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方法論記事

in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

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DOI:

10.3791/54329

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2016年8月20日

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1Department of Ophthalmology, Far Eastern Memorial Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, National Taiwan University, 3Department of Ophthalmology, National Taiwan University Hospital, 4College of Medicine, National Taiwan University

この記事について

サマリー

ウシ角膜内皮細胞の初代培養は、角膜内皮間葉移行のメカニズムを調べるために使用しました。さらに、ラット角膜内皮cryoinjuryモデルは、in vivoで角膜内皮間葉移行を示すために使用されました。

要約

角膜内皮細胞(CEC)は、活発なポンピングを通じて角膜の透明度を維持する上で重要な役割を果たします。CEC数の減少は、角膜浮腫や視力の低下につながる可能性があります。.しかし、ヒトCECは増殖能力が損なわれやすい傾向があります。さらに、細胞増殖の刺激は、漸進的な内皮間葉転換(EnMT)によってしばしば複雑になります。したがって、EnMTのメカニズムを理解することは、適切な機能を持つCECの再生を促進するために必要です。本研究では、角膜ボタンからDescemet膜でCECを剥離することにより、ウシCECの初代培養を調製し、in vitro培養において、ウシCECが表現型の変化、β-カテニンの核内移動、EMT制御因子のカタツムリとスラッグなどのEnMTプロセスを示すことを実証した。さらに、ラット角膜内皮凍結損傷モデルを使用して、in vivoでのEnMTプロセスを実証しました。全体として、ウシCECのin vitro初代培養とin vivoラット角膜内皮凍結損傷モデルは、EnMTのメカニズムを調査するための有用なプラットフォームを提供します。

概要

角膜内皮細胞(CEC)は、活発なポンピング1を通じて角膜間質の水分補給状態を調節することにより、角膜の透明度、ひいては視力を維持する上で重要な役割を果たします。ヒトCECの増殖能力が限られているため、細胞数は年齢とともに減少し、損傷後の角膜内皮創傷の修復は通常、細胞の有糸分裂ではなく、細胞の拡大と移動によって達成されます2。CEC数が約500細胞/mm2の閾値を下回ると、角膜間質の脱水状態が維持できなくなり、水疱性角膜症や視力障害につながる3,4。

ヒトCECの限られた増殖能力は、老化細胞における上皮成長因子とその受容体の発現減少5、房水中の抗増殖性TGFβ26、および接触阻害2,7を含むいくつかの要因に起因しています。塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)などの一部の成長因子は、培養されたヒト角膜内皮での増殖を増加させることができますが、培養効率は依然として限定的です8,9。さらに、CECは、ex vivo拡大中に表現型の変化を受けることがあり、これは上皮間葉転換(EMT)10-13に似ている。内皮間葉転換(EnMT)は、細胞結合の不安定化、頂端-基底極性の喪失、細胞骨格の再配列、α平滑筋アクチン発現、およびI型コラーゲン分泌を特徴としています14。これらの特性はすべて、CECの正常な機能を低下させ、組織工学におけるex vivo培養CECの使用を妨げる可能性があります。さらに、EnMTは、フックス角膜内皮ジストロフィーや角膜後膜形成など、いくつかの角膜内皮疾患の病因と関連しています15,16。したがって、EnMTのメカニズムを理解することは、EnMTプロセスの操作に役立ち、CECの再生を促進して適切な機能を可能にする可能性があります。

この研究では、角膜ボタンからウシのCECを分離する方法について説明しました。in vitroでの初代培養では、表現型の変化、β-カテニンの核移行、EMT制御因子のカタツムリとスラッグを含むEnMTプロセスが観察されました。さらに、ラット角膜内皮凍結損傷モデルを用いてin vivoでEnMTを実証する方法について説明しました。これら2つのモデルを用いて、ブロードスペクトラムマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)阻害剤であるmarimastatがEnMTプロセスを抑制できることを実証しました。記載されているプロトコルは、EnMTメカニズムの詳細な分析と、さらなる臨床応用のためのEnMTプロセスを操作するための戦略の開発を容易にします。

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プロトコル

すべての手順は、眼科と視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科計算書の研究のための協会に従う本研究で続き、国立台湾大学病院の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

