細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

サマリー

この原稿は、細胞外マトリックスに囲まれた定義された幾何学的形状の3次元（3D）上皮組織の均一な配​​列を操作するソフトリソグラフィーベースの技術が記載されています。この方法は、細胞の種類および実験の文脈の多種多様に適していると同一の​​複製のハイスループットスクリーニングを可能にします。

要約

肺、腎臓、乳腺などの分岐器官の構造は、微小環境におけるさまざまな可溶性および物理的シグナルによって調節される分岐形態形成の発達過程を通じて生じます。ここでは、細胞外マトリックス(ECM)内に完全に埋め込まれた、定義された形状とサイズの人工三次元(3D)上皮組織を形成することにより、分岐形態形成のプロセスを研究するために作成された方法を説明します。この方法により、同一の組織のアレイの形成が可能になり、組織の形状、間隔、ECM組成など、さまざまな環境要因の制御が可能になります。この方法は、牽引力顕微鏡(TFM)などの広く使用されている技術と組み合わせて、細胞とその周囲のECMとの間の相互作用についてより多くの情報を得ることもできます。このプロトコールは、がんの浸潤を含む、分岐形態形成以外のさまざまな細胞および組織プロセスを調査するために使用できます。

概要

分枝形態形成として知られている分枝状の上皮組織の発達は、細胞由来の、物理的、及び環境因子によって調節されます。乳腺では、分枝形態形成は、細胞の遊走は、ツリー状のアーキテクチャを作成し、集団導かれ、それを通して反復的なプロセスです。最初のステップは、分岐開始および伸長^1,2に続いて、乳管からの一次芽形成です。周囲の間質への枝の浸潤は思春期でのステロイドホルモンの全身放出によって誘発されます。新しいプライマリ芽は、既存の枝の末端から開始し、このプロセスは、上皮ツリー^3を作成し続けています。多くの重要な生化学的シグナルが同定されているが、この複雑な発達過程を導く細胞生物学的メカニズムの包括的な理解が現在欠如しています。また、特定の手がかりの影響に関するメカニズムの研究はexperiから解体することは困難ですin vivoでのメントは、などの正確な時空間摂動および測定がしばしば可能ではありません。

例えば全器官培養、プライマリオルガノイド、および細胞培養モデルとして3次元（3D）培養技術は、体系的に組織形態形成^4-6のメカニズムを調査するための有用なツールです。これらには、移動、増殖、および分化を含む細胞挙動の様々な、このような機械的な力および生化学的信号として、個別に特定の因子の影響を決定するために特に有用である^。6操作された細胞培養モデル、特に、容易に摂動を可能にします個々の細胞とその微小環境の。

そのような培養モデルは、一貫して再現性Aで誘導された場合、まとめ移行枝を形成する制御3D構造を持つモデル乳腺上皮組織を操作するための微細加工ベースのアプローチを使用していますppropriate成長因子。モデルの主な利点は、正確に操作し、このような高い統計的信頼と機械的ストレスのパターン、などの物理的および生化学的因子の効果を測定する能力です。この技術は、一緒に計算モデルと、既に乳房上皮組織の正常な発達および他方の分岐上皮^7-11の指導における物理的および生化学的シグナルの相対的な寄与を決定するために使用されています。ここに提示することは、容易に細胞と細胞外マトリックス（ECM）ゲルの他のタイプに拡張することができ、これらのモデル組織を構築するための詳細なプロトコルであり、治療の試験のための潜在的なツールとして機能します。

