干渉のないマイクロ/ナノ粒子の細胞工学のためのマイクロ流体緩衝液交換

Summary

このプロトコルは、非結合粒子を効率的に枯渇してマイクロ/ナノ粒子操作された細胞を精製するために、慣性マイクロ流体ベースのバッファ交換戦略の使用を記載しています。

Abstract

活性成分ロードマイクロ/ナノ粒子を有する細胞を操作する（NPS）は、ネイティブの治療特性を向上させるバイオイメージングを可能にし、細胞表現型を制御するために、ますます一般的な方法になってきています。クリティカルまだ不十分な対処の問題は容易に従来の遠心分離によって除去することができない細胞標識後に結合しないままの粒子のかなりの数です。これは、バイオイメージング、バックグラウンドノイズの増加をもたらし、隣接する非標的細胞に変革効果を付与することができます。このプロトコルでは、我々は効率的に高スループットの方法で遊離のNPから標識細胞を分離するためのディーン・フロー分画（DFF）と呼ば慣性マイクロ流体ベースのバッファ交換戦略を提示します。未結合の蛍光色素又は染料装填のNP（SILの> 95％の枯渇を達成しながら開発スパイラルマイクロデバイスは、新たな緩衝液に懸濁精製細胞（THP-1およびMSC）の連続的な回収（> 90％の細胞回復）を容易にしますICAまたはPLGA）。このシングルステップ、サイズに基づく細胞の精製戦略は、高いセル処理能力（10 ⁶細胞/分）を可能にし、干渉のない臨床応用を実現するために、マイクロ/ナノ粒子操作された細胞の大容量セルの精製に非常に有用です。

Introduction

エージェントにロードされたマイクロ/ナノ粒子（NPS）によって細胞を操作するには、バイオイメージング能力を高め、再生医療において、ネイティブの治療特性を補う/強化するために、単純な、ゲノム組込みフリーで、かつ汎用性の高い方法^。1-3携帯修正は標識することによって達成されますエージェントにロードされたNPの過剰濃度の形質膜や細胞質は結合部位を飽和させます。しかし、この方法の主な欠点は、潜在的に、粒子操作された細胞の正確な同定を混乱させるまたは治療結果を複雑にすることができる細胞標識工程の後に溶液中に残存する未結合の粒子のかなりの量である。また^4,5、変革を含むのNPへの曝露過度に高濃度の薬剤（成長因子、コルチコステロイド、 等）は、非標的細胞に意図しない結果を誘導し得る細胞毒性および誤った露出を引き起こす可能性があります。 Oを備えても粒子状キャリアF「生体適合性」材料[ 例えば 、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）、PLGA]は同様に、一定の条件の下で強力な免疫細胞応答を扇動することができます^。6これは、免疫障害（ 例えば 、関節リウマチ）、潜在的な遅延を有する個体において特に危険です全身ナノ粒子のクリアランス^。7したがって、従来の粒子-操作された細胞の導入に自由粒子の効率的な除去は、毒性プロフィールを最小化し、in vivoでのエージェントにロードされた粒子に見当違いの露出....

Protocol

間葉系幹細胞と単球の1ナノ粒子（NPS）ラベリング

1. ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養間葉系幹細胞（MSC）は、標識前に≥80％コンフルエントに10％ウシ胎児血清（FBS）および抗生物質を補充しました。同様に、約10 ⁶細胞/ mlの密度まで、10％FBSを補充したロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地中で培養THP-1細胞（ATCC）。
2. ロードシリカのNP（〜500μm）で一晩攪拌を使用して、カルセイン染料溶液（200μM）を持ちます。以前に記載されたプロトコルを使用して、PLGA-カルセインAM（CAM）を製作してください^。22
   1. 4℃のクロロホルム中に250μgのCAMおよび100mgのPLGA（50:50）に溶解します。
   2. 室温で高速ホモジナイザー（13,600×gで、60秒）を使用して、単一乳剤のNPを生成します。 （二重distiを洗浄し、遠心分離を用いて収集する前に、化学フード（≥3時間）（5分間3400×gで）でクロロホルムを蒸発させ、満たさ水）は、凍結乾燥およびストレージを-20℃に。
3. 20分 - CAM-PLGAのNP（1ミリグラム）または15室温で0.01％のポリ-L-リジン（PLL）溶液中のカルセインシリカのNP（150μgの）をインキュベートします。
4. 5分間、3400×gで遠心分離し、それぞれの培地の1ミリリッ....

