マウスにおける高次反復行動のための電位アッセイとして新規物体探査

サマリー

高次の制限された反復行動(RRB)は、影響を受けた人々の生活を混乱させます。 これらの行動はげっ歯類でモデル化するのが難しく、RRBの潜在的な治療法や介入に関する基本的な生物医学的研究を困難にしています。 ここでは、マウスの高次RRBの潜在的なアッセイとして、新規オブジェクトの探索について説明します。

要約

制限された反復行動(RRB)は、自閉症スペクトラム障害(ASD)の中核的な特徴であり、影響を受けた人々の生活を混乱させます。 RRBは一般的に低次成分と高次成分に分けられ、低次RRBは運動ステレオタイプで構成され、高次RRBは固執行動とシーケンシング行動で構成されます。 高次RRBは、マウスでモデル化するのが困難です。 マウスにおけるRRBの現在のアッセイは、主に低次成分に焦点を当てているため、高次RRBの潜在的な治療や介入に関する基本的な生物医学研究は困難になっています。 ここでは、新しいアッセイ、新しい物体探索について説明します。 このアッセイでは、4つの新しいオブジェクトが周囲に配置された基本的なオープンフィールドアリーナを使用します。 テストマウスはアリーナを自由に探索することができ、マウスが新しいオブジェクトを調査する順序が記録されます。 これらのデータから、パターン化された探索のシーケンスを同定することができ、各マウスに最も好ましい物体を特定することができます。ここで共有した代表的なデータと、新規オブジェクト探索アッセイを用いた過去の結果は、近交系マウス系統がこのアッセイで異なる挙動を示し、低次RRBが上昇した系統もパターン化された挙動を示すことを示しています。 このように、新規オブジェクト探索アッセイは、ヒトの高次RRBに対して良好な顔の有効性を持っているように思われ、ASDの新規治療法を調査する将来の研究にとって貴重なアッセイになる可能性があります。

概要

社会的障害、困難言語を介して通信して、その繰り返しのパターン化された行動^1：自閉症スペクトラム障害（ASD）は、3つの中核症状からなる神経発達障害です。 2000年以来、ASDと診断された個体の数は、10年²のスパンで68で1に150に1から増加しています。疾患の有病率は増加し続けているが、障害の原因は、まだ知られていません。これらのモデルは、ASDの根本的な症状や原因の増加の理解につながる可能性として、ASDのコアとそれに関連する症状に応じて適切なマウスモデルを識別するための努力の上昇がありました。反復行動^3を含むASDの中核症状のための表面的妥当性と行動を表示するように表示される複数の近交系マウス系統があります。

制限付き、反復行動（のCFM.rrb）は、ASDのようないくつかの精神疾患の中核症状です。CFM.rrbは、障害⁴の重症度に高めることができ、かつ大幅に影響を受けた個人のライフスタイルを混乱させることができます。 CFM.rrbは一般に二つのカテゴリー、ヒトでは、このようなロッキングと手羽ばたきなどのアクションで構成され、下位反復行動、中に配置されています。ルーチンと抵抗に厳守で構成されて高次反復行動は^、5-8を変更します。

下位反復行動は広く、彼らは簡単に^9を設定^し 、実験室で観察することができるモータ常、として現れるげっ歯類で研究されてきました。これらの行動は、ヒトでのCFM.rrbのための良好な表面的妥当性、および潜在的に強力な構成概念妥当性だけでなく^10を有するように見えます。下位のCFM.rrbの存在のためのテストは、これらのモータ常¹¹の発作と期間を研究するためにマウスの活動の映像監視を経て完成することができます。高次反復行動は、基本的な生物医学再ための課題を提起しますこれらのCFM.rrbとして簡単な観察で識別されていないとして、げっ歯類を用いて検索します。これらの行動を特定することが困難に、より高次の反復的な行動のための少数の確立されたアッセイが存在します。伝統的には、高次のCFM.rrbは、試験動物が逃げるに能力に到達するように訓練された迷路のパラダイムを用いてげっ歯類において測定されました。逃げ場所が次に切り替えられ、逃げ場所を再学習するのに必要な試験の数が^12に記録されています。これらのアッセイは、彼らが長い訓練期間を必要とする、多くの場合、不安を誘発し、非常に可変な結果をもたらすことが理想的ではありません。ホールボード探査も高次のCFM.rrb ^13,14を定量化するために使用されてきました。このアプローチは、拡張されたトレーニングセッションを必要としませんが、食品のモチベーションおよび/または嗅覚差別に依存していません。不安惹起されないか、訓練を必要とする高次のCFM.rrbについてのアッセイは、正孔ボードの既存のレパートリーに素晴らしい補完するだろうexploratio現在使用中のnと迷路に基づくアッセイ。