プロトコル

ソリューションの調製

1. インスリンの5 mg / mlで溶液を調製するには、のdH ₂ O（溶媒100ml中に500mgのインスリン）で5 mMの塩酸（HCl）と粉末状のインスリンストックを希釈します。蒸留水100mlに濃塩酸を50μl添加することによって、溶媒100ミリリットル（ _の dH ₂ O）を準備します。
2. PBSの1×溶液を作製するために、無菌条件下でのdH ₂ Oで1Xに10×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）ストック溶液を希釈します。
3. 次のようにポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマー溶液を調製する：1（W：ワット）比10に硬化剤と一緒にPDMSプレポリマーを混合します。
4. 株式ダルベッコ改変イーグル培地の500ミリリットルに：次のように細胞培養培地を準備する栄養混合物F-12（DMEM / F-12）、ゲンタマイシン試薬を500μlを無菌ウシ胎児血清（FBS）の10ミリリットルを追加し、 5 mg / mlとインスリンの500μlの。
5. （W 1％を追加し、1×PBS溶液中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）を調製し：v）のBSA粉末の溶液をPBSを1倍と完全に混合します。
6. 追加、Iコラーゲン中和ウシ型の4 mg / mlで溶液を調製するために、50μlの10倍ハンクス平衡塩溶液（HBSS）バッファー、30μlの0.1 N水酸化ナトリウム（NaOH）、30μlの細胞培養培地、および株式コラーゲン400μlのチルド1.5ミリリットルマイクロチューブへ。上下にピペッティングすることによってゆっくりと混ぜます。気泡を導入しないよう。任意の気泡を除去するために、簡単に4℃で混合物を遠心します。
7. 4（V：V）1×PBS中の16％パラホルムアルデヒド1を希釈することにより固定溶液を準備します。
8. 千（V：V）1×PBSの株式核標識溶液1を希釈することにより、核標識溶液を準備します。
9. 界面活性剤：0.3％（V V）を用いて1×PBSを混合することにより、0.3％のリン酸緩衝生理食塩水および界面活性剤（PBST）溶液を調製します。
10. 0.3％PBSTで：ヤギ血清午前1時10分（V V）を希釈することにより、ブロッキング緩衝液準備します。
11. PRIを希釈することにより、目的の特定のタンパク質に対する一次抗体溶液を準備しますメアリー抗体（例えば、ウサギ抗焦点接着キナーゼ（FAK））1：200（V：V）ブロッキング緩衝液です。
12. ブロッキング緩衝液中：1,000（V V：）蛍光プローブ結合抗体（例えば、ヤギ抗ウサギ）1を希釈することにより、二次抗体溶液を準備します。

3次元マイクロパターニング用エラストマースタンプの作製

注：エラストマースタンプはPDMSで作られています。

1. ステップ1.3で説明したのと同じ比率でPDMS溶液を作製し、十分に混合します。混合プロセス中に導入された気泡を除去するために15〜30分間の真空チャンバ内に混合物を配置します。
2. ボートやリソグラフィで所望の形状の特徴でパターン化されたシリコンマスターを含むペトリ皿の重量を量るプラスチックに脱気した溶液を注ぎます。最良の結果を得るために、12時間〜60℃でPDMSソリューションを治します。
   注：シリコンマスターは、高度にカスタマイズ可能です。このプロトコルは、50の寸法の長方形の構造体を使用していますミクロン×200ミクロン×50ミクロンは200μmの間隔を置いて配置しました。シリコンマスターは、標準的なフォトリソグラフィ技術を用いて作製することができます。簡潔には、エポキシベースのフォトレジストは、シリコンウエハの上にスピンコーティングされます。所望のスタンプ機能を詳述するマスクは、UV光に露光されるフォトレジストでコーティングされたウェハの上に配置されます。マスクによって遮断されない所望の特徴は、光に露出され、フォトレジストコーティングの残りは可溶性であり、洗い流すことができるが、これらの位置でのフォトレジストは、架橋になります。
3. PDMSは、シリコンマスター上で必要な機能の周りに硬化した後、プラスチック容器からPDMSとマスターを削除します。慎重に、シリコンウェハからPDMSを分離し、きれいなカミソリの刃を使用してインプリントされた特徴の周りから余分なPDMSを削除します。
4. 今、かみそりの刃で個々の長方形のスタンプ（〜8ミリメートル×5ミリメートル）にインプリント機能を備えたパターン化PDMSを切りました。 CLEでこれらの機能側を上向きにして保管してください100 mmの直径ペトリ皿。
5. また、長方形のスタンプのための支援を行うためにステップ1.3で説明したPDMSソリューションを使用しています。
6. スピンコーターを用いて、100 mmの直径のペトリ皿に均一にPDMS液〜2-3グラム広げ、ステップ2.1のように60℃〜12時間PDMSを硬化します。そして、カミソリの刃を使用して、長方形にPDMSの薄層（〜5ミリメ​​ートル×2 mm）をカット。
   注：2つの支持体は、ステップ2.3で行われた各PD​​MSスタンプのために必要とされます。支持体は、PDMSスタンプが含まれて100 mmの直径のペトリ皿に格納することができます。
7. PDMSスタンプおよび支持体は、細胞培養に使用する前に、70％エタノールに浸漬することによって殺菌し、安全キャビネット（細胞培養フード）中で吸引器を使用して乾燥させます。

