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方法論記事

量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

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DOI:

10.3791/54307

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2016年8月7日

 , 
1South Western Sydney Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia, 2School of Medicine, Western Sydney University, 3Correlative Microscopy Group, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Electron Microscopy Laboratory, Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service, New South Wales Health Pathology, 5School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia

この記事について

サマリー

量子ドット(QD)ナノ粒子をエポキシ包埋ヒト病理組織の相関免疫細胞化学的研究に使用できる方法が説明されています。私たちは、広視野蛍光光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡で可視化される市販の抗体フラグメント標識量子ドットを採用しています。

要約

量子ドット（QD）ナノ粒子は、広視野蛍光光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて、ヒト病理組織の相関免疫細胞化学的研究のために使用することができる方法が記載されています。ストレプトアビジンコンジュゲートさ585 nmのカドミウムセレン（CdSeの）量子ドット（QD）とビオチン化二次抗体および可視化に続いて、我々はソマトスタチンに対する一次抗体を用いて、ヒトソマトスタチン腫瘍の超薄エポキシセクションを免疫標識されているプロトコルを、実証するために。切片を次に、広視野蛍光光学顕微鏡による観察のためにスライドガラス上に載置されたTEM試料グリッド上に搭載されています。光学顕微鏡は、腫瘍細胞の細胞質内の顆粒状のパターンを形成する明るいオレンジ色の蛍光として585 nmのQDラベルを明らかにする。ミッドレンジ拡大を低で光学顕微鏡により標識パターンを容易に認識することができ、非特異的またはバックグラウンドの標識のレベルを評価しました。これは非常に重要ですその後のTEMによる免疫標識パターンの解釈及び形態学的状況の評価のためのステップ。同じセクションは、その後、乾燥ブロットし、TEMにより観察されます。 QDプローブは、個々の分泌顆粒に含まれる非晶質材料に取り付けられるように見られています。画像は、相関分析のための光学顕微鏡で見て興味（ROI）の同じ領域から取得されます。各モダリティからの画像を対応する、次に対応する領域のTEM超微細構造上の蛍光データをオーバーレイするために配合することができます。

概要

相関軽および電子顕微鏡（CLEM）は、過渡ダイナミックイベント1、まれな事象2、3、複雑なシステム4の分析のための強力なアプローチです。一般的な要件は、単一の試料6の同じ構造が複数の顕微鏡モダリティにより撮像されることがあるが提起された課題に応じて、5利用可能な多くの異なる技術的な順列があります。 CLEMに対する当社の特定のアプローチは、アーカイブヒト病理組織の研究と十分に特徴付けられ、7以前に公開されている、ここで使用される場合のために開発されました。目的は、超微細構造レベルで見られる免疫細胞化学標識パターンの文脈を理解しやすくするために、蛍光光学顕微鏡を使用すること、第二に、単一の生検または外科的サンプルから分析データを最大化するために、まずました。

量子ドットナノ結晶（量子ドット）は、ユニバーサルマーカーシステムABLの可能性を提供しますeは両方によって観察される、蛍光光学顕微鏡および電子顕微鏡8、9、10。それらの結晶コア構造は、それらの発光スペクトル11から遠い波長の光によって励起されると、異なるサイズの量子ドットは、蛍光発光ピークの広い範囲を生成することができます。それらの原子量は、透過型電子顕微鏡、走査型透過電子顕微鏡（STEM）や電界放射型走査電子顕微鏡によって検出可能な電子密度をもたらすのに十分です。単一量子ドットは、標的分子12ごとにQDの最終的な感度を与える観察され得るように、それらは、特に免疫細胞化学研究に適しています。さらに、QDに応じて、それらがマッピングするのに適した個々の元素シグネチャーを有することができる使用しました。

