ヒト多能性幹細胞の懸濁液ベースの心臓分化のためのマイクロウェル中の凝集体サイズの最適化

Summary

ヒト多能性のサスペンション集計ベースの心臓分化を開始する従来の方法は、細胞（hPSCs）は凝集体の大きさや形状に関して培養異質で悩まされている茎。ここでは、サイズ制御HPSCは心臓の促進条件下で培養された凝集体を生成するためにマイクロウェルを用いた心臓分化のための堅牢な方法を説明します。

Abstract

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）の心臓分化は、通常、浮遊細胞凝集体で行われます。 従来のhPSCの凝集体形成では、細胞コロニーをより小さな塊に解離させ、凝集のサイズ制御は、目的の凝集サイズが達成されるまで細胞懸濁液をピペッティングすることによって大まかに制御されます。 従来の凝集体を用いたhPSCの心臓分化の主な課題の1つは、培養の不均一性と空間的混乱が心筋細胞の収量にばらつきがあり、非効率であることです。 私たちと他の人々は以前に、ヒト胚性幹細胞(hESC)の凝集体サイズを調節して心臓誘導効率を最適化できることを報告しました。 私たちは、スケーラブルなマイクロウェルベースのアプローチを採用して、骨材形成の物理的パラメータ、特に骨材のサイズと形状を制御することで、この課題に対処しました。 ここで説明する方法は、定義されたhPSC数をマイクロウェルに強制的に凝集させ、その後、心臓導入を指示する条件でこれらの凝集体を培養することで構成されています。 このプロトコルは、使用するウェルのサイズと数に応じて容易にスケーリングできます。この方法により、心筋細胞の頻度が70%を超える培養アウトプットを一貫して達成することができます。

Introduction

インビトロ細胞培養でモダリティの数で行うことができるが、典型的には二次元の接着条件またはより完全にインビボ系において要約三次元懸濁状態のいずれかで行われます。その結果、三次元組織構築物を生成するための強力な方法を開発するための研究の多くの分野における成長傾向があります。細胞型およびプロセスは支持細胞外マトリックス（ECM）表面との密着性の信号を必要とするシナリオでは、三次元培養は、細胞が上又はマトリックス^1を支持^する外因性で培養される足場構築物を介して有効にすることができます。支持マトリックスへの付着を必要としない細胞と処理は、主にまたは排他的に^2,3（その後、独自の内因性行列を生成するために進むことができる）は、細胞の構成unscaffoldedシステムとして懸濁液中で実施することができます。ここでは、心臓分化oをするためのプロトコルを提示しますFヒト多能性幹細胞（hPSCs - 身体の任意の細胞型になることができる幹細胞、胚または他のソースからも）サイズ制御、均一、unscaffolded凝集体です。

懸濁凝集体としてhPSCsの分化は、ラン内および実行間の両方の凝集サイズの大きな変動に悩まされています。この変動は、細胞コロニーを機械的に分離することを含む一般的に、これらの凝集体を生成するために使用される方法の結果です。この変動性を低減するために、多くのアプローチは、凝集体あたりの細胞数、並びに凝集体直径及び均一性を制御するために使用されています。吊り^5をドロップとしては、例えば、マイクロ遠心チューブ中の凝集体の形成^4、または、微細は^、その後、UまたはV底マルチウェルプレート^7,8に懸濁液、または細胞の遠心分離に転送することができる2次元HPSCコロニー^6を定義しました^9。しかし、これらすべてのAPPRoachesは集計世代の彼らの低いスループットによって制限されています。まあベースのシステムでは、V底プレートシステムに同様のアプローチ、マイクロウェルのしかし小さいサイズを採用するだけでなく、単一の培養プレートから均一な凝集体の多数の生成を可能にする（このプロトコルで各400ミクロンの幅を有します）全体のV底プレート¹⁰から生成されるよりも（〜1200マイクロウェルを含む〜15.5ミリメートルの標準直径）。まあベースの凝集体形成は、外胚葉^から11 hPSCsの分化、内胚葉^12、中胚葉¹³および胚体外¹⁴運命を含む多くの設定で使用されてきました。間葉系幹細胞¹⁵からの軟骨形成;毒物学的スクリーニング¹⁶に対して均一な基質の生成;そして、メカノ¹⁷の調査。

