イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

サマリー

この研究では、in vitro樹状細胞(DC)を得るためのヒト単球単離の2つの異なる方法を比較しています。単球は接着によって選択されるか、磁気分離によって負に濃縮されます。単球の収量と生存率、および MDDC 生存率、増殖、および CD11c/CD14 表面マーカーの発現を両方の方法間で比較します。

要約

樹状細胞(DC)は、リンパ球の反応、宿主防御機構、および炎症の病因に重要な役割を果たす免疫系の抗原提示細胞です。DCの分離と研究は、その独特の特徴から、生物学研究において重要でした。DCは免疫系の重要なメディエーターですが、血液中では非常にまれであり、全血液単核細胞の約0.1〜1%を占めています。したがって、単離法の代替手段は、末梢血単核細胞(PBMC)から単離された単球からのDCの分化に依存しています。簡便性、手頃な価格、高純度、高収率の細胞を組み合わせた適切な単離技術の利用は、検討することが不可欠です。現在の研究では、DC の生成に関する 2 つの異なる方法が比較されます。単球は、接着によって選択されるか、磁気分離手順を使用して負に濃縮され、その後IL-4およびGM-CSFでDCに分化しました。単球およびMDDCの生存率、増殖、および表現型は、生存率色素、MTTアッセイ、およびイメージングフローサイトメトリーによるCD11c / CD14表面マーカー分析を使用して評価されました。磁気分離法は、接着法と比較して、増殖能の高い単球の割合が有意に高かったが、この知見は、両技術が同時に増殖し、培養中の7日間後に生存可能なCD11c+ MDDCに分化する単球を生成する能力を実証した。どちらの方法も>70%のCD11c+ MDDCをもたらしました。したがって、私たちの結果は、ヒトDCの分離と特性評価のための信頼性の高い方法の開発に貢献する洞察を提供します。

概要

樹状細胞（DC）は、先天性および適応免疫系の重要なメディエーターです。それらは、一次免疫応答を誘導し、免疫記憶の発達を促進するように機能します。これらの細胞は、抗原捕捉、移動およびT細胞刺激の主な原因であり、したがって、DCの.Manipulation異なる治療するための研究分野の広範囲にわたって、臨床設定で利用できる¹とプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）と呼ばれますそのようなHIV ^6,7、癌⁸などの炎症性疾患、自己免疫疾患^9、およびアレルギー応答^10。 DCはまた、アルコール依存^11-14、薬物依存^13,15、及びHIV感染および物質乱用^16-19の組み合わせに関連するものなどの未知のメカニズムおよび経路を解決するために、薬物乱用の研究に使用されています。これらの継続的な研究と今後の調査研究Inは免疫学の分野は、研究のために非常に重要なDCの試験管内世代で行います。総血単核細胞²⁰の1％ -しかし、彼らは0.1を構成するように、ヒトの血液からのDCの単離に関連するいくつかの困難があります。

現在までに、樹状細胞のインビトロ生成のための十分に確立された方法のいくつかは^、22の選別、磁気活性化細胞、蛍光活性化セルソーティングとして単球^21,22のプラスチックまたはガラス付着、密度勾配遠心分離^23、特定のマーカーに基づく分離で構成され^24、デキストラン被覆磁性ナノ粒子^25、および完全に自動化された負の細胞選択^26を使用して高度に精製された単球の迅速な単離を使用して、CD14 +単球の陽性選択。しかし、選択の最良の方法は、議論の余地が。したがって、DCの生成技術を改善するために、いくつかの方法は、開発されていますこれらの細胞の純度が大きく、末梢血単核細胞^（PBMC）27から単離され精製されたCD34 +前駆細胞と単球から分化により増加させることができます。前に述べたように、単球由来樹状細胞（MDDCs）を生成するために広く使用され、人気の方法は、ガラスやプラスチック（接着法^）21,22,27に接着する単球の能力を探ることです。付着方法は、複雑な装置の使用を必要としない迅速かつ簡単な方法です。しかし、この方法のいくつかの欠点は、リンパ球汚染、低柔軟性、および単球過渡操作^28を含みます。付着方法に代わる方法としては、特にネガティブ選択²⁶によってPBMCから単球を単離するために設計されたヒト単球濃縮キットを使用して、総PBMCから単球の磁気分離です。この手順の間、不要な細胞には、四量体による除去の対象とされています抗体複合体とデキストラン被覆磁性粒子。この分離方法の利点は、不要な標識された細胞は、標的細胞が自由に列を必要とすることなく、新たなチューブに注ぎ出しすることができるが、磁石を用いて分離されることです。現在までに、ユニークな細胞集団にラベルを付けることができ、特定のモノクローナル抗体の利用可能性と、磁気分離技術は、単に追加の方法が、免疫学の分野では珍しい細胞の単離の必要はないとなっています。例えば、市販の常磁性MACS-ナノ粒子とソーティングなど磁気細胞などの技術は、研究と臨床応用^22,29のための新たなアプローチの開発を促進しました。さらに、単球の接着およびMACS技術方法からDCの生成を比較した最近の調査研究は、単球^22,30分離MACSを使用して、より高いDC純度および生存率を示しました。