ヒト病理サンプルは、翻訳生物医学研究のための重要な利点を提供します。外科的組織生検サンプルが日常的にバイオバンクのためにとappropに提出されますriate倫理クリアランスは、調査研究のためにアクセスすることができます。ヒト組織は、動物においてまたは疾患のインビトロモデルで発生する可能性があります関連性や解釈の問題を持っていません。しかし、病理試料の試料調製は、しばしば最適ではありません。不適切な固定液は、ホルマリンではなく、TEMや不適切なサンプリングのためのグルタルアルデヒドとして使用する固定液中に配置されている組織の遅れ、がある場合もあります。 CLEM法は、単一のヒトのサンプルから利用可能な診断および予後情報を最適化する可能性を秘めています。しかし、このようなミニ一重項酸素発生器（miniSOG）を用いたものなど、いくつかの新たに開発された相関アプローチが原因で、遺伝的に興味13の細胞内に符号化されるべきタグの必要性への病理学で使用することはできません。このような理由から、我々は相関免疫細胞化学的研究のための日常準備TEM組織のQD標識の有用性を検討しています。李からエッチングされたエポキシ樹脂またはアクリル樹脂のセクションに適用される量子ドットghtlyアルデヒド固定生検および組織サンプルは、単一のサンプルから相関蛍光光学顕微鏡とTEMデータを得る可能性を提供します。

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プロトコル

1.組織の解剖と固定

  1. 組織切開
    1. 外科的に切除腫瘍標本または組織生検からの組織片を解剖。
      注：この研究で使用した組織は、日常的にホルマリン中に固定したが、新鮮な組織にも適しています。私たちは確認エリアを選択し、日常的な組織学的染色および抗ソマトスタチン免疫染色（図示せず）の後ソマトスタチン産生腫瘍を含むように、解剖学的病理学者によって報告します。
    2. 約1.0ミリメートル3よりも大きくない組織片を使用してください。
  2. カコジル酸バッファーの準備
    1. カコジル酸ナトリウム21.4グラム（マテリアルのリストを参照）と蒸留水90mlの1％の塩化カルシウム溶液3.0 mlで添加した後、100 mlの最終容積に溶液を補充することによってストック緩衝溶液（1 M）を準備します。ソリューションを撹拌し、結晶化試薬が完全に溶解するように、一晩放置することにしておきます。
    2. は水170ミリリットルに原液の20ミリリットルを追加し、インジケーターストリップでpHをチェックすることにより、緩衝作業溶液を準備します。 3％のHCl 4滴 - 3の添加によりpHを7.4に調整します。 0.1 Mの最終モル濃度で200mlの最終体積に対する解決策をトップ
  3. 固定剤の調製および使用
    1. カコジル酸ナトリウム原液（1 M）の20ミリリットルの50％グルタルアルデヒド溶液の1 10ミリリットルのアンプルを追加します。 190ミリリットルの蒸留水でトップ。 pH値をチェックし、1加えることによって、7.4に調整 - 必要に応じて3％塩酸（HCl）の4滴を。
    2. 200ミリリットルの最終容量を作るために蒸留水でトップ。
    3. ガラス試料管4 O Cで24時間、0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液pH7.4中の2.5％グルタルアルデヒドを含む固定液中で組織を浸します。 1週間後、未使用の固定液を捨てます。