HPSC由来cardiomの製造のための強固な製造プロトコルを開発する上での一つの大きな課題yocytesは、実行間の心臓分化効率の再現性の欠如となっています。我々は以前、この変動が自己複製hPSCsと内胚葉および神経分化^6,18に関連した遺伝子を発現する分化する細胞の両方を含む開始HPSC集団に異質に帰することができることを実証しました。これらの分化する細胞によって分泌された信号は、心臓の誘導に影響を与えます。神経前駆細胞は、心臓の誘導を阻害しながら、具体的には、胚体外内胚葉は、心臓の誘導を促進します。 HPSC集約の際、集約分化中の細胞と未分化hPSCsは、骨材表面¹³上で開発胚体外胚葉細胞の層に囲まれているように整理します。凝集体サイズを制御することによって、我々は、未分化hPSCs（体積比表面積）に対する心臓誘導内胚葉細胞の比率を調節し、最大心臓誘導の¹³のために、この比を最適化することができます。

Protocol

培地成分の調製

1. ウォッシュミディアムを準備します。 DMEM / F12の100ミリリットル当たり、100×ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）の1ミリリットルを追加し、100×L-グルタミンの1ミリリットル、および血清代替の5ミリリットル。
2. 製造元の指示に従って、化学的に定義された基礎心臓誘導培地を準備します。
3. このプロトコルで使用されるメディアについては、以下のストック試薬を準備します。
   1. L-アスコルビン酸：円錐管で、4°Cで滅菌超純蒸留水を1ml当たり5ミリグラムのストック溶液を準備します。
      1. 氷の上でこのソリューションをままにして、溶質が完全に溶解するまで、定期的にチューブをボルテックス。フィルター滅菌し、0.22μmのシリンジフィルターを使用して、アスコルビン酸溶液を。
      2. アスコルビン酸溶液の1ミリリットルのアリコートを調製し、-20℃で、これらのアリコートを保存します。毎回媒体が用意されている解凍したてのアリコートを使用してください。
   2. メディアの準備の日に、基礎心臓誘導培地の1ミリリットル中のモノチオグリセロール（MTG）の13μLを希釈します。未使用、希釈されたMTGを捨てます。
   3. -20℃で保存するためにトランスフェリン（30 mg / mlで）の1ミリリットルのアリコートを準備します。ストアには、最大3ヶ月間4℃でアリコートを解凍します。
   4. 0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する4mMの塩酸（HCl）を準備します。ヒュームフードでは、超純蒸留水50ミリリットルに6.0 N HCl溶液の30μlを添加します。フィルター滅菌0.22μmのシリンジフィルターを用いて溶液。 50 mlのHCl溶液に25％BSA溶液2mlを加えます。
   5. 0.1％BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備します。 mlのPBSあたり25％のBSA溶液20μlを追加します。
   6. ヒト骨形成タンパク質4（BMP-4）ストック溶液（10 ngの/μl）を準備します。 0.1％BSAを含有する4mMの塩酸緩衝液1mlにBMP-4、凍結乾燥の10μgを溶解します。 -20℃で保存するために50μlのアリコートを準備します。
   7. ヒト線維芽細胞増殖因子2（bFGFの）原液を準備（10 ngの/μL）。 0.1％BSAを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）1ml中のbFGF凍結乾燥に10μgを溶解します。 -20℃で保存するために50μlのアリコートを準備します。
   8. ヒト血管内皮増殖因子（VEGF）原液（5 ngの/μl）を準備します。 0.1％BSAを含むPBS 1ml中5μgの凍結乾燥されたVEGFを溶解します。 -20℃で保存するために50μlのアリコートを準備します。
   9. アクチビンを原液（10 ngの/μl）を準備します。 0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS 1 mlにアクチビンAを凍結乾燥に10μgを溶解します。 -20℃で保存するために50μlのアリコートを準備します。
   10. Wntシグナル生産-2の阻害剤（IWP-2）原液（10 mm）を準備します。 429μlのジメチルスルホキシド（DMSO）中に2mgのIWP-2を溶解させます。 -80℃で保存するために10μlのアリコートを準備します。
4. 完全な心臓誘導培地を準備します。基礎心臓誘導培地の100ミリリットルに、100×ペニシリン/ストレプトマイシンの1ミリリットル、100×L-グルタミンの1ミリリットル、トランスフェリン、1の500μlを添加します解凍したてのアスコルビン酸、およびMTGを300μlのミリリットル。未使用のメディアを破棄します。

