欠如しています。また、特定の手がかりの影響に関するメカニズムの研究はexperiから解体することは困難ですin vivoでのメントは、などの正確な時空間摂動および測定がしばしば可能ではありません。

例えば全器官培養、プライマリオルガノイド、および細胞培養モデルとして3次元（3D）培養技術は、体系的に組織形態形成^4-6のメカニズムを調査するための有用なツールです。これらには、移動、増殖、および分化を含む細胞挙動の様々な、このような機械的な力および生化学的信号として、個別に特定の因子の影響を決定するために特に有用である^。6操作された細胞培養モデル、特に、容易に摂動を可能にします個々の....

Protocol

ソリューションの調製

1. インスリンの5 mg / mlで溶液を調製するには、のdH ₂ O（溶媒100ml中に500mgのインスリン）で5 mMの塩酸（HCl）と粉末状のインスリンストックを希釈します。蒸留水100mlに濃塩酸を50μl添加することによって、溶媒100ミリリットル（ _の dH ₂ O）を準備します。
2. PBSの1×溶液を作製するために、無菌条件下でのdH ₂ Oで1Xに10×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）ストック溶液を希釈します。
3. 次のようにポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマー溶液を調製する：1（W：ワット）比10に硬化剤と一緒にPDMSプレポリマーを混合します。
4. 株式ダルベッコ改変イーグル培地の500ミリリットルに：次のように細胞培養培地を準備する栄養混合物F-12（DMEM / F-12）、ゲンタマイシン試薬を500μlを無菌ウシ胎児血清（FBS）の10ミリリットルを追加し、 5 mg / mlとインスリンの500μlの。
5. （W 1％を追加し、1×PBS溶液中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）を調製し：v）のBSA粉末の溶液をPBSを1倍と完全に混合します。
6. 追加、Iコラーゲン中和ウシ型の4 mg / mlで溶液を調製するために、50μlの10倍ハンクス平衡塩溶液（HBSS）バッファー、30μlの0.1 N水....

Results

乳腺上皮組織の微細化の一般的な概略図

実験作業の流れを概説する微細加工手順の一般的な概略図を図1に示されている。最終的には完全にECMゲル内に埋め込 ​​まれている同一の幾何学的形状及び間隔の上皮組織のアレイです。代表的な実験は、私は4ミリグラム/ mlの濃度でコラーゲンウシ型のゲルで培養EpH4マウス乳腺上皮細胞を使用しています。操作された組織の最高の品質を確保するために、プロトコルで概説技術は密接に従うべきである。型に成形された長方形のウェルのアレイの図2Aおよび2Bは 、低および高倍率ビューは、私は細胞播種の前にコラーゲンゲル。ウェルの形状は、シリコン原盤上のフィーチャの形状によって決定されます。番目を持ち上げることが重要ですまっすぐコラーゲンから電子PDMSモールド空洞形状を歪曲しないように。 図2Cは、型は長方形の井戸を示し、私は（過剰細.......

Discussion

上記のプロトコルは、事前に定義された形状の同一の上皮組織を生成し、組織内の細胞が経験する機械的ストレスの空間制御を可能にする方法を概説しています。エラストマー型を使用して I 型コラーゲンに空洞を作成し、上皮細胞で満たし、追加のコラーゲン層で覆い、細胞が 3D コラーゲン マトリックス環境に完全にカプセル化されるようにします。これらの組織のさらなる培養と、初期構造からの分岐を誘導するための成長因子による処理により、このシステムは上皮細胞の分岐形態形成の研究に適しています。プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。1つ目は、細胞播種の前に、ゲル化コラーゲンからPDMSモールドをまっすぐ上向きに持ち上げることです。このステップ中に水平方向に移動すると、キャビティが歪み、目的のジオメトリが保持されなくなります。次に、空洞に細胞を播種した後、特に組織に非常に近い場合、パターン化された組織の挙動を妨げる可能性があるため、表面に残っている余分な細胞を注意深く洗い流すことが重要です。ただし、洗浄が厳しすぎると、細胞が空洞から洗い流される可能性があります。最後に、細胞含有コラーゲンゲルを培地に浸漬する最後のマイクロパターニングステップでは、カバ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ポリジメチルシロキサン(PDMS)	エルスワース接着剤	シルガード184
PDMS硬化剤	エルスワース接着剤	シルガード184
リトグラフパターンシリコンマスター	自作	N/A
プラスチック計量ボート	フィッシャーサイエンティフィック	08-732-115
100mmのシャーレ	バイオエクスプレス	D-2550-2
エチルアルコール200の証明	Pharmco-Aaper	111000200
1:1 Dulbeccoの ' と混合することによって70% EtOH (v:v)の解決を作りなさいのモディファイドイーグル」s Medium : ハム's F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1)	Hyclone	SH30023FS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank's balanced salt solution (HBSS)	Life Technologies	14185-052
Insulin	Sigma Aldrich	I6634-500MG
Gentamicin	Life Technologies	15750-060
10x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Fisher Scientific	BP399-500
水酸化ナトリウム (NaOH)	Sigma Aldrich	221465-500G
ウシI型コラーゲン(非ペプシン化)	Koken	IAC-50
ウシ血清(BSA)アルブミン	Sigma Aldrich	A-7906
湾曲したステンレス製ピンセット	デュモン	7
35mm径の組織培養皿	BioExpress	T-2881-6
15 mlコニカルチューブ	BioExpress	C-3394-2
1.5 ml エッペンドルフセーフロックチューブ	USA Scientific	1615-5500
Circular #1 ガラスカバースリップ、直径 15 mm	Bellco Glass Inc.	特別注文
0.05% 1x トリプシン EDTA	ライフ テクノロジー	ズ 25300-054
パラホルムアルデヒド	VWR	100503-916
トリトン X-100	パーキン エルマー	N9300260	洗剤
HGF	シグマ アルドリッチ	H 9661	dH2O で 50 mg/ml で再懸濁
抗マウス FAK 抗体	寿命テクノロジー	AMO0672
ヤギ 抗ウサギ アレクサ 488 抗体	ライフテクノロジー	ズ A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	ピクセル周波数マップの色分けに使用。
FIJI (ImageJ)	NIH	N/A	ピクセル周波数マップを作成するための画像のしきい値処理、登録、オーバーレイに使用される無料の画像解析ソフトウェア。StackReg プラグインは、バイナリイメージの登録に使用されました。