量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

Summary

量子ドット(QD)ナノ粒子をエポキシ包埋ヒト病理組織の相関免疫細胞化学的研究に使用できる方法が説明されています。私たちは、広視野蛍光光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡で可視化される市販の抗体フラグメント標識量子ドットを採用しています。

Abstract

量子ドット（QD）ナノ粒子は、広視野蛍光光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて、ヒト病理組織の相関免疫細胞化学的研究のために使用することができる方法が記載されています。ストレプトアビジンコンジュゲートさ585 nmのカドミウムセレン（CdSeの）量子ドット（QD）とビオチン化二次抗体および可視化に続いて、我々はソマトスタチンに対する一次抗体を用いて、ヒトソマトスタチン腫瘍の超薄エポキシセクションを免疫標識されているプロトコルを、実証するために。切片を次に、広視野蛍光光学顕微鏡による観察のためにスライドガラス上に載置されたTEM試料グリッド上に搭載されています。光学顕微鏡は、腫瘍細胞の細胞質内の顆粒状のパターンを形成する明るいオレンジ色の蛍光として585 nmのQDラベルを明らかにする。ミッドレンジ拡大を低で光学顕微鏡により標識パターンを容易に認識することができ、非特異的またはバックグラウンドの標識のレベルを評価しました。これは非常に重要ですその後のTEMによる免疫標識パターンの解釈及び形態学的状況の評価のためのステップ。同じセクションは、その後、乾燥ブロットし、TEMにより観察されます。 QDプローブは、個々の分泌顆粒に含まれる非晶質材料に取り付けられるように見られています。画像は、相関分析のための光学顕微鏡で見て興味（ROI）の同じ領域から取得されます。各モダリティからの画像を対応する、次に対応する領域のTEM超微細構造上の蛍光データをオーバーレイするために配合することができます。

Introduction

相関軽および電子顕微鏡（CLEM）は、過渡ダイナミックイベント^1、まれな事象^2、3、複雑なシステム⁴の分析のための強力なアプローチです。一般的な要件は、単一の試料⁶の同じ構造が複数の顕微鏡モダリティにより撮像されることがあるが提起された課題に応じて^、5利用可能な多くの異なる技術的な順列があります。 CLEMに対する当社の特定のアプローチは、アーカイブヒト病理組織の研究と十分に特徴付けられ^、7以前に公開されている、ここで使用される場合のために開発されました。目的は、超微細構造レベルで見られる免疫細胞化学標識パターンの文脈を理解しやすくするために、蛍光光学顕微鏡を使用すること、第二に、単一の生検または外科的サンプルから分析データを最大化するために、まずました。

量子ドットナノ結晶（量子ドット）は、ユニバーサルマーカーシステムABLの可能性を提供しますeは両方によって観察される、蛍光光学顕微鏡および電子顕微鏡^{8、9、10。}それらの結晶コア構造は、それらの発光スペクトル¹¹から遠い波長の光によって励起されると、異なるサイズの量子ドットは、蛍光発光ピークの広い範囲を生成することができます。それらの原子量は、透過型電子顕微鏡、走査型透過電子顕微鏡（STEM）や電界放射型走査電子顕微鏡によって検出可能な電子密度をもた....

Protocol

1.組織の解剖と固定

1. 組織切開
   1. 外科的に切除腫瘍標本または組織生検からの組織片を解剖。
      注：この研究で使用した組織は、日常的にホルマリン中に固定したが、新鮮な組織にも適しています。私たちは確認エリアを選択し、日常的な組織学的染色および抗ソマトスタチン免疫染色（図示せず）の後ソマトスタチン産生腫瘍を含むように、解剖学的病理学者によって報告します。
   2. 約1.0ミリメートル³よりも大きくない組織片を使用してください。
2. カコジル酸バッファーの準備
   1. カコジル酸ナトリウム21.4グラム（マテリアルのリストを参照）と蒸留水90mlの1％の塩化カルシウム溶液3.0 mlで添加した後、100 mlの最終容積に溶液を補充することによってストック緩衝溶液（1 M）を準備します。ソリューションを撹拌し、結晶化試薬が完全に溶解するように、一晩放置することにしておきます。
   2. は水170ミリリットルに原液の20ミリリットルを追加し、インジケーターストリップでpHをチェックすることにより、緩衝作業溶液を準備します。 3％のHCl 4滴 - 3の添加によりpHを7.4に調整します。 0.1 Mの最終モル濃度で200mlの最終体積に対する解決策をトップ
3. 固定剤の調製および使用