2.組織処理と埋め込み

  1. オスミウムテトロ過去を殺した男xide染色
    1. 固定が完了した後、次にさらに20分間繰り返し20分間、カコジル酸ナトリウム緩衝液（0.1 M）の組織を浸します。
    2. の最終容量を作るためにカコジル酸ナトリウム緩衝原液（1 M）の2.0ミリリットルの蒸留水10.0ミリリットルに5％のOsO 4ストック溶液の8.0ミリリットルを添加することにより、2％水溶液四酸化オスミウム（OsO 4）作業溶液を準備20.0ミリリットル。
    3. 室温で4時間、pH7.4で2％のOsO 4で組織を浸す、バッファを削除してください。
      デカンテーションとのOsO 4溶液を調製する際に注意！すべての回でドラフト内で適切な個人用保護具と仕事を着用し、十分注意してください。
  2. ウラニル酢酸染色
    1. 組織オスミウム酸染色法が完了した後、のOsO 4溶液を除去し、10分間、2％酢酸ナトリウムで組織を浸します。で1時間、2％酢酸ウラニル中に浸漬後、2％の酢酸ナトリウムを除去します室温。
  3. 脱水
    1. 段階的なアルコールを通して組織を脱水。 10分間、10分間、70％エタノール、10分間、室温で20分間、100％エタノールの二つの変更のために、95％エタノール、50％エタノールを使用します。
    2. 30分ごとに、100％アセトンの2つの変更を行います。
  4. 樹脂含浸および硬化
    1. 使い捨てポリエチレンカップに低粘度のエポキシ樹脂を混合します。ビニールシクロヘキセン二酸化（ERL 4221）エポキシモノ​​マーの10.0グラム、ポリプロピレングリコールのジグリシジルエーテルの6グラム（DER 732）とノネニル無水コハク酸（NSA）の26.0グラムを追加します。 2分間の木の棒を用いて手で十分に攪拌します。
    2. 2-ジメチルアミノエタノール（DMAE）エポキシ加速器の15滴を追加し、再度2分間攪拌します。完全DMAEアクセラレータを追加する前に、ERL、DERとNSA成分を混合するように注意してください。
    3. 1樹脂：1と100％アセトンを置換することによって、組織の樹脂含浸を開始3時間アセトンに1樹脂、及び一晩最終的に100％樹脂：アセトン1時間、その後6と交換してください。
    4. 8ミリメートルのmicromouldsに新鮮な樹脂に組織を転送します。 70°Cの一晩で硬化。樹脂は、硬化後の脆性、ハードではなく、あるべきです。

3.超薄切片

  1. ナイフ、カッティングパラメータと切片厚
    1. ウルトラミクロトームで半薄ダイヤモンドナイフを置き、500nmの厚さで組織の切片を切りました。
    2. ナイフエッジの背後に水浴上にセクションをフロート。スライドガラス上のセクションをピックアップし、10〜20秒のためにそれらをドライダウンホットプレートを使用して、約110℃。
    3. 20秒間ナトリウムエトキシド溶液でセクションをエッチングし、その後、100％エタノール、次いで蒸留水で洗い流し。 5秒間ホットプレート上で5秒、乾燥のために水道水ですすぎ、ホットプレート上で20秒間、1％のホウ砂中の2％メチレンブルーで染色。そして、STAI20秒間ホットプレート上で、その後の乾燥5秒間ホットプレート上で1.5％塩基性フクシンのn。
    4. 明視野光学顕微鏡により検査した腫瘍細胞と関心領域（ROI）は、セクションに存在していることを確認します。
    5. 極薄ダイヤモンドナイフに半薄ダイヤモンドナイフを変更し、ナイフメーカーによって推奨されているように、正しいナイフ角と切削速度を設定します。
    6. 90 nmの厚さで超薄のセクションをカット。水浴上でフローティングセクションの金の着色を観察します。
    7. ストレッチやセクションの数ミリメートル内の濾紙1cm 2の片からクロロホルム蒸気を振ってセクションを平らに。水の表面に接触さクロロホルム浸した紙を持参しないように注意してください。
  2. 超薄型セクショングリッド取り付け
    1. セクションadhesiv中に浸漬された300メッシュの薄いバーニッケルTEMグリッドを使用して、水面から超薄切片を持ち上げ電子ソリューション。グリッドの鈍い側のセクションを見つけます。グリッドは1側と反対側の研磨又は光沢のある表面に鈍いまたはマットの表面を有します。いいえ支持フィルムは必要ありません。注：鉗子に付着グリッドを回避するために、抗磁気鉗子でこれらのグリッドを処理するために必要です。
    2. アセトンの2.0ミリリットルでバイアルmlの5で明らかに粘着テープ20cmのを配置することによって、セクション接着剤を準備します。キャップとバイアルを振るには、接着剤溶液を残してテープを取り出した後、10分間放置しました。

