内イメージングカルシウム<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵活性化で

サマリー

この記事では、 ショウジョウバエの卵活性化の間のCa ^2+を可視化するための適応性のex vivoでのプロトコルについて説明します。

要約

卵子の活性化は、受精卵が減数分裂を完了し、胚発生を開始するための一連のイベントを含む普遍的なプロセスです。卵の活性化の1つの側面は、調査したすべての生物にわたって保存されており、カルシウム(Ca²⁺)の細胞内濃度の変化であり、これはしばしば「Ca²⁺波」と呼ばれます。Ca²⁺波の振動速度と振動回数は種によって異なりますが、細胞内Ca²⁺の変化は、胚発生に不可欠なイベントをもたらす鍵となります。これらの変化には、細胞周期の再開、mRNA調節、皮質顆粒のエキソサイトーシス、および細胞骨格の再配列が含まれます。 >jove_content<成熟したショウジョウバエの卵子では、受精前に女性の卵管で活性化が起こり、一連の^Ca2+依存的なイベントが始まります。ここでは、ショウジョウバエのCa²⁺波をイメージングするためのプロトコルを紹介します。このアプローチは、Ca²⁺波のメカニズムとそれに関連する下流の変化を調査するための操作可能なモデルシステムを提供します。

概要

卵（卵母細胞）の活性化における細胞内Caの変化²⁺濃度は、全ての研究生物^1,2の保存コンポーネントです。このイベントは、細胞周期の再開と、記憶されたmRNAの翻訳などのCa ²⁺依存性プロセスの広い範囲を、開始します。細胞内Ca ²⁺濃度の一過性の変化を可視化するのCa ²⁺のためのこの要件にキー注目されています。

歴史的に、モデル生物は、その卵の大きさと可用性に基づいて卵活性化の研究のために選択しました。様々な可視化手法では、次のようにシステム内の細胞内Ca ²⁺濃度の変化に従って、定量化するために利用されてきた：メダカ³における発光タンパク質エクオリンを、このようなフラ-2ウニとハムスター^4,5のように^の Ca ²⁺感受性蛍光色素;そして、カルシウムグリーン1デキストランアフリカツメガエル ^6インチ

遺伝的にコードされたカルシウム指標（GECIs）の生成および改良は、in vivo ⁷ 中の Ca ²⁺動態を可視化する能力を変えてきました。これらの遺伝子構築物は、特定の組織で発現し、侵襲性の組織標本⁸の必要性を制限しています。

GCaMPsは、それらの高い親和性^の Ca ^2+、信号対雑音比及び^9-11をカスタマイズするための能力に非常に有効であった緑色蛍光タンパク質（GFP）GECIsのベースクラスです。 Ca ²⁺の存在下では、GCaMP複合体は、カルモジュリンへのCa ²⁺の結合を開始し、コンフォメーション変化のシリーズを受けることGFP部品⁹の蛍光強度の増加をもたらします。

GCaMPsは広く、細胞内カルシウム¹²の変化を可視化するために、 ショウジョウバエの神経細胞の研究に使用されています。最近のアプリケーションシート成熟したショウジョウバエの卵中のCa ^2+を可視化するGCaMP技術の上で卵活性化^13,14で単一の一過性のCa ²⁺波を明らかにしました。 Ca ²⁺波は、ex vivoで活性化アッセイ^13,14を用いてインビボ ¹³ またはより高い倍率で排卵時低倍率で視覚化することができます。 ex vivoでのアッセイでは、個々の成熟した卵母細胞を卵巣から単離し、低張溶液を用いて活性化され、in vivoで活性化^15-17のイベントを再現することが示されている活性化緩衝液と呼ばれます。

このex vivoのアッセイは、薬理学的破壊、物理的な操作と遺伝的変異体を含む、異なる実験条件の下でのCa ²⁺波の容易な高解像度の可視化を可能にします。この記事では、ex vivo活性化及び目のための成熟したショウジョウバエの卵の調製を示しますGCaMPを使用してのCa ²⁺波を可視化するために使用する電子その後の顕微鏡。このアプローチは、Ca ²⁺波の開始と制御をテストし、下流の結果を調べるために使用することができます。