Results

この研究のために使用されるソマトスタチノーマ腫瘍試料は、コラーゲンストーマ組織と混合管構造を形成する腫瘍細胞を含んでいました。蛍光光学顕微鏡によって、豊富な分泌顆粒に含まれる個々の腫瘍細胞は、ソマトスタチンホルモン陽性の標識化を示しました。核は、最小限の非特異的標識の検出可能（ 図1）のように暗い穴が登場しました。低倍率で、可変強い粒状橙色蛍光は、これらのよく特徴付けられた腫瘍細胞の細胞質に見られました。蛍光のオレンジ色が使用されるQDの大きさによって決定されました。この研究のために、我々は、365 nmの光で励起したとき、オレンジ色信号を発する585 nmの量子ドットを使用していました。

同じセルのCLEM分析は（ 図2）が可能でした。 TEMの関心領域を認識することを許可審査とイムのために光学顕微鏡で見たときと同じグリッドを使用して、両方のモダリティで熟成。光学顕微鏡で見られるよう.......

Discussion

この研究は、CLEM研究のためのユニバーサルプローブとしてQDの潜在的有用性を実証してきました。使用される585 nmのQDナノ粒子は、広視野光顕微鏡で見たときに明るく安定した蛍光を示し、容易にTEMにより観察しました。本著者の一つ前の研究では、超解像光学顕微鏡⁷に適するように量子ドットを示しています。その光安定性、拡張視聴期間と長いイメージング・エクスポージャーのために特に有用でした。 QDは、異なるサイズのプローブが同時に同一の励起波長下で異なる色のスペクトルを放出すると、多重免疫組織化学のために使用することができます。

QDは、TEMによって可視化されるのに十分な原子量を有するが、これは使用されるナノ粒子の大きさに応じて挑戦されることが見出されました。光学顕微鏡のために、我々は525 nmの量子ドット（緑）が大きく585nmの（オレンジ）と655 nmの（赤）の形態に比べて少ない背景ラベルを生成することを見出しました。しかし、我々は、TEMにより、標識のより便利な可視化を可能にするために、本研究では、より大きな585 nmのQDを使用することにしました.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ナトリウム カコジル酸	Proscitech	C0205	有害な化学物質
四酸化オスミウム	Proscitech	C010	ヒュームフードでのみ使用
酢酸ウラニル	Univar-Ajax	569	危険な化学
薬品 エタノール 100%	フロニン	JJ008
アセトン 100%	フロニン	JJ006
ERL 4221	Proscitech	C056
DER 732	Proscitech	C047
NSA	Proscitech	C059
DMAE	Proscitech	C050
メタ過ウ素酸ナトリウム	Analar BDH	10259
抗ソマトスタチン抗体	Dako	A0566
抗体希釈剤	Dako	S3022
Qdot® 585 ストレプトアビジン複合体	Invitrogen	Q10113MP
ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG抗体	Sigma	B7389-1ML
グルタルアルデヒド 50%	EMS	16320
正常なヤギ血清	Invitrogen	PCN5000
PBS "Dulbecco A"	Oxoid
BSAc (10%)	Aurion	900.022
Parafilm	Pechiney PP	M
pH 指示薬ストリップ (pH 2.0 - 9.0)	Merck	1.09584.0001
Micromoulds	Proscitech	RL063
ダイヤモンド ナイフ	Diatome	Ultra 45
透過型電子顕微鏡	FEI	Morgagni 268D
蛍光光学顕微鏡	Carl Zeiss	Axioscope A1
Grids 300 mesh ニッケル (細いバー)	Agar Scientific	G2740N
Ultramicrotome	RMC	Powertome
TEM カメラ制御ソフトウェア	ソフトイメージングシステム	AnalySIS	Version 3.0
画像処理ソフトウェア	Adobe SystemsPhotoshop	CS2