マイクロウェルプレートの調製

注：すべてのステップは、生物学的安全キャビネット内で行うべきです。

1. プレートに使用される各ウェルに0.5ミリリットルリンス液（キットの構成要素）を追加します。各マイクロウェル内の溶液が接触することを全面を確実にするために、2分間、840×gでプレートを遠心します。
2. RTで30〜60分間、プレートをインキュベートします。
3. 井戸からリンス液を吸引除去します。次のように各ウェルを2回洗浄：各ウェルに1mlのPBSを加え、遠心プレートを2分間、840×gで、その後、PBSを吸引除去します。

HPSCの3形成は、マイクロウェルプレートに集約します

注：すべてのステップは、生物学的安全キャビネット内で行うべきです。

1. 37℃の水浴中でウォッシュミディアムを置きます。
   注記：HPのウェルの容積必要= 1ミリリットルのx個解離されますSC。
2. 単一細胞にhPSCsを解離
   注：これらの手順は、6ウェルプレート上で培養した細胞の解離を記述する - 試薬容量が異なる培養フォーマットに比例スケーリングすることができます。
   1. 解離のために各HPSCの培養ウェルから培地を吸引除去します。解離酵素の1ミリリットルで各ウェルを洗浄し、その直後に、各ウェルからの解離酵素を吸引。
      注：残留解離酵素は、細胞を解離するのに十分であるべきです。
   2. 3分間37℃でプレートをインキュベートします。
   3. 各ウェルに洗浄媒体の1ミリリットルを追加し、機械的に組織培養表面上P1000マイクロピペッターで洗浄中にピペッティングすることにより、組織培養表面から細胞を解離します。解離が不完全と、細胞塊が残っているように見える場合、この時点でのストレーナを介してサスペンションを渡します。
   4. 15mLのコニカルチューブとストアに細胞懸濁液を転送しますインキュベーター内のチューブの細胞数は、次の手順で行われます。
   5. 細胞数を実行します。
      1. 前のステップで収集した細胞懸濁液の10μlのサンプルを取ります。トリパンブルーの30μl加え、ピペッティングによりよくサスペンションを混ぜます。
      2. 血球計数器の各チャンバーにトリパンブルー染色細胞の10μLを移し、10倍の対物レンズとの倒立顕微鏡下で可視化します。細胞を数えます。
   6. 細胞計数結果から、マイクロウェルプレートのウェルあたり1.2×10 ⁶個の細胞を播種することができるどのように多くのウェルを計算します。ウェルあたり1ミリリットルで細胞を播種するために必要な集計中を計算します。
   7. 凝集媒体を準備します。完全な心臓誘導培地の10ミリリットル当たり、BMP4ストック溶液（最終濃度= 0.5 ngの/ mlの）とY-27632 ROCK阻害剤（最終濃度=10μM）の0.5μlを添加します。
   8. インキュベーターとcentrifuからhPSCsを含むコニカルチューブを削除しますGE 5分間、200×gでチューブ。洗浄培地を吸引し、1mlあたり1.2×10 ⁶細胞の密度で集約培地中で細胞を再懸濁。
   9. マイクロウェルプレートの各ウェルからPBS洗浄溶液を吸引します。 P1000のピペットを使用して、均等にマイクロウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液1mlを分配し、種子。ウェルの多数の種子に、定期的に沈降を防止するために、細胞懸濁液をボルテックス。
   10. 5分間、200×gでプレートを遠心。細胞は、各マイクロウェルの底に紡糸したことを確認するために顕微鏡下でプレートを観察します。
   11. 5％CO _{2、5％O 2（} 低酸素 ）インキュベーター中、37℃で24時間プレートをインキュベート。