プロトコル

注：特に明記しない限り、室温ですべてのステップを実行します。

1.解剖の準備

注：ここで説明する手順は、E Gavis、プリンストン大学＆ワイルらに従っています。アル^。18。 2日間の撮影前に、次の手順を実行します。

1. 固形食品の約10ミリリットルを含むフライバイアルを取り、1コーナーに乾燥酵母の少量を追加し、1g未満で十分です。
   注：フライバイアルまたは食品に関する情報は、「 ショウジョウバエのメンテナンス^」19を参照^してください。
2. 酵母を水和するために3滴の水 - 1を追加します。
3. 45°の角度で脇バイアルを設定し、3許可 - 水を取るために酵母のための5分。
4. 酵母は水を吸収している間に、最近（myristoyを浮上している浴槽-VP16GAL4（GCaMP5と呼ばれる）によって駆動UASt- マイア GCaMP5 ^20を発現しているハエのボトルを選択GCaMP5のされた関連の形）が卵に膜にGECIをテザリングを介して、高い信号対雑音比を提供するために選ばれました。
5. CO ₂ガスを瓶の中にハエをAnaesthetize。ウェットフードでハエを失わないように、倒立ボトルを保つようにしてください。
6. CO ₂パッドの上に麻酔ハエヒントとソート10から15人の女性と解剖顕微鏡下で絵筆を使用して5人の男性。注：解剖のための健康的なメスを提供するために、男性を含めるための規格です。
7. ステップ1.3からのバイアルの準備ができたら、バイアルに選択されたハエを追加します。ハエがアクティブになるまでバイアル水平を保つように注意してください。
8. 約36時間、25℃でバイアルを置きます。
9. ボトルや廃棄にCO ₂パッドから残りのハエを返します。

2.解剖ショウジョウバエ卵巣

注：ここで説明する手順は、ワイルらに従っています。アル。 18アップ。

1. 36時間後、CO ₂とyeastedバイアルからハエをanaesthetize。
2. バイアル内部のハエを麻酔したら、解剖顕微鏡下でペイントブラシでソートするCO ₂パッドの上にそれらを傾けます。
3. 女性を選択します。
4. 女性からの2の卵巣を分離します。完全な詳細なプロトコールについてはワイルらを参照してください。アル^。18。要約すれ​​ば：
   1. 第1.5、22×40ミリメートルカバースリップ上の酸素ハロカーボンオイル（シリーズ95）の小滴を置きます。
   2. 腹部の前で鉗子で女性をつかみます。
   3. 解剖顕微鏡下で女性を持ち、優しく女性の後部を削除するには、鉗子の第2のセットを使用します。
   4. 第二の鉗子から後方組織を拭き取ってください。
   5. 前方から腹部の後方への第2の鉗子を用いて腹腔に絞ります。時FEMAの外側にある半透明の卵巣が鉗子に固執する必要がありますル。
   6. 油に卵巣をタッチします。
   7. 鉗子を拭き取ることにより、鉗子から任意の組織を削除します。
   8. 3カバースリップ、1 flyから卵巣を含む各を得るために - これらの手順（2.4.7 2.4.1）を繰り返します。

3.単離個々の熟卵

1. 4Xに設定倍率の標準的な解剖顕微鏡下では、ステップ2.4​​からの最初のカバースリップ上で、卵管を引き裂くことにより、2つの卵巣を分離します。
2. 任意の卵室を穿刺しないように注意しながら、単一の卵巣の中央に閉じたピンセットをご紹介します。
3. 次の閉じた鉗子に卵巣の中心​​部への標準的な解剖プローブを挿入します。
4. ゆっくり成熟卵（ステージ14卵室）が配置された後極に向かって卵巣を介して解剖プローブをドラッグします。
5. 繰り返しは3.1ステップ - 3.4 2から5回は卵巣と卵の数のサイズによって異なります。
   注：CO ₂の追加は、通常、予め堆積卵よりも隆起した背の付属と大きく表示されます単一の卵の堆積を引き起こします。それは既に女性の内部で起動されているので、この卵は、イメージングのために破棄されるべきです。
   注：成熟卵は卵巣結合組織から容易に分離する可能性があります。
6. 全く成熟した卵は卵巣の外側に表示されていない場合、解剖プローブとからかっ優しく続けます。
7. カバースリップの中央に一列に5 - 成熟した卵子が卵巣の外側カバースリップ上に表示されたら、3を操縦。
   注：最良の結果を得るために、穏やかに卵の側面に沿ってプローブを実行します。
   注：これは卵に損傷を与えることができるよう背付属を引っ張ることは避けてください。
   注：将来のイメージングセットアップに応じて、最大撮影領域のためのカバーガラスに垂直に200μm程度離れて卵を合わせます。
8. 整列一度、Fを使用して整列卵から離れて、それをドラッグすることで、卵巣組織の残りの部分を削除しますorceps。
9. ワイプ医療のコーナーで軽くたたくことにより、余分な油を削除します。医療が接触するなどの成熟卵を拭くと成熟卵を触れないように注意してくださいが失われます。
10. 顕微鏡下でのサンプルの位置を簡単にするためにマーカーでカバースリップ上の十字線を描画します。
11. 安全な場所にカバーグラスをセットし、5休まカバースリップ上に準備された卵室を残す - 10分。これは、油中に解決する卵を可能にします。試料は、1時間後の切開まで使用することができます。
12. それらの上に卵巣とカバースリップの残りのための3.11 - を繰り返して、3.1を繰り返します。