C58 / J（C58）近交系マウス系統が強くASD、すなわち繰り返し、目的のないモータ常と自己グルーミング^3,11のレベルの上昇に関連した常同行動の高いレベルを例示しています。さらに、C58マウスは、バックフリップと^11,14,16を scrabbling、飼育の高いレベルを介してのCFM.rrbを表示します。この株は早期新生児期にこれらの動作を示す始まり、成人期を通して、それらを表示し続けます。この株だけでなく、他のマウス系統に存在する十分に立証された下位のCFM.rrbを補完するために上昇し、高次のCFM.rrbの存在をテストすることができることが理想的です。新規物体探索アッセイは、ここで説明し、それがパターン化された行動だけでなく、反復運動常を測定する能力を与えるように、研究者が同時に下位と上位のCFM.rrbを観察する機会を提供します。

高次反復行動のためのアッセイは、ピアソンらによって開発されたとして、新規物体探索を使用してe_content "> ^17。この新しい評価では、4つの新たなオブジェクトの追加で十分に確立されたオープンフィールド試験^18-21の延長でありますアリーナ。マウスは自由にこれらの不慣れなオブジェクトを調査させ、物体の調査の数及び順序を追跡した。目的の調査は、その後BTBRマウスは、オブジェクト間のパターン化された調査の高められた数値を表示して、パターンの存在について分析した。これを使用して不要な刺激を取り除くだけでなく、行動を学習する必要性を排除しながらアッセイは、マウスは、より高次の繰り返しやパターン化行動を表示することができます。新規オブジェクトの探査は、高次のCFM.rrbを誘導し、それはマウスがその自然の探査を通じてパターンやフォームのシーケンスを作成することができますようにこのアッセイを使用する研究者は、これらの高次のCFM.rrbの存在を定量化することができます。

ピアソンら 。このアッセイを開発し、興味深い結果¹⁷で、BTBR近交系マウス系統における潜在的な高次反復行動の存在をテストするためにそれを使用。我々は最近、C58、C57BL / 6J（C57）およびFVB / NJ（FVB）株の行動を見てフォローアップ調査、ならびに、このアッセイに存在する潜在的な交絡変数へのより詳細な調査、および可能性を発表していますデータを分析する統計的アプローチは^、22を生成^しました。

プロトコル

ここで説明するプロトコルは、レッドランズ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 C58、C57、およびこれらの研究で使用されるFVBマウスは、もともとジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から入手したストックから大学レッドランズのビバリウムで飼育しました。このビバリウムからセンチネルは、半年ごとにスクリーニングし、病原体の自由であることが判明しました。

1.機器・ルームセットアップ

注：私たちは、新規オブジェクトのテストのために二つの異なるアリーナを使用：41センチメートルのベース直径を有する透明なプラスチック製の長方形のケージを（45センチメートルのx 24センチメートル×20センチ）または不透明な円形ケージ。しかしながら、任意のケージを使用することができます。ピアソンらは、そのアッセイにおいて小さい矩形ケージ（20 cmの×30 cmの×20センチ）を使用しました。この具​​体的な実験設計から詳細は下記含まれていますが、このアッセイの新規性を与えられて、説明変数のいずれかのための行動表現型のフィールド内には受け入れられた規格はありません。