4.心臓誘導ステージ1

1. 集計以下の1日（1日目）、（井戸の、体積= 1ミリリットルのx個の24ウェルプレート用）ステージ1誘導媒体の必要なボリュームを準備。完全1mlのための心臓の誘導培地は、BMP4ストック溶液（最終濃度= 10 ngの/ ml）を1μlの、bFGFのストック溶液（最終濃度= 5 ngの/ ml）を0.5μlの、およびアクチビンAの0.6μlを添加（最終濃度= 6 NG /ミリリットル）。少なくとも15分間、37℃の水浴中に媒体を配置します。
2. インキュベーターからマイクロウェルプレートを取り外します。顕微鏡下で凝集体を点検します。直後遠心分離機の集約と比較すると、彼らは滑らかなエッジ（複数のラウンドと前日よりも小さい四角）でそのまま表示されます。
3. マイクロウェル内部の凝集体を乱すことなく、上清を除去します。
   1. 水平レベルをマイクロウェルプレートを保持する（ すなわち 、それを傾けないでください）。マイクロウェルプレート上の各ウェルについて、培養液の表面およびウェルのエッジに対してP1000のピペットの先端を配置します。
   2. ゆっくりとマイクロウェルの底部に凝集体を邪魔しないように注意しながら、培地を除去します。トンを削減した後、テクスチャマイクロウェル表面から1〜2mm程度に彼中レベル、徐々に音量が十分に低くなると、流体の動きが大幅に低減されたウェル（の片側に培地を収集するためにプレートを傾け、それを持ち上げ取得凝集を回避することが容易です個々のマイクロウェルのうち）。ゆっくりとウェル内に残っている培地をピペット。
4. 凝集体が個々のマイクロウェルに残って確保しながら、新鮮なステージ1誘導培地を追加するには：P1000マイクロピペッターでステージ1誘導培地の1ミリリットルを描画します。ウェルの内側のエッジに対してピペットチップを持ち、非常にゆっくりとウェルの内壁に対して培地を分注します。残りのウェルについて、この手順を繰り返します。
5. 3日間低酸素条件下でインキュベーターにプレートを返します。

5.心臓誘導ステージ2

1. 4日目に、場所は15分の最低37℃の水浴中（ウェルの体積=数×2 ml）を培地を洗浄します。
2. （最終濃度= 10ng / mLの）VEGFストック溶液2μLを追加し、完全な心臓誘導培地1mlあたり0.5μlのIWP-2：ステージ2誘導培地（ウエル×1 mlの容量=数）の必要なボリュームを準備ストック溶液（最終濃度=5μM）。 15分の最低37℃の水浴中で準備されたステージ2誘導培地を置きます。
3. 5ミリリットル血清学的ピペットを用いて、マイクロウェルプレートの各ウェルから凝集物を収穫し、（15ミリリットルチューブあたり10ウェルに、最大収集）15ミリリットルコニカルチューブ内に集約サスペンションを収集します。
4. 凝集体が低酸素インキュベーターで15分間沈降することを可能にします。
   注：この手順は、無傷の集合体から単一細胞と細胞破片を分離することが重要です。
5. 残留誘導性サイトカインを除去するために、予め温めておいた洗浄培地10ml中で凝集体を注意深く上清を吸引除去し、再懸濁（ 例えば 、アクチビンAは、非常に低い共同で強力なシグナル伝達分子でありますncentrations）。
6. 2分間50×gで凝集体を遠心分離します。上清を吸引除去します。予め温めておいた誘導2培地でペレット化凝集体を再懸濁します。
7. ウェルあたり1ミリリットルで24ウェル超低接着（ULA）プレートに集約サスペンションを転送します。均一な、タイトな細胞クラスターとして顕微鏡下で凝集体を守ってください。 6日目まで低酸素条件下でインキュベートします。