4.イメージングのための準備

1. 室温に準備されたアクティベーションバッファ^15を持参^してください。
   注：活性化緩衝液は低張性緩衝液である：3.3ミリモルのNaH ₂ PO _4、16.6 mMのKH ₂ PO _4、10mMの塩化ナトリウム、50mMのKClを、5％のポリエチレングリコール8,000は、2mMのCaCl _2を 、1を用いてpHを6.4にしました。 NaOHを5比：KOH。詳細についてはMahowald、1983年^15を参照^してください。活性化緩衝液のアリコートを2週間までヶ月と4℃で-20℃で保存することができます。
2. 慎重イメージング施設に準備されたカバースリップ、活性化バッファー及びガラスピペットを輸送。
   注：広視野共焦点、スピニングディスク又は光学シート用顕微鏡を使用することができます。私たちは、倒立顕微鏡を使用することをお勧めします。私たちの代表的な結果は、共焦点顕微鏡を用いて得ました。
3. 全体の成熟卵を画像化するのに適した目的は、（ここでは：20X 0.7 NA）を選択すべきです。
4. 顕微鏡ステージ上に最初に準備されたカバースリップをマウントします。ステージ上にカバースリップを壊さないように注意してください。
5. 定性的には活性化のための成熟した卵室でビューのフィールドを選択します。画像は卵室または膜中のブレブ形成を有するものがパンクしないでください。
   注意：手順4.6について - 4.7、ソフトウェアコマンドは、顕微鏡やメーカーによって異なります。
6. 設定された撮影パラ（ - 580から500nm）標準GFPの励起（488 nm）を発光のためメートル。また、成熟した卵と変位油を可視化し、配向するために、明視野ビューを設定。
7. 成熟卵が表示されている最低のZ平面を選択し、ステップ当たり40マイクロメートルで約2μmのために取られるフルZスタックを設定します。 Zスタックの取得の間に遅延がないようにパラメータを設定します。約30分間キャプチャする時系列を設定します。

5.イメージングex vivoで卵活性化

1. 画像キャプチャを開始します。
2. 取得する2フルZ-スタック - 1のを待ちます。これは、活性化の前に成熟した卵子を示しています。
3. ガラスピペットに活性化バッファーの約300μLを撤回。
4. それは成熟した卵は、撮像されているの真上になるまでカバースリップ上記45°の角度で活性化緩衝液を含むガラスピペットの先端を位置決めし、ゆっくりとビーム経路にピペッ​​トを移動します。ガラスピペットべきオイルより2センチメートル - 1です。
5. ガラスピペットから5秒未満で活性化緩衝液の2滴 - 1を追加します。これは、オイルを置換する必要があります。それは成熟卵の移動を引き起こすことができるように、過剰な活性化緩衝液を追加したり、ガラスピペットで卵に触れないようにしてください。これは目的とカバーガラスとの間に液浸油に形成するために、焦点面や気泡の変化を引き起こすことができるようにピペットでカバースリップに触れないように注意してください。
6. 画像取得時に活性化緩衝液を添加しながら、オイルが活性化緩衝液によって変位していることを確認するために、明視野チャンネルを確認してください。
   注：これは、最初のビーム経路を壊すピペットによる影として表示されますが、また、小さな油滴の外観になります。一部の油滴は、実験の結果および画像品質に影響を与える成熟した卵子に関連付けられたままにすることができます。
7. 5 - 油を活性化バッファー反復の最初の添加からずれていない場合は5.4ステップ0.6。
8. 油が正常に変位されると、時系列が完了するまで実行することができます。
   注：これにより起動時の卵母細胞の膨潤に、いくつかの卵室は、活性化緩衝液を添加すると、ビューの焦点面またはフィールドの外に劇的に移動します。この状況では、取得を停止し、次のカバースリップをマウントします。
9. 画像シーケンスは、買収を完了した後、データを保存します。