4.免疫標識

  1. 抗原アンマスキング
    1. 蒸留水に新鮮な飽和メタ過ヨウ素酸ナトリウムのエッチング液の1ミリリットルを用意し、すぐにそれを使用しています。きれいなlabfilm表面上のエッチング液の液滴を配置します。
    2. 30分間室温でダウンメタ過ヨウ素酸ナトリウムの溶液の液滴のセクションで完全に乾燥したグリッドを配置します。蒸留水のDROにグリッドを移し洗濯の60秒間plets。
  2. 抗体インキュベーションおよびQDプローブのラベリング
    1. きれいなパラフィルム表面上に配置された溶液の液滴上のすべてのインキュベーションおよびラベリングを実行します。
    2. セクション内の残留アルデヒドをブロックするために10分間、PBS中の0.05 Mグリシンの液滴上のグリッドを配置します。簡単にグリッドの端をブロッティングによりアルデヒドブロックを削除します。
    3. 1％正常ヤギ血清（NGS）の液滴にグリッドを置き、10分間、PBS中の1％BSAC（10％）。千μlの最終体積を与えるためにPBSの890μlにNGSを10μlとBSAC100μlを加えることによって、ブロッキング溶液を準備します。
    4. 10分間、抗体希釈液の液滴上に配置することによって、セクションを調整します。
    5. 抗体希釈液は、3.47グラム/ Lの濃度を与えるで1:10希釈した抗ソマトスタチンポリクローナル抗体を用いた免疫標識インキュベーションを行います。注：抗体のインキュベーションは室温temperatで1時間、液滴にグリッドを配置することによって行われます湿ったチャンバー内でURE。
    6. その後、2×5分間の希釈剤に関するセクションを洗うグリッドの縁をブロッティングすることにより、ステップ4.2.5からの抗体試薬を除去。
    7. 室温で1時間1:10に希釈した二次抗体（ビオチン化ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体）においてインキュベートします。二次抗体溶液を除去します。 2×5分間の希釈剤で洗浄します。
    8. 室温で1時間、1：10に希釈したストレプトアビジン共役量子ドット（585 nm）の中でインキュベートします。インキュベーション中に露光を減らすためにアルミホイルで覆います。
    9. 2分間新鮮な蒸留水にグリッドを洗います。グリッド・乾燥の縁を吸い取ります。

5.蛍光光学顕微鏡

  1. 光源とフィルターキューブ
    1. 広視野蛍光光学顕微鏡用の365 nmの発光ダイオード（LED）照明を使用してください。次の特性を持つフィルターキューブを挿入します（例G 365nmで、BS FT 395とEM LP 420 nm）を。
      注：このフィルターキューブワット病気同じ励起波長下で同時に視覚化するために、すべての量子ドットサイズの発光スペクトルを可能にします。
  2. 表示およびイメージングセクション
    1. 水の液滴にダウンスライドガラス上の免疫染色グリッド部を配置し、ガラスカバースリップ（厚さ数1.5）でカバー。 、標識パターンを評価するために、光学顕微鏡を使用して、任意の非特異的標識化のレベルおよび陰性対照は、標識の明確であることを確立します。
    2. グリッドバーに関連してROIを識別します。ファインダグリッドは、標的構造の座標を確立するために有用であり得ます。
    3. 「FLオートカラー」と3,200Kに設定された「ホワイトバランス」でのカメラ設定でフルカラーデジタルカメラを使用してセクションに正の標識の画像を取得します。 1倍に設定された画像の外観と「アナログゲイン」を最適化するために、0.45と1.00の間で「ガンマ」の設定で「自動露出」モードでカメラを使用してください。禅2 Liteソフトウェアでカメラアイコン「ライブ」へのグラフィカルインターフェイスをクリックし、フレームストアにイメージをキャプチャする「スナップ」をクリックして画像の焦点を合わせます。
    4. 明らかになってきて圧縮し、ピクセレーションを避けるための.tifファイルとして画像を保存します。
    5. グリッドバーやその他の重要な組織のランドマークに関連したROIの位置を示す印刷を準備します。これらの印刷物は、透過型電子顕微鏡（TEM）によって部分と再発見ROIの後続のナビゲーションのために有用であろう。
    6. 、スライドからグリッドを取り外し、蒸留水で洗浄し、軽くドライエッジをブロット。
      注：蛍光画像を取得するために過度に強烈な照明を使用しないでください。量子ドットの光安定性は、最大数秒の撮像時間を可能にするが、QD信号の消光として露出を延長しないように注意してください、水に約1分後に発生する可能性があります。 QDは、セクションでは、トルエンで脱水している標識されたときに拡張または永久的な光安定性しか得られ、メーカーの仕様どおりにカバースリップの下に埋め込まれました。しかし、このプロセスは、次にTEMによる同項の相関検査の可能性を排除します。