1. はトウモロコシ穂軸寝具の中で約1/2で試験領域を埋めます。
2. 四つの異なる新たなオブジェクトを選択します。洗浄を容易にし、形状と色の咀嚼互いに異なるに抵抗する高密度プラスチックで構成され、ほぼ同じ大きさの4つのオブジェクトを選択します。重要なのは、その試験マウスは、アッセイで実行されるまで、これらのオブジェクトにさらされないようにします。
   注：たとえば、ピンクのおもちゃのレンガ、赤い猿、青の書き込みと白のタイルと標準白色ダイは、ここで使用しました。
3. 長方形の分野では、これらのオブジェクトのコーナーから約3cmを配置します。ラウンドアリーナでは、それらが等しい互いからの距離や側面から約10cmであるようにオブジェクトを配置します。別の番号、1-4（ 図1）のように、各オブジェクトの配置を記録します。オブジェクトは、テスト全体にランダムまたは相殺順に配置されていることを確認してください。
4. テストの真上にカメラを置きます順化及び試験期間中にアリーナ全体を記録するアリーナ。
   注意：潜在的にテスト中に活性レベルと探査に影響を与えることができるマウスと同じ部屋に捜査を持ちます。

2.新規物体探査テスト

1. 約100ルクスでの蛍光灯で照明室内の光サイクルの開始時にテスト。照明はビデオ録画しながら外観を標準化するために試験領域全体に均一であることを確認してください。
2. 試験領域の底に既知の寸法のノートカードを置き、ビデオ録画を開始します。
3. 順応期間として機能するように10分間、空試験領域に試験マウスを転送します。動画の記録順応期間。
4. 順応期間の後、すぐにテストアリーナに4小説オブジェクトを追加し、さらに10分間のマウスの行動を記録し、アリーナでマウスを残します。
5. 完全な20分順化/テストPEいったんriodが経過した、そのホームケージ、徹底的にきれいに試験マウスを返し、無香皿の石鹸と水で、新規オブジェクトや試験領域を乾燥させます。