Results

一晩バイオイメージング剤を装填したNPで細胞を標識した後、（自由粒子を含む）標識された細胞を回収し、単一ステップのプロセス（ 図1A）に無料のNPを除去するために、DFFのスパイラルマイクロデバイスによって精製しました。 2-入口、2-コンセントスパイラルマイクロチャネルは、SU-8フォトレジストを用いたエンジニアリングソフトウェアによって設計され、微細加工されています。パターニングされたシリコンウェハは、次いで、ソフトリソグラフィー技術（ 図1B）を使用してPDMSレプリカ成形用の鋳型として使用されます。内壁入口は細胞サンプル流を挟むために、より高い流量（1:10）で、新鮮な緩衝液を実行しながら、細胞選別を行うために、細胞試料は、スパイラルマイクロデバイスの外壁の入口に圧送されます。分離は慣性が内壁と外壁（ 図2A）に向かって小さな未結合のNPのディーンによって誘発される再循環でより大きな標識細胞のフォーカシングによって達成されます。装置は、第一アプリでしたカルセイン（.......

Discussion

本明細書に記載されDFF細胞精製技術は、ハイスループット様式で標識された細胞の迅速かつ継続的な分離を可能にします。この分離法は、大きな試料体積または高細胞濃度の試料処理のために理想的であり、長期間の使用後に目詰まりを起こしやすい従来の膜ベースの濾過よりも良好です。同様に、親和性に基づく磁気分離は面倒かつ高価である追加の細胞標識のステップを必要とします。精製された細胞は、<（チャンネル内により短い滞留時間に（〜200〜250ダイン/ cm ²のせん断応力τ、）最小限の流れ/せん断によって誘発される効果とよく（ 図3）、その標識された薬剤と細胞の形態を保持していることが示されています1秒^）20,24。また、ユーザは、単に所望の媒体または緩衝液とシースバッファー（生理食塩水）を代入することによりソート標識細胞の溶出液を選択することができます。

それはすることが重要です悪セルフォーカシング動作に影響を与えることができ、マイクロチャネル使用前には埃やゴミがありません。これはIPAで十分に入口穴を洗浄、並びにプ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
細胞株 &培地
間葉系幹細胞(MSC)	ロンザ	PT-2501
ダルベッコ'修正されたイーグル」Lonza		12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
THP-1 単球細胞 (THP-1)	ATCC	TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media	Lonza	12-702F
Reagents &原材料
0.01% ポリ-L-リジン (PLL)	シグマ-アルドリッチ	P8920
3 ml シリンジ	BD	302113	ml ルアーロック
60 ml シリンジ	BD	309653	シリンジ 60 ml ルアーロック
牛血清アルブミン (BSA)	Biowest	P6154-100GR
Calcein, AM (CAM)	Life Technologies	C1430
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Isopropanol	Fisher Chemical	#P/7507/17	HPLC グレード 2.5 L
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Lonza	17-516Q/12
Plain Microscope Slides	Fisher Scientific	FIS#12-550D	75 x 25 x 1 mm3
ポリジメチルシロキサン (PDMS)	ダウコーニング	SYLGARD® 184
スコッチテープ	3M	21200702044	18mm×25m
シリカNPs(∼200 μm)	Sigma-Aldrich	748161	細孔径 4 nm
シリンジチップ	JEC 技術	7018302	23 G 0.013 x 0.25
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056
Tygon Tubing	Spectra-Teknik	06419-01	0.02 x 0.06" 100
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50)	Sigma-Aldrich	P2191
Equipment
Biopsyパンチ	Harris Uni-Core	69036-15	1.50 mm
Dessicator	Scienceware	111/4 IN OD
ハイスピードカメラ	ファントム	V9.1
倒立位相差顕微鏡	ニコンエ	クリプスTi
プラズマクリーナー	ハリックプラズマ	PDC-002
シリンジポンプ	Chemyx	CX Fusion 200