現在の研究のプレゼント市販のヒト単球濃縮キットを使用してネガティブ選択により付着および2）単球の単離によって1）単球の単離：PBMCから単離した単球からのヒトDCの生成のための2つの方法の間の比較。この研究は、接着方法によって単離された単球と比較した場合、単球を単離するためのネガティブ選択磁気分離手順は、単球の生存率に有意な差を有する単球の最も高い収量を生成することを示す証拠を提供します。ターンでは、7日後、磁気分離によって単離された単球は、MDDCの生存率に影響を与えることなく、有意に高い増殖能と二重陽性（のCD11c + / CD14 +）の表現型を発現する細胞の高い量とMDDCsに分化しました。それは同時に、増殖およびCD11cに分化することができる単球を生成するために、両方の技術の能力を実証するため、全体的に、現在の研究では、+上で参照した以前の研究とは異なり彼らの生存能力を損なうことなく、培養中7日後MDDCs（> 70％）。また、現在のアプローチは、フローサイトメトリーを撮像して異なるのCD11c / CD14 MDDCs集団の初回の特徴付けを提供します。

DCは免疫学の分野の研究について焦点役割を果たしているので、それらが誘導されている方法を検討し、どのような方法は、 インビトロでそれらを分離し、培養するために使用されている場合要約すると、異なるパラメータを考慮しなければなりません。そこで、本研究では、二つの異なる単球の単離の方法とどのようにこれらの方法は差動で、最終的に、樹状細胞の生存率、増殖、および表現型に影響を与える単球の生存率および収量に影響を与えるの洞察を提供することを目的とします。これらの知見は、免疫学の分野に大きく貢献するとDCの単離、精製、およびキャラクタリゼーションの詳細なプロトコルを提供します。

プロトコル

全体的にヒト血液の研究をレビューし、IRBプロトコル承認＃のIRB-13から0440 FIUの治験審査委員会（IRB）によって承認されています。ヒトロイコパックは、マイアミ、フロリダ州のコミュニティ血液バンクから購入しました。

標準的な密度勾配法によるPBMCの1の単離

1. T75フラスコ中の1×リン酸緩衝生理食塩水で血液の1希釈：1を実行します。
2. ピペット注意深く15 50mlの遠心分離チューブに密度勾配溶液のmlおよび層 - この傾斜以上希釈血液の（25〜30ミリリットル/チューブ）。
3. 1の加速と0の減速で1200×gで20分間遠心します。
4. 遠心分離後、新しい50mlの遠心分離チューブに界面層（白血球）を収集し、PBSで2回（1,080×gで3分間）で細胞を洗浄します。毎回上清捨てます。
5. 塩化アンモニウム - カリウム溶解（ACK）緩衝液で細胞を治療する（赤血球を溶解するために）。バッファのとで10ミリリットルを追加します。4℃で15分間cubate。
6. 、PBSで2回細胞を洗浄1080×gで3分間遠心分離し、上清を毎回捨てます。
7. PBMCをを含んでなる、ペレットを保存します。
8. 選択した単球の精製方法に進みます。