1.単離、初代培養の準備、およびウシのCECの免疫染色

  1. 地元の食肉処理場から新鮮な牛の目を獲得。
  2. 3分間10％w / vのポビドンヨード溶液中で目を消毒。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液でそれらを洗浄します。
  3. 無菌条件下でのメスやハサミで角膜ボタンを収穫。ピール解剖顕微鏡下でピンセットでデスメ膜は、（本研究では、ウシ目は地元の食肉処理場により摘出していることに注意してください。したがって、最初の研究手順は研究室でpreenucleated目の消毒ありました）。
  4. トライの1ミリリットルでデスメ膜をインキュベート37℃で30分間PSIN。 5分間112×gで遠心分離することによってウシのCECを収集します。補充ホルモン上皮培地（SHEM）HEPES緩衝ダルベッコ改変イーグル培地、5％ウシ胎児血清を補充したハムF12培地、0.5％のジメチルスルホキシド、人間の表皮の2 ng / mlでの等量を含有する1mlの細胞を再懸濁成長因子、インスリンの5 mg / mlで、トランスフェリンの5 mg / mlで、セレン5ngの/ mlのコレラ毒素の1ナノモル/ Lのゲンタマイシンを50mg / mlであり、アンフォテリシンBの1.25 mg / mlで
  5. 6センチメートル皿に細胞（眼あたり約1×10 5細胞）をシード。 SHEM文化それらを。空気中5％のCO 2の雰囲気中、37℃で皿をインキュベートします。 3日ごとに培地を変更します。
  6. 細胞がコンフルエントに達したとき、PBSでそれらを洗浄し、5分間37℃でトリプシン1mlにそれらをインキュベートします。 5分間、112×gで遠心分離することによって、それらを収集します。 SHEMの1ミリリットル中に細胞ペレットを再懸濁します。
    1. 血球計で細胞をカウントします。 24ウェルプレート中のウェル当たり1×10 4の密度、および文化SHEM中の細胞でカバースライド上の細胞をシード。マリマスタットのEnMT抑制効果を調査するために、培養培地に添加しマリマスタットの10μMとSHEM中で細胞をインキュベートし、3日ごとに培地を変更します。
  7. 室温で30分間、4％パラホルムアルデヒドを250μl、pH7.4で指示された時点で細胞を固定してください。 5分間、0.5％トリトンX-100250μlの透過性。 30分間、10％のウシ血清アルブミンでブロックします。
  8. 4℃で一晩アクティブβ-カテニン（ABC）、カタツムリ、およびナメクジに対する一次抗体で細胞をインキュベートします。用いた一次抗体の希釈は1：200。抗体を10mMのPBS、1％w / vのウシ血清アルブミン、および0.09％のw / vアジ化ナトリウムからなる抗体希釈液で希釈します。
  9. 15分間、PBSで2回細胞を洗浄し、インキュベート室温で1時間：アレクサフルオロ結合二次抗体（抗体希釈液で100 1）を持つメートル。
  10. 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを2μg/ mlの細胞をカバーすることにより細胞核対比、15分間、PBSで2回細胞を洗浄し、取り付け溶液抗退色でそれらをマウント。
  11. 20X対物倍率でレーザ走査共焦点顕微鏡を用いて405および488nmでの励起波長での免疫蛍光画像を得ます。

2.ラット角膜内皮Cryoinjuryモデルと房内注入

  1. 2％キシラジン（5.6ミリグラム/キログラム）とチレタミンプラスゾラゼパム（18ミリグラム/キログラム）の筋肉内注射で12週齢の雄性Sprague-Dawleyラットを麻酔。優しく肌のけいれんの不在下で適切な麻酔を確認するために、動物の皮膚をつまみます。
  2. 眼の痛みや瞬目反射を最小限に抑えるために、各ラットの右眼に0.5％塩酸プロパラカインを一滴を植え付けます。植え付けます角膜の乾燥を防ぐために、左眼にテトラサイクリン軟膏。
  3. 液体窒素中でステンレススチールプローブ（直径= 3 mm）を冷却します。 30秒間、右眼の角膜中央にステンレス製のプローブを適用します。頻繁に角膜の乾燥を防ぐための処置中に右眼にPBSを植え付けます。
  4. すぐcryoinjuryた後、0.1％アトロピンおよび0.3％の硫酸ゲンタマイシンを植え付けると、一日一回毛様体のけいれんに起因する眼の痛みを和らげるために、感染を防ぐために。
    1. 手順の後、ヒートランプを使用して温め、そして彼らは、モータ制御を取り戻すまで、15分ごとに、麻酔後にそれらの回復を観察したラットを保ちます。また、回復期間中に角膜の乾燥を防ぐために、右目にテトラサイクリン軟膏を適用します。
  5. 3日間連続して角膜cryoinjuryを繰り返します。
  6. 前述のようにラットの眼の前房内にマリマスタットまたはbFGFのを提供するために、ラットを麻酔。一滴を植え付けます眼の痛みや瞬目反射を最小限に抑えるために、右眼に0.5％プロパラカイン塩酸塩。
  7. 滅菌PBSで眼表面を灌漑。アイリスに上記と平行面でparalimbal透明な角膜で1mlシリンジに取り付けた30 G針を挿入することにより、手術用顕微鏡下で前房穿刺を行います。
  8. 針のベベルアップを回し、少しいくつかの房水を排出し、眼圧を低下させるために角膜の傷を押し下げます。房内薬剤の0.02ミリリットルを注入します。静かに針引き抜きの間綿棒で針管を圧縮します。
  9. 手術用顕微鏡下で指示された時点で、外部の目を撮影します。