6.心臓誘導ステージ3

1. 6日目に、ステージ3誘導培地（ウエル×1 mlの容量=数）の必要なボリュームを準備。完全な心臓誘導培地の1ミリリットルのために、2μlのVEGFストック溶液（最終濃度= 10ng / mLの）、およびbFGFのストック溶液（最終濃度= 5 ngの/ ml）を0.5μlを添加します。 15分の最低37℃の水浴中で準備ステージ3誘導培地を置きます。
2. 凝集体を10mlまでプール15 mlのコニカルチューブに凝集体を移すために、5 mlの血清学的ピペットを使用してチューブあたりの。
3. 凝集体がセトリングするための10分を許可します。上清を吸引除去し、予め温めておいたステージ3誘導培地中で凝集体を再懸濁します。 5ミリリットル血清学的ピペットを用いて、ウェル当たり1ミリリットルで24ウェルULAプレートに凝集体を再配布します。
4. 10日目に、ステージ3誘導培地ステップ6.1あたりとして（ウエル×1 mlの容量=数）の必要なボリュームを準備。
5. チューブあたり凝集体の10ミリリットルまでプーリング、15ミリリットルコニカルチューブに凝集体を転送するために5ミリリットルに血清学的ピペットを使用してください。
6. 凝集体がセトリングするための10分を許可します。上清を吸引し、ステージ3誘導培地中で凝集体を再懸濁します。 5ミリリットル血清学的ピペットを用いて、ウェル当たり1ミリリットルで24ウェルULAプレートに凝集体を再配布します。
7. 2日間低酸素条件下でインキュベートします。 12日目に、培養期間（37°C、20％O _{2、5％CO 2）}の残りの酸素正常酸素レベルで細胞をインキュベートし始めます。
   注意：この時点の後、細胞はもはや低酸素条件下で培養されていません。
8. この完全な培地交換を繰り返し、細胞収穫まで14日目から開始し、4日毎に、（6.2と6.3をステップ）（典型的には、ピーク心筋細胞濃度は、分化の14日目後に観察されています）。