3.ビデオ得点

1. 信頼性を容易にするためにビデオを使用して、すべての行動スコアリングを完了します。
   注意：行動ロギングソフトウェアNoldusザ・オブザーバーは、ここで説明したようにステップ^22を実行するために使用されたが、専門的なプログラムは必要ありません。
   1. 最初のビデオを採点する前に、新しいプロジェクトを作成したり、既存の、同様のプロジェクトを編集して行動ロギングソフトウェアでのプロジェクトの符号化方式を設定します。
      1. プロジェクトセットアップボックス内にデータ収集を設定する」オフライン観測」。行動の中で「国家のイベント」として、ボックス、プログラム「スクラブル」をコーディング」掘り」、「飼育」、「グルーミング」と「スニフオブジェクト1、2、3、4」。 「ポイントイベント」などの番組「ジャンプ」。注：定義これらの行動のための他の場所¹¹に詳細に記載されています。
         注：ポイントイベントは、単にカウントデータを収集する一方、国家のイベントは、スタートを持っていると時間を停止します。各個別の行動のためのキーストロークは、ソフトウェアによって生成され、これらに対応するキーストロークは、二次キーボード（ステップ3.1.2）にプログラムされています。
      2. 、二次キーボードをプログラムするキーボードソフトウェアを開き、画面に表示された適切な二次キーボードボタンをクリックし、適切なキーの組み合わせを入力し、[OK]をクリックします。二次キーボードがプログラムされたら、コンピュータのバックグラウンドで実行するプログラムなどのソフトウェアを閉じます。
   2. プロジェクトとが設定されると、数および後部の持続時間（両方の前足のように定義されたアリーナの壁に置かれている）を獲得するために行動ロギングソフトウェアを使用して、マウスがに穴を掘るの2前足のように定義された（掘りますmと定義されたアリーナの寝具）、自己新郎（自分自身の体および/またはその前足で顔のどの部分に触れるマウス）​​の任意の領域を舐め、そしてジャンプウーズ（マウスの飼育と定義され、すべての4つの足が同時に地面を離れているように、次に）ジャンプ。
      1. ビデオを得点、[ファイル]> [プロジェクトを開くと、その後観察する>観測>新規。プログラムは、ファイル名の入力を要求します。名前の後は、適切なビデオのメディアファイルを選択します。
      2. 観測を開始]ボタンをクリックしてスコアリングを開始します。
         注：マウスの​​反復的な行動をスコアリングすると、すべての状態イベントは、動作の開始に対応する第1および第2の行動の端部に対応する、2キーストロークが必要です。ポイントイベントは、唯一のキーストロークが必要です。
   3. マウスが各オブジェクトを嗅い回数をスコア。スニフは、マウスがオブジェクトから0.5 cm以内にその鼻を移動させ、任意の時間として定義されています。 REPET同じように行動ロギングソフトウェアを使用して、スニフ期間を測定しますitive動作期間は（ステップ3.1.2）で測定しました。
      1. マウスがオブジェクトを盗聴するたびに、10分の試験期間（ 例えば 1243421 ...）の終わりまでの数字の文字列につながる対 ​​応する位置の数を記録します。手動でこれらのデータを記録します。
         注：動画を得点しながら、数字は常にオブジェクトを、指​​定された位置にない対応し、効率性と一貫性を容易にするために。
      2. マウスがオブジェクトを盗聴した場合、その倍の数をカウントし、再びオブジェクトを盗聴、離れて見えます。
      3. 完全な10分の映像が得点した後、行動分析]> [新規]> [分析をクリックすることで、データを視覚化。いったんデータをエクスポート、画面に表示されるか、コピーして、別々のスプレッドシートに貼り付けます。
   4. マウスは試験中にアリーナ内の総走行距離を記録します。
      注：試験マウスを追跡し、センチメートルで移動する合計距離を記録するために較正されたビデオ追跡ソフトウェアは、使用されましたこのステップを実行します。ビデオトラッキングソフトウェアによってスコアのすべてのビデオは、ビデオの開始時にアリーナに配置された既知の寸法のノートカードを持っていました。
      1. ノートカードのそれぞれの端に沿って検量線を設定し、ソフトウェアのキャリブレーション画面内の適切な長さを入力することにより、ソフトウェア内の各ビデオを較正するためにノートカードを使用してください。線が描かれると、入力既知の長さと、各行に対応し​​てノートカードの幅。
      2. アリーナの設定の中で、アリーナ全体を選択します。
         注： 例えばのために、対中心を通る壁に沿ってマウスの動きに関心があった場合は競技場の別々の領域がソフトウェアで区別することができます。
      3. 試用コントロール設定の中で、10分の持続時間を選択します。検出設定では、明るい背景に暗い被写体を選択します。
         注：アルビノマウスが使用された場合は背景が暗い影であった場合、これを変更する必要があります。
      4. 設定一回動画をスコア、プログラムされています。買収>開く取得]をクリックします。取得コントロールボックスで、新しい試みをクリックしてから試用を開始。 10分が経過した後、プログラムは停止し、データを視覚化することができます。
      5. >計算統計の分析]をクリックします。いったんデータをエクスポート、画面に表示されるか、コピーして、別々のスプレッドシートに貼り付けます。

4.統計分析、シーケンシング

1. 各マウスによって生成された調査をオブジェクトに対応する数字の文字列の中で、繰り返し番号なしすべての可能な3桁の組み合わせ（ 例えば 121、123、124ではなく112または122）の合計数を識別します。
   注：Pythonプログラミング言語で書かれたプログラムは、それぞれの可能な配列は、数字の文字列に出現する回数を識別するために使用されました。外部プログラムを使用する必要がなく、このステップは、多くの異なる方法を完了することができる（ 例えば、使用しますMicrosoft WordやExcelの検索機能）。
2. 各シーケンスが発生する回数を記録し、各マウスのための3つの最も頻繁に繰り返し配列を同定します。
   注：個々の配列は、マウスによって異なりますし、実際の配列は、配列が繰り返された回数よりも少ない金利（ すなわちパターンとの密着性がパターンそのものよりも重要である）です。
3. シーケンスの総数は、マウスの反復は活動レベルに積極的に相関するので、それぞれの個々のマウスのためのパターンの総数で最も頻度の高いパターンの量を分割することにより、これらの値を修正します。これは、全体的な活動とは独立した反復配列のインデックスが得られます。
4. 各マウスは、適切なANOVA、（ 例えばためのダネット検定）多重比較手順を使用して、グループや事後テスト間（活動レベルについて補正）その最も一般的なシーケンスを繰り返す回数を比較してください。