3.収穫ラット角膜ボタンと免疫染色

  1. ラットを安楽死させるために、安楽死室でそれらを配置し、毎分室容積の10から30パーセントの充填率で100％のCO 2を吹き込みます。以下のためのCO 2注入を維持します呼吸と色あせた目の色の欠如後の追加分。
  2. 鋭利な刃で角膜輪部でのラットの目を貫通します。角膜輪部に沿って角膜ハサミで角膜をカットします。スライド上の角膜を平ら。角膜が丸まる場合には、追加の半径方向の切開を行います。
  3. 室温で30分間、4％パラホルムアルデヒドを250μl、pH7.4で角膜を修正しました。 5分間、0.5％トリトンX-100250μlの透過性、及び30分間、10％のウシ血清アルブミンでブロックします。
  4. 1の希釈で4℃で一晩ABCに対する一次抗体を用いて角膜をインキュベート：抗体希釈液で200。 15分間、PBSで2回角膜を洗浄し、二次抗体でそれらをインキュベート：1時間室温で（1抗体希釈液中の100）。 4を2μg/ mlの細胞を覆うことによって細胞核を対比染色 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、及び15分間、PBSで細胞を2回洗浄します。
  5. 退色防止マウントソリューションで角膜をマウントします。オビ20X対物倍率でのレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて405と561 nmでの励起波長での免疫蛍光画像をテイン。

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結果

ウシのCECの単離後、細胞をインビトロで培養した。 図1は、ウシのCECの位相コントラスト画像を提示します。コンフルエンスの細胞の六角形は、細胞が細胞単離の間、角膜間質線維芽細胞によって汚染されていないことを示した。 図2に示された時点でABC、カタツムリ及びナメクジに対する抗体を用いて行った免疫染色を示します。 in vitro培養における表現型の変化とは別に、ABCとEMTレギュレータの対応する核内移行を観察した。 図3は、in vitroで培養されたウシのCECのEnMTプロセスに、マリマスタット、広域スペクトルのMMP阻害剤の効果を示す。 図図4は、房内注入しcryoinjury後のラットの外部目の写真を含んでいる。 図5は、Rの免疫染色を示しています房内注射、続いcryoinjury後ABCに対する抗体を用いて行...

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ディスカッション

CECは、細胞増殖中EnMTを受けるそれらの傾向のために知られています。治療目的のためにEnMTプロセスを抑制するための戦略を開発するには、EnMTメカニズムの完全な理解が必要です。我々はEnMT、 インビトロ培養モデルおよびラット角膜内皮cryoinjuryモデルで 、すなわちウシCECを調査するために2モデルを説明しました。我々の結果は、両方のモデルでEnMTプロセスを実証しました。さらに、マリマスタットのEnMT抑制効果は、これらの2モデルが同じメカニズムを共有することを示唆し、両方のモデルで再現されました。

体外培養モデルにおけるウシCECは、操作のしやすさを提供しています。また、以前の研究17,18で採用インビトロ培養モデルにおけるヒトまたは霊長類CECと比較して、ウシの目が大きく、取得が容易であるため、より多くのCECを用意して。私たちの研究では、地元の食肉処理場から除核された牛の目を獲得しました。そのためFRESのウシ目の時...

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開示事項

著者には、宣言すべき競合する金銭的利益はありません。

謝辞

私たちは、国立台湾大学病院医学研究部第二コアラボのスタッフの技術サポートに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
トリプシンサーモフィッシャー サイエンティフィ12604-013
ダルベッコ'S modified Eagle medium and Ham's F12 mediumThermoFisher Scientific11330
胎児ウシ血清ThermoFisher Scientific26140-079
ジメチルスルホキシドSigmaD2650
ヒト上皮成長因子ThermoFisher ScientificPHG0311
インスリン、トランスフェリン、セレン サーモフィッシャーサイエンティフィ41400-045
コレラ毒素シグマC8052-1MG
ゲンタマイシンサーモフィッシャーサイエンティフィック15750-060
アムホテリシン Bサーモフィッシャーサイエンティフィ15290-026
パラホルムアルデヒド電子顕微鏡 科学111219
トリトン X-100シグマT8787 
ウシ血清アルブミンΣ A7906
マリマスタットΣM2699-25MG
抗活性β-カテニン抗体ミルポア05-665
抗カタツムリ抗体サンタクルスsc28199
抗ナメクジ抗体サンタクルスsc15391
ヤギ 抗マウスIgG(H + L)二次ウシCECのABC染色用モフィッシャーサイエンティフィックA-11001
ヤギ抗マウスIgG(H + L)二次抗体サーモフィッシャーサイエンティフィックA-11003角膜内皮ヤ
ギ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体フィッシャーサイエンティフィックA-11008シCECのカタツムリとナメクジの染色用
希釈剤Genemedバイオテクノロジー10-0001
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドールサーモフィッシャーサイエンティフィックD1306
封入剤ベクターラボラトリーズH-1000
レーザー走査型共焦点顕微鏡ZEISSLSM510
キシラジン バイエルN/A
タイルタミンとゾラゼパムビルバックN/A動物用医薬品
プロパラカイン 塩酸塩 眼科用溶液アルコンN/A動物用医薬品
0.1% アトロピンWu-Fu Laboratories Co., LtdN/A臨床薬 
0.3%ゲンタマイシン硫酸塩シンファーグループN / A臨床薬 
基本的な線維芽細胞増殖因子サーモフィッシャーサイエンティフィックPHG0024臨床薬 
ック ック ック 抗体サーラットのABC染色用サーモウ抗体

参考文献

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