心筋トロポニンT（cTnTの）マイクロウェル文化出力の発現頻度の7フローサイトメトリー分析

1. 次のように凝集体を解離します：
   1. 15ミリリットルコニカルチューブに凝集体の1をよく転送するために5ミリリットルの血清学的ピペットを使用してください。 2分間50×gで凝集体を遠心分離し、上清を注意深く吸引除去します。
   2. 骨材に新鮮に溶解し1mg / mlのコラゲナーゼタイプII溶液1mlを追加します。 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに集約サスペンションを転送します。室温で一晩コラゲナーゼタイプIIに凝集体をインキュベートします。
   3. 次の日、静かに凝集体を解離させるためにP1000のピペットを使用均質な単一細胞懸濁液に。凝集体が容易に解離しない場合は、凝集体を決済する上清を吸引し、室温で1〜2分間解離酵素700μlの中で凝集体をインキュベートします。ゆっくり解離するP1000マイクロピペッターで集合体を1〜2回ピペット。
   4. 解離酵素を希釈：1mg / mlのDNA分解酵素原液の14μLを含む洗浄媒体の700μLを加えます。細胞数を実行するために10μlのサンプルを取り、そして2分間300×gでベンチトップマイクロ遠心を使用して残りのサスペンションを遠心分離します。
2. 細胞数を実行します：トリパンブルー等量の10μlのカウントサンプルを染色し、血球計数器を用いてカウントします。
3. 微量から残りの細胞を含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブを外します。上清を吸引除去し、含むハンクス平衡塩溶液に、100μlの20万〜500,000細胞の濃度で、細胞を再懸濁2％ウシ胎児血清（HF）。
4. 各条件について、96ウェルプレートのウェルに2つのウェル（1ウェルはcTnTの抗体で染色され、他方は二次抗体対照である）当たり100μlの細胞懸濁液を移します。
5. 2分間、300×gでプレートを遠心。マルチチャンネルピペットで上清を取り除きます。
6. 細胞を固定：ウェル当たり固定ソリューション（キットの構成要素）の200μlを添加して、室温で15分間静置します。
7. 2分間、300×gでプレートを遠心。注意深くウェルから上清を撤回するマルチチャンネルピペットを使用してください。パラホルムアルデヒドの廃棄物容器内の上清を廃棄してください。
8. 二回固定した細胞を洗浄：各ウェルにHFの200μLを加えます。 2分間、300×gでプレートを遠心。上清を吸引し、もう一度洗浄ステップを繰り返します。固定した細胞を4℃でHFで最大1週間保存することができます。
9. 細胞を透過性：
   1. 300でプレートを遠心2分間XG。
   2. 各ウェルに透過処理溶液（キットの構成要素）の100μlを添加して、室温で5分間静置します。
   3. 2分間、300×gでプレートを遠心し、上清を吸引除去します。
10. 指定されたロット番号のための最適な濃度でHF中の抗cTnTののマスターミックスを調製する（最適希釈は、滴定によって決定され、一般的に1の範囲する必要があります：500〜1：2000）。
11. 各条件（条件当たり2つのウェル）については、他のウェル（二次抗体コントロール）に1ウェル（染色標本）とプレーンHFの100μlにマスターミックスの100μlを添加します。 4℃で30分間細胞をインキュベートします。
12. 2分間、300×gで細胞を遠心。上清を吸引し、ウェルあたりHFの200μlを添加します。この洗浄ステップをもう一度繰り返します。
13. 二次抗体のマスターミックスを調製します。すべてのウェルについて100μlに相当するHFの量（二次抗体制御を移し、cTnTの染色）が治療されています。 （：200希釈1）HF200μlのあたりのヤギ抗マウスAPC二次抗体の1μLを加えます。
14. サンプルを染色します。 （二次抗体コントロールと抗cTnTの染色井戸の両方）を各ウェルに染色溶液100μlを加えます。 （光退色を避けるために、蛍光二次抗体を添加した後、プレートカバーさや暗所にしておく）、4℃で30分間、暗所で細胞をインキュベートします。
15. 2分間、300×gで細胞を遠心。上清を吸引し、ウェルあたりHFの200μlを添加します。この洗浄ステップをもう一度繰り返します。
16. 分析管サイトメーター5ミリリットル丸底流れにサンプルを移し、機器¹⁹のための標準プロトコルを使用して、APCチャネルの信号のためのフローサイトメトリーを行います。

Results

hPSCsのサイズ制御の凝集体を効果的にのみ細胞の濃度およびマイクロウェルの表面積に依存する、マイクロシステムを用いて形成することができます。短い遠心分離後、細胞（このプロトコルで千）の適切な番号が各マイクロウェル（ 図1A）にまとめられます。重要なことは、これらの細胞は、24時間以内に細胞内の接続を再確立し、もはや十分に埋めるべきではありませんが、滑らかなエッジ（ 図1B）とコンパクトな集合体として表示されます。これらの凝集体は、心臓の運命に向かってさらなる分化のための出発材料を提供します。細胞が密なクラスターを形成しない場合、これは、解離および再凝集次可能細胞死を示唆し、そして特定の細胞株のための単一細胞継代及びROCK阻害剤濃度の適合性を検討すべきです。マイクロウェルの次の3日間は、集計モルフォはほとんど変化を示していますでれっと、いくつかの成長は明らかですが。マイクロウェルから除去した場合、凝集体は、そのラウンド、密集した形態を維持し、互いに（ 図1C）と同様のサイズのものでなければなりません。 ULA 24ウェルプレートでの培養は、細胞増殖及び成長を可能にします。