3D上皮組織の調製

1. バイオセーフティキャビネットでは、各スタンプの先頭にPBS中の1％BSAの約50μlとドロップを追加します。ミニ4℃で滴覆われたスタンプを配置しますBSAは、スタンプの表面に吸着していることを確実にするために4時間のお母さん。
2. PDMSスタンプから吸引しBSA溶液。
3. 各洗浄の後に吸引し、細胞培養培地（スタンプにつき1回の洗浄あたり50μlのは十分なものでなければならない）で2回スタンプの表面を洗浄します。
4. 湾曲したステンレス製のピンセットを用いて滅菌PDMSスタンプとサポートを扱います。安全キャビネットでは、それぞれに1つの35 mmの直径組織培養皿にスタンプをPDMSレイアウト。各皿には、PDMSスタンプの長さよりもわずかに小さい距離で分離された2つのPDMSのサポー​​トを下に置きます。
5. ピンセットを使用して、70％エタノールを用いてPDMSスタンプと同数の円形のガラスカバースリップ（直径15mm、＃1）を滅菌します。ピンセットでそれらを保持しながら、カバースリップから過剰な液体を吸引します。独立した100 mmの直径のペトリ皿中で洗浄し、カバースリップを保管してください。
6. 均一にコートにコラーゲン混合物の〜50μLを分注し、それぞれの表面には、スタンプをPDMS。
7. 拾う各コラーゲンでコーティングされたPDMSは、ピンセットでスタンプ、優しくを反転します。 PDMSの上に反転スタンプを下げることの35mm直径組織培養に配置サポートコラーゲンスタンプおよび組織培養皿の底部との間にあるように、皿。 37℃で30分間皿をインキュベートします。
8. 円形のカバースリップの各々の上に残りのコラーゲン混合物の約50μLを分注（以降、これらは完全にコラーゲンでそれらを封入するように操作された組織の上に配置される）、30分間、37℃でそれらをインキュベートします。
9. 〜40％の密集度で上皮細胞（例：EpH4マウス乳腺上皮細胞）を含む100 mmの直径組織培養皿を取得します。細胞培養培地を吸引し、PBS 1×10mlで1回洗浄。細胞にトリプシンの2ミリリットルを加え、5〜10分間37℃でインキュベートします。
10. ディッシュから残りの接着細胞を剥離、トリプシン処理細胞を含有する組織培養皿に新鮮な培地を8 mlを加え。ピペッティングにより穏やかに混合し、5分間、100×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に細胞混合物を移動させます。
11. コニカルチューブから上清を吸引し、細胞培養培地中で細胞ペレットを再懸濁します。血球計数器を用いて、懸濁液の濃度を決定するために、細胞を計数。約10 ^{6〜10 7}細胞/ mlの最終濃度を得るために、懸濁液の体積を調整します。
12. インキュベーターからゲル化コラーゲンサンプルを削除してください。ピンセットを使用して、静かに成形されたコラーゲンからそれらを切り離し、それらを破棄するようにまっすぐ上向きにPDMSスタンプを持ち上げます。
13. 所望の形状の成形キャビティを含む各コラーゲンゲルの表面に濃縮された細胞懸濁液〜30μLを分注します。優しく空洞内沈降細胞を促進するために左右に食器側を振とうしながら10X / 0.25 NAの対物レンズで明視野顕微鏡下で細胞を観察します。空洞は〜5分以内に入力されているはずです。
14. rに、空洞の周りから余分な細胞をemoveその側の各組織培養皿を傾け、静かにコラーゲンゲルの表面上に〜400μlの細胞培養培地を分注します。各洗浄の間に、顕微鏡下でのコラーゲンゲルをチェックし、液体を吸引し、洗浄を1-2回繰り返します。
15. 過剰な細胞は、15分間37℃で細胞培養インキュベーター中に組織培養皿を置き、コラーゲン型のセルが充填されたキャビティの周囲から除去された後。その後、ピンセットを使用して、静かにコラーゲンでコーティングされたクラスのカバースリップを反転し、カバースリップからのコラーゲンが細胞で満たされた空洞上にキャップを形成するように細胞が充填されたコラーゲンの型の上にそれらを置きます。 15分間37℃でサンプルをインキュベートします。
16. コラーゲンキャップは、細胞が充填されたコラーゲンの金型に付着した後、ゲルの上にカバーガラスをかけてゆっくり〜2〜2.5ミリリットルの細胞培養培地を分注します。 1~3日間の培養を37℃でサンプルを。
    注意：24時間の最初の播種後、上皮組織が分岐誘導するために、上皮成長因子（EGF）などの成長因子又は肝細胞増殖因子（HGF）で処理することができます。