アドヒアランス法による2.単球精製

1. L-グルタミン（300 mg / mlで）を含有する完全な細胞培養培地を準備し、ペニシリン（50 U / ml）を-streptomycin（50μg/ ml）および10％ウシ胎児血清を補充しました。
2. PBMCを、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO ₂で、完全培地10mlあたり5×10 ⁷細胞の濃度で、T75フラスコ中でそれらを培養することにより、約2時間接着させます。
3. インキュベーション後、培養フラスコからの非付着、浮遊細胞を除去し、穏やかにPBSで2回付着細胞を洗浄します。
4. ヒト顆粒-MACRを2μl/ mlを添加した完全細胞培養培地中で接着細胞をインキュベート10μg/ mlのストック濃度で保存ophageコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン4（IL-4）。
5. 培地の半分を変更し、サイトカインごとに48時間を補充します。
6. MDDCsへの単球の分化のために7日 - 5許可します。

磁気分離法による3単球の精製

1. 標準的な密度勾配技術からのPBMCを収集し、細胞/ mlの濃度でPBS緩衝液中の5 mlのポリスチレンチューブに注ぎ、再懸濁します。
2. 、50μlの/ mlの細胞を用いたヒト単球濃縮カクテルを追加し、よく混ぜ、10分間4℃でインキュベートします。
3. インキュベーション後、50μlの/ mlの細胞を用いて磁性粒子を追加し、よく混ぜ、5分間4℃でインキュベートします。
4. PBS緩衝液を添加することにより、2.5ミリリットルの全体積に細胞懸濁液を起動し、ピペッティングにより2ダウンよく混ぜる - 3回。
5. 磁気デバイスにキャップなしでポリスチレンチューブを置き、2 RTで取っておきます。5分。
6. インキュベーションの後、連続した1つの動きで、磁石をピックアップし、クリーン50ミリリットルの遠心分離管に目的の精製された単球画分を注ぎます。
7. 10μg/ mlのストック濃度で保存されたヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン4（IL-4）を2μl/ mlを補充した完全細胞培養培地中で接着細胞を培養します。
8. 48時間ごとに、培地の変更の半分は、新しいメディア（cRPMI中）およびサイトカインで5分間、1080×gでスピンダウンし、再サスペンドペレット。
9. MDDCsへの単球の分化のために7日 - 5許可します。

4.トリパンブルー排除生存率アッセイ

注：PBMCを、単球、およびMDDCsの細胞収率および生存率を得るために、この技術を使用してください。

1. 標準トリプシン-EDTAを用いてフラスコ及びPBSを用いて細胞ペレットの洗浄を行い、収穫細胞。ペレットの大きさに応じて、再ペレットを溶解するためにPBSの5〜10ミリリットルに懸濁。
2. 希釈した細胞ペレットとトリパンブルー試薬の1希釈：マイクロ遠心管では、1を実行します。
3. このミックスから、アリコート10μlの細胞計数スライドにし、製造業者のプロトコルに従って自動細胞カウンターを使用して結果を読み取ります。自動細胞カウンターを使用できない場合は、同様の細胞数は、血球計または手動カウンターを使用して可能です。

5. MTTアッセイ

1. 96ウェルプレート中の完全培地4×10 ^4個 /100μlの濃度でプレートの細胞を各ウェルに。細胞が培養液に調整するための24時間を許可します。
2. インキュベートし、それぞれ0（0日）、36（3日目）および84（7日目）時間で読み取りを行います。
3. 希望のインキュベーションの終了時に、メディアを取り出し、単独で100μlのPBSと交換してください。
4. 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド溶液（MTT）（5mg / ml）をdimethを10mlを添加することにより調製しますドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を1gにイルスルホキシド（DMSO）。
5. 各ウェルにMTT溶液10μl（5 mg / mlで）を追加し、さらに2時間37℃でインキュベートします。
6. インキュベーション後、PBSおよび未変換MTT混合物（黄色液）を含有する上清を除去します。
7. 各ウェルにSDS-DMSO溶液100μlを加え、さらに1時間インキュベートします。
8. マイクロプレートリーダーを用いて540 nmの吸光度を読みます。