6.透過型電子顕微鏡

  1. TEMの設定と表示
    1. 100キロボルトの加速電圧を使用して、検査のためにTEMにグリッドを転送します。グリッドを移動し、光学顕微鏡の景色と相関のROIを見つけるために、約1,400Xの低倍率を使用してください。 50,000X周りの倍率での量子ドットの表示クラスター。
    2. 個々の量子ドット70,000Xの倍率で以上を守ってください。中程度の電子密度を有する不規則な結晶構造として量子ドットを観察します。
  2. イメージング
    1. TEM画像化のためのデジタルカメラを使用してください。モノクロ1392 X 1040ピクセルセンサーで十分です。
    2. MICRで「オン」に「カメラ」アイコンをクリックして画像を取得その後、「オフ」フレームストアに画像を保存するために、イメージングソフトウェアのグラフィカルインタフェースをOSCOPE。注：これらの操作は、使用されている顕微鏡システムに応じて異なります。 1.00の「ガンマ」設定で自動露出モードでカメラを使用してください。
    3. .tifファイルとして画像を保存します。

7. CLEMイメージング

  1. TEMによる蛍光ROIの検索
    1. TEMにより、対応する関心領域を特定するために光学顕微鏡像から印刷を使用してください。このような血管および管腔構造などの組織アーキテクチャの特徴は、TEMを使用してセクションの周りのナビゲーションのために有用です。
    2. TEMにより、対応するROIの画像をキャプチャします。
  2. クレムイメージオーバーレイ
    1. TEM像を正しく光顕微鏡像で配向していることを確認して、各モダリティで見られる同じ構造が同じサイズになるようにそれぞれの拡大を補正します。
    2. オリエント光学顕微鏡とTEM像を食べ、彼らはサイドバイサイドまたは免疫標識ROIの超微細構造特徴を強調するためのオーバーレイとして表示されます。
    3. フォトショップCS2を使用して、オーバーレイイメージを作成します。まず、低消費電力のTEM画像と同じ倍率に蛍光画像を拡大します。両方の画像を配向した後、1キャンバス上で並べて貼り付けます。
    4. 画像をフラット化。
    5. この合成画像からの蛍光のオーバーレイを作成します。 「長方形選択ツール」をクリックして、蛍光画像を選択して、それから重複層を作成します。
    6. 40％の透明度 - 30に「レイヤースタイル/ブレンドオプション」を調整します。
    7. 「移動ツール」をクリックすると、対応するTEM像の上に蛍光オーバーレイ層をドラッグします。画像の位置を合わせます。
    8. アライメントを達成した後、最終的なオーバーレイ画像を生成するために層を「フラット化」。
    9. 新しいオーバーレイ画像aを選択するために、「長方形選択ツール」を使用しますndは新しいキャンバスにコピーします。 .TIFFファイルとして保存。