4.免疫蛍光および画像解析

1. 組織培養皿から細胞培養培地を吸引し、細胞を含有するゲルをカバーするために十分な固定溶液を加えます。 200rpmでシェーカー上で15分間室温で皿をインキュベートします。
2. 固定液を吸引除去し、1×PBSで組織培養皿を記入し、200rpmでシェーカー上で15分間室温でインキュベートします。合計3回の洗浄のために二回繰り返します。
3. 核を標識するには、次の組織培養皿からPBSを吸引除去し、ヘキスト溶液で交換してください。 15-20分間、室温でインキュベートします。 FAKまたは抗体と検出可能である別のマーカーを染色するには、4.5に進みます。
4. 核標識溶液を吸引し、細胞含有Gを洗いますステップ4.2のように、1×PBSで3回ELS。染色されたサンプルは、さらなる使用まで4℃で、1×PBS中に保存することができます。
5. 、組織培養皿から吸引し、PBS 0.3％PBST300μlのを追加し、室温で15分間サンプルをインキュベート：目的のタンパク質を染色します。
6. 、PBSを吸引ブロッキング緩衝液でゲルをカバーし、約4時間室温でシェーカー（200rpm）しでインキュベートします。
7. 吸引ブロッキング緩衝液は、一次抗体溶液でゲルを覆い、そして4℃で一晩200rpmでシェーカー上でインキュベートします。
8. 一次抗体溶液を吸引0.3％PBST溶液を加え、室温で30分間、200rpmでシェーカー上でインキュベートします。 PBSTを吸引し、3-4時間、30分ごとに繰り返します。
9. 繰り返しは、この時間は、二次抗体溶液とインキュベート、4.7と4.8を繰り返します。二次抗体の退色を防止するためにアルミホイルで組織培養皿をラップします。 FINA後Lの洗浄、染色されたサンプルは、さらなる使用まで4℃で、1×PBS中に保存することができます。
10. サンプルを可視化するために、上皮組織のミッドプレーンに焦点を当て10X / 0.30 NAの対物レンズを使用しています。
11. 細胞核、UV照明の下で10X / 0.30 NAの対物レンズを用いて核マーカーで標識された画像固定したサンプルを可視化するために。
12. 倒立蛍光顕微鏡で10×/ 0.30 NAの対物レンズを用いて目的のタンパク質について染色したサンプル画像を可視化します。
13. 同一の初期形状、最初のインポート標準的な画像分析ソフトウェアを用いて各画像の複数の組織（典型的には50またはそれ以上）のタンパク質染色の周波数マップを作成する（材料を参照）、8ビットグレースケールに変換します。
14. これらの画像の閾値と、グレースケールのカットオフポイントを定義することによって、バイナリ（ すなわち、中間調/黒と白）に変換します。閾値以下のグレースケール値は黒になり、閾値以上のものが白になります。そして、コンバイン単一の画像スタックに個々の二値画像の各。
15. 次に、積層された画像を登録する（ すなわち 、整列したり、それらを一致させる）解析ソフトウェアで。多くの画像解析ソフトウェアパッケージが自由に利用できる登録プラグインが付属しています。
    1. 次の画像の位置合わせのためのテンプレートとして、スタック内の各画像を使用して、スタック全体の画像は、伝播によって整列されるように。最後に、オーバーレイ（プロジェクト）平均強度に基づいて整列された画像スタック内の画像は、ピクセル周波数マップで単一の画像を形成します。この画像は、選択^10,11の画像編集ソフトウェアを使用して色分けすることができます。

