この原稿は、新たな三次元肝細胞培養プラットフォーム、逆コロイド結晶足場、および肝細胞の振る舞いを評価するための付随する技術の製造のための詳細なプロトコルを提示します。サイズ制御可能な細孔、相互接続性、および細胞外マトリックスタンパク質をポリ(エチレングリコール)(PEG)足場に結合する能力により、Huh-7.5細胞の性能が向上します。
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この記事について
サマリー
要約
インビトロでの肝細胞の機能を維持する能力は 、生体異物「細胞毒性を試験ウイルス感染を研究し、肝臓での標的薬の開発のために、細胞は、適切な生化学的および機械的な合図を受信するプラットフォームを必要とします。最近の肝組織工学システムは、その高い保水性、細胞によって必要とされる機械的な刺激を提供する能力を与えられた、合成または天然のハイドロゲルからなる三次元（3D）スキャフォールドを採用しています。反転コロイド結晶（ICC）足場、高い空間組織、同型および異細胞の相互作用、ならびに細胞外マトリックス（ECM）の相互作用を可能にする最近の開発、への関心が高まってきました。ここで、我々は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（PEGDA）と粒子浸出法を用いてICC足場を製造するためのプロトコルを説明します。簡潔には、格子は、後のプリpolyme微小球粒子から形成されていますRの溶液は適切に重合し、添加し、次いで、粒子を有機溶媒（ 例えば、テトラヒドロフラン）を使用して、除去し、または浸出されます。メディアをより簡単に細胞に到達することを可能にする制御された細孔サイズとinterconnectivitiesを有する高度に多孔質足場の格子結果の解散。このユニークな構造は、細胞が同様に簡単に毛穴の間の通信、およびタンパク質とPEGDAのICC足場はまた、電池性能に顕著な効果を示してコートする能力のことを遵守するための高い表面積を可能にします。私たちは、生存能力の点で足場の形態と同様に肝細胞癌細胞（ホ-7.5）行動を分析し、ICCの構造およびECMコーティングの効果を調査するために機能します。全体的に、この論文は、組織工学における幅広い用途を持つ新興足場、特に肝組織工学の詳細なプロトコルを提供します。
概要
肝臓は、血液の解毒、生体異物の代謝、および血清タンパク質の産生を含む多数の機能を有する高度に血管器官です。肝臓組織は、複数の細胞型、毛細胆管、正弦波、及び異なるバイオマトリックス組成物と異なる酸素濃度のゾーンを含む、複雑な3次元（3D）微細構造を有します。この精巧な構造を考えると、 インビトロ 1 における適切な肝臓モデルを作成することは困難でした。しかし、薬物毒性2をテストし、肝臓3に関連する疾患を研究するためのプラットフォームとして、ヒト肝細胞をホスティングしているin vitroモデルにおける機能の需要があります。
現在の肝臓組織工学プラットフォームは、肝臓のパラメータ、セル4の、すなわち共培養、透明帯の生化学的組成の、1を単離し、または数に着目して、肝臓の複雑さを単純化していますリットルの微小環境5、流体力学6,7およびバイオマトリックス8の構成。バイオマトリックスの構成は、このような足場材料、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の組成は、マトリックス剛性だけでなく、足場の設計や構造などのパラメータに分けることができます。曲ヒドロゲルの機械的性質、生物活性、および分解速度の能力を考えると、合成ヒドロゲル、特にポリ（エチレングリコール）....
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プロトコル
1. ICCの足場の作製（図1）
- ポリスチレン（PS）格子（;ビーズの8-13層直径= 6 mm）を準備します。
- 金型を製造するために、40μlのレベルで0.2ミリリットル沸騰プルーフマイクロ遠心チューブからヒントを遮断します。防水接着剤で24×60 mm 2の顕微鏡カバーガラススリップにカットチューブの上部を接着。
- 慎重に水懸濁液をピペット、およびバイアルに70％エタノール溶液の18ミリリットルを追加し、20ミリリットルバイアルに水懸濁液中に含まれるPS球（直径= 140μm）を置きます。集約された球を緩めるために、超音波浴中に球体液を入れてください。完全に水と水溶性成分を除去するために、この洗浄工程を数回繰り返します。
- 鋳型に100μlのエタノールをピペット。
- 4ミリメートルによって200μlのマイクロピペットチップの上部をカットします。二回達成するために、200μlのマイクロピペットを用いて、金型内に球体のピペットを25μl各型で総容量50μl。
- 120 rpmで一晩ロッキングシェーカー上金型を置きます。
- 光学顕微鏡下で各型の中での球の配置を確認してください。球体が六角形に順序付けされていない場合は、70％エタノールの50μlを添加し、配置を補正するために、長手方向及び横軸方向に手動で振ります。
- 2泊室温（RT）でエタノールを蒸発させてください。 PSビ....