5。統計分析、オブジェクトの優先順位

1. （ステップ3.1.3.1）上に生成された番号の同じ文字列を使用して、1秒の合計数をカウントして、各オブジェクトを調べた、すなわち合計回数をカウントすることにより各マウスの新規オブジェクトの嗜好を特定し、2秒、3秒、およびデータの文字列に4秒。活動レベルのため、上記のようにANOVAを経由して比較正しい（4.3から4.4ステップ）。
   注：これらのメソッドは、私たちの研究室²²から発行され、説明ここピアソンらに大きく基づいている^17。

結果

メスC58 / Jマウスではなく、長方形の舞台で、ラウンドアリーナで他の株よりも配列決定されたパターン（ 図2、パネルA）の高い数を表示された代表データ²²を示した （ 図2、パネルC）。男性3株のいずれも、互いに（ 図2、パネルBおよびD）とは異なっていません。代表的なデータは、男性と女性の両方のC58 / Jマウスがラウンドアリーナ（ 図3、パネルAおよびC）での最も訪問されたオブジェクト（およびその後、その少なくとも訪問したオブジェクトのためのより低い優先順位）のための強い好みを表示することを示しているではなく、長方形のアリーナ（ 図3、パネルBおよびD）です。

ディスカッション

ここで、我々は、ヒトにおける反復行動高次のための表面的妥当性を持つマウスの行動を定量化するために有用である可能性が最近開発されたアッセイを提示します。バーンズまたはT迷路のようなより確立されたアッセイとは異なり、この新規物体探索アッセイは、任意のマウスの訓練を必要とせず、また挑発特に不安です。さらに、新規物体探索は、関心、のCFM.rrbの行動に、より焦点を可能にし、結果を歪める交絡変数の可能性を減少させること、食べ物や社会的刺激を必要としません。さらに、異なるマウス株は株はまた、新規オブジェクト探査アッセイ^17,22で上昇し、パターニング探査とオブジェクトの好みを示す上昇下位のCFM.rrbを実証して、このアッセイでは、差動動作を示しません。このように、このアッセイは、ヒトでのCFM.rrbに優れた顔の有効性を有すると思われます。アッセイは、将来の研究者によって変更された場合、そのままに有益であろう上記の利点、すなわち必要な訓練の欠如と不安を誘発する刺激の最小化に留意。アッセイで使用される新規オブジェクト（セクション1.2）の選択が極めて重要です。オブジェクトは、清掃が容易であるが、外観ははっきりと同じサイズであ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
標準的なポリカーボネート製げっ歯類ケージ(45 cm x 24 cm x 20 cm)			複数のマウスのテストを容易にするためには、複数のケージが望ましいです。
プラスチック不透明円形テストアリーナ(ベース直径41cm)	United States Plastic Corp.	13931	複数のマウスのテストを容易にするためには、複数のアリーナが望ましい
標準的なトウモロコシの穂軸げっ歯類の寝具
の小説オブジェクト - 赤い猿	猿のバレルから	ポータケットRI
小説オブジェクト - 長方形の2 x 4 LEGO
小説オブジェクト - タイル	トゥートとオットーの	レクサンドリアVA
小説オブジェクト - 標準的な白いダイ
ビデオカメラ
行動ログソフトウェア - オブザーバー	ノルダス、ワーヘニンゲン、オランダ	他のプログラムは、
ビデオ追跡ソフトウェア - EthoVision	ノルダス、ワーヘニンゲン、オランダ	他のプログラムは、
	ウィリアムズタウン、ミシガン州