6.買収後の画像処理

1. フィジー（http://fiji.sc/Downloads#Fiji）、または同等の画像処理ソフトウェアを使用して、データセットを開き、分析のために、関連するファイルを選択します。
2. 取得したデータの投影を構築するために選択します。画像>スタック> Z-プロジェクトを。
3. スタートZ-スライスとストップZ-スライス、通常、セクション全体を選択します。一般的に「最大輝度」に設定投射型を選択します。シリーズ全体に選択した設定を適用するチェックボックス「すべての時間のフレーム」を確認してください。
4. もし複数の蛍光チャネルは、色間の移動を可能にする複合体を作る、または画像のグレースケールを作るためにチャンネルツールを使用して、撮像されました。画像>色>チャンネルツールを選択します。
5. 画像の明るさを調整し、選択画像を対比>>明るさ/コントラストを調整します。
6. 単一のイメージをエクスポートするには、関連するフレームおよび[ファイル]> [名前を付けて保存> JPEG、または任意の好適なフォーマットにタイムスケールスライダーを移動します。
7. 保存し、エクスポートしたファイルの場所とタイトルを選択してください。
   イメージングソフトウェアからフレームレートが画像にタイムスタンプを付与するために必要とされることに注意してください。
8. 選択ムービーとして時系列をエクスポートするには：[ファイル]> [名前を付けて保存> AVIファイルを、フレームレート（1秒あたり〜7フレーム）を選択します。
9. 保存し、エクスポートしたファイルの場所とタイトルを選択してください。
10. フィジー形式で調整されたファイルを保存するには、[ファイル]> [保存します。

結果

ここでは、ex vivoでの活性化のために成熟したショウジョウバエの卵を準備する方法を実証しています。 GECIを発現している卵は、卵の活性化および胚発生の始まり（ 図1）でのCa ²⁺動態のイメージングを可能にします。ミリストイル基の存在は特に、使用GCaMPによって、結果がわずかに質的な違い^{13 14を}有してもよいことに留意すべきである。我々はまた、アクチン重合の阻害剤を添加することによって卵の活性化の間の機能的アクチンの役割を実証しています、活性化緩衝液（ 図^2）14サイトカラシンD、。

卵活性化における細胞骨格のための要件が​​保存されています。 C.でエレガンスは、受精後、細胞骨格の構成要素は、第一の非対称分裂^21,22のための一細胞胚を作製するために再編成されています。ウニ​​、cytoskeleの破壊でTALの再編成次の活性化は、収縮環の形成^23を防止^することにより、細胞周期に影響を与えることが示されています。 ショウジョウバエの卵活性化時^の Ca ²⁺波とその下流の機能を媒介する際のアクチンの役割は完全には解明されないままです。

ショウジョウバエでは、 ^の Ca ²⁺波とアクチン細胞骨格の同時可視化は、このエクスビボ活性化アッセイを用いて達成することができます。複数のチャンネルの時系列を取得することができ、細胞内Ca ²⁺の動態を、卵母細胞（ 図3）におけるアクチンの組織の変化に一致させることができます。