6.細胞表面イメージングフローサイトメトリーによる染色分析

1. 精製した単球からの分化の7日後に1.5 mlチューブの適切な数への単球由来樹状細胞の1×10 ⁶細胞のアリコートを分配します。
2. 熱不活性化50μlの（HI）ヒト血清を用いてブロッキング細胞による細胞表面染色を開始し、4℃で10分間インキュベートします。
3. インキュベーション後、5分間720×gで遠心分離細胞は、上清を捨てます。
4. セルPELLEへtは、それぞれの蛍光標識抗体（ 例えば、抗CD11cのまたは抗CD14）を追加し、光から保護し、20分間4℃でインキュベートします。彼らは、補償のために必要とされているので、別々のチューブでは、）は、単一の蛍光色素染色したサンプル/ mlのを準備します。
5. インキュベーション後、5分間720×gでPBS緩衝液遠心1mlの各時間で細胞を2回洗浄します。
6. 光から保護された細胞を維持、フローサイトメトリー分析のための細胞/ 100μlの濃度でPBS緩衝液中に再懸濁します。
7. 生存細胞上にゲートするためには、事前の製造元の指示に従った器具サイトメトリ単一細胞イメージングフローに細胞を取得する各チューブにDAPIの1μlを添加します。

7.統計分析

1. 入力スプレッドシート内のすべてのデータ。
2. 必要に応じてスチューデントのt検定および/または一方向ANOVAを使用して結果を比較してください。

結果

磁気分離により単球の収量は遵守法による単球の収量に比べて高いです

PBMCおよび単球の分離の分離の日にトリパンブルー排除法により図1の表示PBMCおよび単球細胞数で示されたデータ。磁気分離により単離された単球がPBMCの最大25％を占めながら、平均して、接着方法によって単離された単球は、全PBMCの約6.2％を占めました。統計分析は、磁気分離により得られた単球の割合が著しく高い（≥4倍）​​であることを明らかにしました。データは少なくとも3回の独立した実験の平均±SDとして表されます。両方の方法（0.0005≤p）を比較する場合、単球の収量の有意な差が認められた検定スチューデントのtを使用して統計分析。

1 "> 単球の単離順守によって、および磁気分離によって単球生存率に影響を与えません ：「キープtogether....

ディスカッション

単離したヒト血液からMDDCsを生成する既知の難しさに基づいて、本研究はMDDCsを生成するための2つのよく確立された方法の総合的な比較を提供することを目的としました。比較第一の方法は、ガラスやプラスチック（接着法^）21,22,27に接着する単球の能力を活用することによってMDDCsを生成するための十分に確立された伝統的な方法です。付着方法は、迅速かつ費用効果的であり、複雑な装置の使用を必要としません。しかし、この方法のいくつかの欠点は、リンパ球汚染、低柔軟性、単球過渡操作^22,30,31が含まれます。比較して第二の別の方法は、ネガティブ選択によりPBMCから単球を単離するために設計されたヒト単球濃縮キット^26を使用して^、全末梢血単核細胞（PBMC）からの単球の磁気分離です。この分離方法の利点は、不要な細胞であります標識した標的細胞を自由に列を必要とせずに直接抗体で細胞を標的とすることなく、新たなチューブに注ぎ出している間に磁石を用いて分離されます。かかわらず（磁気分離対付着）単球の単離方法の、両方の手順の後に、プロトコル内の重要な...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	RTで使用する必要があります
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Life Technologies	10010-023
ACK Lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
RPMI 1640 medium	Life Technologies	22400-089
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240-062
ウシ胎児血清 (FBS)	Life Technologies	16000-044
RoboSep buffer	StemCell	20104
EasySep ヒト単球濃縮キット	StemCell	19059
TC20 自動セルカウンター	Bio-Rad	145-0101
FITC-Dextran	Sigma Aldrich	FD4-100MG
トリパンブルーステイン(0.4%)	Life Technologies	15250-061
Synergy 2マルチモードリーダーBiotek		7131000
XTTナトリウム塩バイオ試薬(XTT)	シグマアルドリッチ	X4626-100MG
ジメチルスルホキシドバイオ試薬(DMS)	シグマアルドリッチ	D8418-500ML
チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド(MTT)	シグマアルドリッチ	m5655-500MG
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	バイオ・ラッド	161-0302
フェナジンメトサルフェート (DMSO)	Sigma Aldrich	P9626-1G
不活化 (HI) ヒト血清	Chemicon	S1-100ML
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Accuri	653119
FlowSight Amnis Flow Cytometer	EMD Millipore	100300