8日目では、最初のアクチビンシグナリング、およびWnt阻害に暴露した後、凝集体は大きく、明るく、凝集体（ 図1D）として表示されるようになります。この期間中、かなりの細胞破片は、各ウェルの底に明らかであろうし、凝集体がメディアを削除する前に解決することを可能にすることによって除去されなければなりません。時折、多くの凝集体が互いに融合します。これらの「スーパー凝集体は「小さい凝集体および完全な分化を受ける可能性は低いと見られる形態学的変化を示さない傾向があるが、これは、十分に他の凝集体の分化を阻害しません。

大型化と組織化繊維状の領域の外観を持つ集合体に顕著な形態学的変化に= "1">続き分化結果-together.withinページを保つ：FO」jove_content」。日12で、収縮凝集を観察することができます。これらは常に大きな透明の細胞で構成され、多くの場合、骨材（ 図2）の外側に広範囲の細胞外マトリックスを含むことになります。集合全体の収縮が成功した分化を示し、一方、心臓マーカーの発現はまた、収縮していないようで凝集体で観察することができます。凝集体および免疫標識の解離に続いて、細胞の大部分は、フローサイトメトリーによる心筋マーカーのcTnT（ 図3）について陽性となります。このマーカーの発現は、細胞中で安定しておりとして後期分化の19日目のように、凝集体において観察されてもよいです。

1.JPG "/>
図1：HPSCのタイムラインは、心臓の運命に向かって分化した直後に集約した後、細胞はほぼ各マイクロウェル（A）を満たします。 1日後、凝集体が凝縮表示され、（B）を滑らかに。この形態は、凝集体がマイクロウェルから除去し、ウェルプレート（C）に播種した場合でも持続します。 8日目では、凝集体が拡大し始め、色（D）で明るく見えます。スケールバー：250μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：凝集体は、トップパネル（強制的な集合体全体の収縮が観察された、心臓誘導ステージ3培地中で6日後に分化の12日目により締約開始 ：リラックスエーション、中央のパネル：収縮）。下のパネルは、黒または白（矢じり）として表示される最も重要な違いは、上部と中央のパネルを引いから誘導されます。スケールバー：250μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：17日目差別hPSCsにおける心筋トロポニンTのための免疫標識 、細胞のほとんどは、フローサイトメトリー（充填されたヒストグラム）によって心筋トロポニンT陽性です。また、二次抗体単独（塗りつぶされていないヒストグラム）で染色した細胞が示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

多能性幹細胞の効率的な心臓分化は、高度に可変なプロセスであることが観察されています。それは、異なる細胞株は、特定の細胞型への分化能のために変化する傾向を示すことは驚くべきことではないが、心臓の分化効率がレプリケート間劇的に変動することが観察された同じ細胞株^6を使用して実行されます。ここで説明するプロトコルは、直接の集約あたりの入力セルの数を制御することによって、この変動の一つの大きな源に対処しています。さらに実行の間のばらつきを低減するためには、単一細胞継代のために適合HPSC線が多能性マーカーの発現頻度（ 例えば 、あるOct4、Nanogのに対して、より一貫性の多能性集団におけるHPSCの拡大とメンテナンス結果のこの形として、使用することをお勧めしますTRA-1-60、 等 。）。

ここに書かれたようなプロトコルがoのために1,000細胞の凝集体サイズを指定しますHES-2胚性幹細胞株からptimal心臓誘導。異なる細胞株にこのプロトコルを適用するためには、初期の凝集体サイズ画面は細胞株特異的な最適な凝集体サイズを決定するために実行することが重要です。それがここで直接従うべき手順には影響しませんが、我々は、凝集体サイズと全体的な細胞密度の変化は酸素供給に影響を与えることが期待されている読者を思い出させます。これは、下流のアプリケーションでは、関連する考慮なることがあります。さらに、アポトーシス細胞死は、単一細胞にhPSCsの解離時の関心事です。したがって、ROCK阻害剤は、マイクロウェルで強制細胞凝集の間に存在していることを確実にするために重要です。最後に、分化の4日目に凝集体は十分に誘導2培地で再懸濁する前に、誘導1中に存在し、トレースアクチビンAを除去するために洗浄することが重要です。分化の4日後に、アクチビンAはメソを犠牲にして内胚葉分化を促進しますダーム誘導^20。