図1：ex vivoでのショウジョウバエの卵活性化時系列でのシングル^の Ca ²⁺波は、a。次UASt- myrGCaMP5を表現する ショウジョウバエの卵を成熟します活性化緩衝液（AH）のddition。細胞質のCaの上昇は約1.5ミクロン/秒の平均速度で²⁺後極（B）に由来し、伝搬する（BF）。波の開始は、典型的には、活性化緩衝液の添加の3分以内に観察されます。活性化に続いて、成熟した卵の細胞内カルシウムレベルは、レベル（G、H）活性化の事前に戻ります。補足ムービー1（合計時間33分）を参照してください。スケールバー=50μmです。 =40μmの最大投影。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：アクティベーションバッファ摂動CAにサイトカラシンDの追加²⁺ ex vivoでの波動伝播。時系列を10μg/ mlのサイトカラシンDの最終濃度（AH）を含む活性化緩衝液を添加した後UASt- myrGCaMP5を表現する ショウジョウバエの卵を成熟します。 Ca ²⁺波は後極（A）で開始される一方で、それが危険にさらされていると卵（F）の前方に到達していない（白矢じりは、波の前面を表します）。それ以上^の Ca ²⁺の変化）を30分間にわたって観察されませんでした。補足ムービー2（合計時間30分）を参照してください。スケールバー=50μmです。 =40μmの最大投影。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：EでのアクチンおよびCa ²⁺の同時可視化ショウジョウバエのGGのアクティベーションex vivoでの。時系列は、活性化バッファー（AH）の添加後UASt- myrGCaMP5（シアン）とUASP -F-Tractin.tdTomato（マゼンタ）を発現するショウジョウバエの卵を成熟します。 Ca ²⁺波は後極から開始し、 図1のように回復します。アクチンが白矢頭（H 対 A）、時間の経過とともに変化しているように見えます。成熟卵の中心で^の Ca ²⁺シグナルの検出の欠如は、画像キャプチャ中にサンプルの移動によるものです。スケールバー=50μmです。 =40μmの最大投影。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルの最初の重要なステップは、成熟した卵子を損傷することなく分離することです。これは、解剖プローブで卵を異邦人に操作することで達成できます。練習すれば、卵に損傷を与えることなくこの操作を実行することができます。2番目の重要なステップは、活性化バッファーを油中の成熟卵に適用するときにサンプルの損失を回避することです。活性化バッファーの塗布は、カバーガラスに接触せずにゆっくりと行う必要があります。顕微鏡のセットアップでサンプルに簡単にアクセスできない場合、このステップは困難になる可能性があります。温度インキュベーターなどの顕微鏡の腋下部分を動かすことをお勧めします。

このプロトコルの変更は、卵の活性化時にCa²⁺ の代わりに、他の蛍光タグ因子を視覚化するために行うことができます。より一般的には、 ショウジョウバエ の発生のさまざまな段階または異なるバッファーを追加した結果を、このプロトコルを使用して分析できます。

顕微鏡の設定がサンプルからの信号を視覚化するのに最適でない場合は、トラブルシューティングが必要になる場合があります。これは、レーザー出力の増減、キャプチャ範囲の変更、Zスタックパラメータの調整によって実現できます。別の問題は、活性化バッファーを追加すると卵が一貫して視野外に移動することです。これが定期的に起こる場合は、成熟した卵子をカバーガラスに15〜20分間、より長い時間落ち着かせます。高粘度のオイルを使用すると、活性化バッファーによるオイルの置換が変化することに注意してください。

ここで紹介するこの技術は、対物レンズの作動距離、成熟卵の脱水、および成熟卵を損傷することなく解剖する能力によって制限されます。しかし、成熟卵母細胞が成体女性を通過して沈着する in vivo イメージング法と比較すると ¹³、私たちの方法は、より高い空間分解能、活性化前に成熟卵子を物理的に操作するオプション、および受精なしで卵子活性化の役割をテストする能力を可能にします。

卵の活性化における細胞成分のレポーター構築物のテストや、変異体バックグラウンドにおけるCa²⁺ 波の視覚化など、この技術の将来の応用の可能性は数多くあります ^14,24。実験的および遺伝的ツールとともに、ここで紹介する ex vivo 卵活性化アッセイは、普遍的に保存されたCa²⁺ 波のトリガー、伝播、および下流の影響の研究を可能にします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
乾燥活性酵母	Fleischman's	#2192
解剖顕微鏡	ライカ	MZ6	各種
Lamp	Mircotec 光ファイバー	MF0-90	各種
医療用ワイプ	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
マーカーペン	Stabilo	841/46	OHPenユニバーサル、ブラック - ほとんどの文房具店で入手可能です。超極細幅 0.4mm
CO2パッド	ジェネシー・サイエンティフィック	59-114 (789060 ダッチャー)
カバースリップ No. 1.5, 22 x 50 mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T
ハロカーボンオイル、シリーズ95	ハロカーボンプロダクツ株式会社	ヨーロッパのディストリビューター:
Solvadis(GMBH)
Oil 10 S	VWRケミカルズ	24627.188	Halocarbonオイルの代わりに使用できます、シリーズ95
鉗子	ファインサイエンスツール	11252-00	これらのツールはきれいであるべきですが、オートクレーブの使用は必要ありません、エタノールで十分です。
プローブ	ファインサイエンスツール	10140-01
ガラスピ	ペットフィッシャーブランド、	FB50251	パスツールピペット、ガラス、プラグ抜き、長さ150 mm
バイアル	レジーナインダストリー	ズP1014	GPPS  80 mm x 25 mm