結果

乳腺上皮組織の微細化の一般的な概略図

実験作業の流れを概説する微細加工手順の一般的な概略図を図1に示されている。最終的には完全にECMゲル内に埋め込 ​​まれている同一の幾何学的形状及び間隔の上皮組織のアレイです。代表的な実験は、私は4ミリグラム/ mlの濃度でコラーゲンウシ型のゲルで培養EpH4マウス乳腺上皮細胞を使用しています。操作された組織の最高の品質を確保するために、プロトコルで概説技術は密接に従うべきである。型に成形された長方形のウェルのアレイの図2Aおよび2Bは 、低および高倍率ビューは、私は細胞播種の前にコラーゲンゲル。ウェルの形状は、シリコン原盤上のフィーチャの形状によって決定されます。番目を持ち上げることが重要ですまっすぐコラーゲンから電子PDMSモールド空洞形状を歪曲しないように。 図2Cは、型は長方形の井戸を示し、私は（過剰細...

ディスカッション

上記のプロトコルは、事前に定義された形状の同一の上皮組織を生成し、組織内の細胞が経験する機械的ストレスの空間制御を可能にする方法を概説しています。エラストマー型を使用して I 型コラーゲンに空洞を作成し、上皮細胞で満たし、追加のコラーゲン層で覆い、細胞が 3D コラーゲン マトリックス環境に完全にカプセル化されるようにします。これらの組織のさらなる培養と、初期構造からの分岐を誘導するための成長因子による処理により、このシステムは上皮細胞の分岐形態形成の研究に適しています。プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。1つ目は、細胞播種の前に、ゲル化コラーゲンからPDMSモールドをまっすぐ上向きに持ち上げることです。このステップ中に水平方向に移動すると、キャビティが歪み、目的のジオメトリが保持されなくなります。次に、空洞に細胞を播種した後、特に組織に非常に近い場合、パターン化された組織の挙動を妨げる可能性があるため、表面に残っている余分な細胞を注意深く洗い流すことが重要です。ただし、洗浄が厳しすぎると、細胞が空洞から洗い流される可能性があります。最後に、細胞含有コラーゲンゲルを培地に浸漬する最後のマイクロパターニングステップでは、カバ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポリジメチルシロキサン(PDMS)	エルスワース接着剤	シルガード184
PDMS硬化剤	エルスワース接着剤	シルガード184
リトグラフパターンシリコンマスター	自作	N/A
プラスチック計量ボート	フィッシャーサイエンティフィック	08-732-115
100mmのシャーレ	バイオエクスプレス	D-2550-2
エチルアルコール200の証明	Pharmco-Aaper	111000200
1:1 Dulbeccoの ' と混合することによって70% EtOH (v:v)の解決を作りなさいのモディファイドイーグル」s Medium : ハム's F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1)	Hyclone	SH30023FS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank's balanced salt solution (HBSS)	Life Technologies	14185-052
Insulin	Sigma Aldrich	I6634-500MG
Gentamicin	Life Technologies	15750-060
10x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Fisher Scientific	BP399-500
水酸化ナトリウム (NaOH)	Sigma Aldrich	221465-500G
ウシI型コラーゲン(非ペプシン化)	Koken	IAC-50
ウシ血清(BSA)アルブミン	Sigma Aldrich	A-7906
湾曲したステンレス製ピンセット	デュモン	7
35mm径の組織培養皿	BioExpress	T-2881-6
15 mlコニカルチューブ	BioExpress	C-3394-2
1.5 ml エッペンドルフセーフロックチューブ	USA Scientific	1615-5500
Circular #1 ガラスカバースリップ、直径 15 mm	Bellco Glass Inc.	特別注文
0.05% 1x トリプシン EDTA	ライフ テクノロジー	ズ 25300-054
パラホルムアルデヒド	VWR	100503-916
トリトン X-100	パーキン エルマー	N9300260	洗剤
HGF	シグマ アルドリッチ	H 9661	dH2O で 50 mg/ml で再懸濁
抗マウス FAK 抗体	寿命テクノロジー	AMO0672
ヤギ 抗ウサギ アレクサ 488 抗体	ライフテクノロジー	ズ A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	ピクセル周波数マップの色分けに使用。
FIJI (ImageJ)	NIH	N/A	ピクセル周波数マップを作成するための画像のしきい値処理、登録、オーバーレイに使用される無料の画像解析ソフトウェア。StackReg プラグインは、バイナリイメージの登録に使用されました。