この技術の主な用途は、効率的な心臓分化を促進集計サイズをスクリーニングすることです。しかし、現在の技術の限界の一つは、マイクロウェルプレートを使用して臨床的に関連するレベルまで心筋の生産をスケールするために挑戦していることです。心臓分化のスケールアップは、典型的には、撹拌懸濁バイオリアクター²¹内のバルク培養条件で行われます。マイクロシステムは、効率的な心臓の誘導のための凝集体の大きさの許容範囲を決定するために使用された後、そのため、スケールアップする次のステップは、所望の細胞の凝集体のサイズを生成することができるバイオリアクターインペラー速度を決定することです。

集合ベース心臓分化のための他の方法に対するこの技術の重要な違いの1つは、それが同様に凝集体における内因性シグナルの効果を調節するに直接調査を可能にすることです集計¹³でhPSCsと誘導性/抑制性の組織型の共培養。調査のこれらのタイプは、大規模な心臓の製造のプロセス開発を知らせることができます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
生物学的安全キャビネット
ピペットエイド
血清ピペット(5〜25 ml)
アスピレーター
アスピレーターまたはパスツールピペット
15mlおよび50mlコニカルチューブ
ヒュームフード
0.22 µmシリンジフィルター5
%CO2、5%O2、および湿度制御された細胞培養インキュベーター			低酸素(低酸素)インキュベーター
5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator
プレートホルダーが取り付けられたスイングバケットローターを備えた低速遠心分離機
P2、P20、P200、P1000マイクロピペッターと関連ヒント
4倍、10倍、20倍の位相対物レンズを備えた倒立顕微鏡
超低アタッチメント(ULA)24ウェルプレート	Corning/Costar	3473
1.5 ml 微量遠心チューブ
卓上型微量遠心分離機
L-アスコルビン酸	Sigma-Aldrich	A4403
滅菌超純蒸留水	Sigma-Aldrich	W3500
ボルテックス
アイス
-20 °C;C冷凍庫
モノチオグリセロール	Sigma-Aldrich	M6145	有毒;MTGの分注は、繰り返し開くことによる酸化を最小限に抑えるために強くお勧めします。アリコートは4°Cで保存できます。Cは最長3か月間、-20°C。長期保存にはCがおすすめです。
StemPro-34 ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10639-011	基礎心臓誘導培地;サプリメントは-20°Cで保存されます。Cと4°Cの基底培地。
トランスフェリン	ロシュ	10652202001
BMP-4	R&Dテクノロジー	314-BP
bFGF	R&Dテクノロジー	233-FB
VEGF	R&Dテクノロジー	293-VE
アクティビンA	のR&D Technologies	338-AC
IWP-2	Reagents Direct	57-G89
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190
ウシ血清アルブミン (BSA)	Thermo Fisher Scientific	15561
塩酸	Sigma-Aldrich	258148	腐食性
ジメチルスルホキシド(DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660
100x ペニシリン/ストレプトマイシン	Thermo Fisher Scientific	15140
100x L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030
ノックアウト血清交換	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10828010
TrypLE Select	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12563	解離酵素
血球計算盤
Trypan Blue
Aggrewell 400 プレート	StemCell Technologies	27845	マイクロウェルプレート
Aggrewell リンス ソリューション	StemCell Technologies	7010	マイクロウェルリンス溶液
Y-27632 ROCK阻害剤	Tocris	1254
コラゲナーゼII型	Sigma-Aldrich	C6885
ハンクのバランスの取れた塩溶液	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14025092
ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12483
96 ウェルプレート (FACS染色用)
イントラプレップ透過化試薬	ベックマン・コールター	IM2389	キット 2つのパーツ付き: 固定液と透過化液;毒性
cTnT抗体	ネオマーカー	MS-295
ヤギ抗マウスIgG APC抗体ThermoFisher	Molecular Probes	A865
5 ml 丸底フローサイトメトリーチューブ	FACSマシン依存