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結果

この研究のために使用されるソマトスタチノーマ腫瘍試料は、コラーゲンストーマ組織と混合管構造を形成する腫瘍細胞を含んでいました。蛍光光学顕微鏡によって、豊富な分泌顆粒に含まれる個々の腫瘍細胞は、ソマトスタチンホルモン陽性の標識化を示しました。核は、最小限の非特異的標識の検出可能（ 図1）のように暗い穴が登場しました。低倍率で、可変強い粒状橙色蛍光は、これらのよく特徴付けられた腫瘍細胞の細胞質に見られました。蛍光のオレンジ色が使用されるQDの大きさによって決定されました。この研究のために、我々は、365 nmの光で励起したとき、オレンジ色信号を発する585 nmの量子ドットを使用していました。

同じセルのCLEM分析は（ 図2）が可能でした。 TEMの関心領域を認識することを許可審査とイムのために光学顕微鏡で見たときと同じグリッドを使用して、両方のモダリティで熟成。光学顕微鏡で見られるよう...

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ディスカッション

この研究は、CLEM研究のためのユニバーサルプローブとしてQDの潜在的有用性を実証してきました。使用される585 nmのQDナノ粒子は、広視野光顕微鏡で見たときに明るく安定した蛍光を示し、容易にTEMにより観察しました。本著者の一つ前の研究では、超解像光学顕微鏡7に適するように量子ドットを示しています。その光安定性、拡張視聴期間と長いイメージング・エクスポージャーのために特に有用でした。 QDは、異なるサイズのプローブが同時に同一の励起波長下で異なる色のスペクトルを放出すると、多重免疫組織化学のために使用することができます。

QDは、TEMによって可視化されるのに十分な原子量を有するが、これは使用されるナノ粒子の大きさに応じて挑戦されることが見出されました。光学顕微鏡のために、我々は525 nmの量子ドット（緑）が大きく585nmの（オレンジ）と655 nmの（赤）の形態に比べて少ない背景ラベルを生成することを見出しました。しかし、我々は、TEMにより、標識のより便利な可視化を可能にするために、本研究では、より大きな585 nmのQDを使用することにしました...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

著者は、Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) と、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州リバプールのニューサウスウェールズ州にあるシドニー南西病理サービス(SSWPS)の解剖病理学部門の支援に感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ナトリウム カコジル酸ProscitechC0205有害な化学物質
四酸化オスミウムProscitechC010ヒュームフードでのみ使用
酢酸ウラニルUnivar-Ajax569危険な化学
薬品 エタノール 100%フロニンJJ008
アセトン 100%フロニンJJ006
ERL 4221ProscitechC056
DER 732ProscitechC047
NSAProscitechC059
DMAEProscitechC050
メタ過ウ素酸ナトリウムAnalar BDH10259
抗ソマトスタチン抗体DakoA0566
抗体希釈剤DakoS3022
Qdot® 585 ストレプトアビジン複合体 InvitrogenQ10113MP
ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG抗体SigmaB7389-1ML
グルタルアルデヒド 50%EMS16320
正常なヤギ血清InvitrogenPCN5000
PBS "Dulbecco A"Oxoid 
BSAc (10%)Aurion900.022
ParafilmPechiney PPM
pH 指示薬ストリップ (pH 2.0 - 9.0)Merck1.09584.0001
MicromouldsProscitechRL063
ダイヤモンド ナイフDiatomeUltra 45
透過型電子顕微鏡FEIMorgagni 268D
蛍光光学顕微鏡Carl ZeissAxioscope A1
Grids 300 mesh ニッケル (細いバー)Agar ScientificG2740N
UltramicrotomeRMCPowertome
TEM カメラ制御ソフトウェアソフトイメージングシステムAnalySISVersion 3.0
画像処理ソフトウェアAdobe SystemsPhotoshopCS2
BR0014Gを内蔵

参考文献

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