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結果
ICC足場の構造的特徴と肝細胞を培養することで、各ICC足場条件の有効性を比較するための代表的な結果が示され、以下に説明されています。これらの結果に使用されるICC足場条件は、0μgの/ mlの（ベア）のコラーゲンコーティングを20μg/ mlの（コラーゲン20）を200μg/ mlの（コラーゲン200）、及び400μgの/ mlの（コラーゲン400）と初期あります許-7.5細胞播種数は1×10 6です。
ICCの細孔の相互接続と足場トポロジのキャラクタリゼーション。
SEMイメージングは、ICC足場の固定及び凍結乾燥後、最初のICCの細孔との間の適切な相互接続を形成したかどうかを判断するために足場トポロジ上の様々なコラーゲン濃度のコンジュゲーションの効果を確認するために使用されました。二次元の定量分.......
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ディスカッション
組織工学足場は急速にすべての、再生、維持、または薬物を、疾患を研究開発、臓器置換の適用のための組織を修復するために必要な物理的および生化学的手がかり、および他の多くの57を提供するように進化しています。肝組織工学では、初代ヒト肝細胞は急速にエンジニアリング足場と肝機能を維持するための開発プラットフォームのための大きい必要性を作成し、一度本体から分離され、それらの代謝機能を失います。 試験管肝細胞培養プラットフォームの電流は異なる生体材料を利用してきました。この分野の研究は、このようなECMタンパク質構成58,59、共培養60,61、および62を微細としてin vivoでの肝微小環境のさまざまな機能を、模倣に集中してきました。しかし、制御された多孔性と高い空間組織と足場の欠如がありました。この点において、記載ICC細胞培養platfORM、その等方性の特性と高い組織と、このボイドに対処しています。我々は、ICC PEGDA足場は肝細胞を培養するのに適したプラットフォーム、肝細胞のモデル細胞型であ.......
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開示事項
著者らには、開示すべき競合する金銭的利益はありません。
謝辞
著者らは、国立研究財団フェローシップ（NRF -NRFF2011-01）と競争的研究計画（NRF-CRP10-2012-07）からの支援を承認したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.2 ml PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | 耐沸騰 |
| 性ゴリラ接着剤 | Gorilla Glue, Inc. | ベンダーによって異なります。これは地元の店から購入しました。 | |
| スライドガラスVWR | 631-1575 | 寸法:24回;60 mm2 | |
| >ポリスチレン球 | Fisher Scientific | TSS#4314A | 直径 = 140 µm;3x104粒子/ミリリットルおよび1.4%サイズ分布 |
| エタノール | メルク | 1.00983.1011 | 分析EMSUREのための絶対。Milli-Q 水で 70% に希釈 |
| 浴 | Elma | S10H | Equiment |
| Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
| 200 & micro;l ピペットチップ | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| ロッキングシェーカー | VWR | 444-0142 | |
| ポリエチレングリコール (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4 kDa; PEG モノマーのアクリル化と得られた沈殿物の精製により、Mw = 4.6 kDa |
| の遠心分離機 | のベックマン・コールター | 392932 | 装置 |
| アクリル酸塩ポリ(エチレングリコール) - スクシンイミジルの吉草酸 | レイサン生物 | ACR-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
| 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vortex | VWR | 58816-123 | 装置 |
| 微量遠心分離機 | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Paraffin Film | Parafilm M | #PM996 | 9インチに保たれ、強度は10.84 mW/cm2 |
| >Bluewave 200 UVスポットライト | ブレイズテクノロジー | 120008, 122300 | |
| テトラヒドロフラン (THF) | メルク | 107025 | |
| オービタルシェーカー | ハイドルフ | 543-123120-00-5 | |
| コラーゲン I 型 | Sigma Aldrich | C3867-1VL | ラット 1x, CaCl<サブなし>2 &MgCl<サブ>2;pH = 7.2 |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10 x 10 ml |
| パラホルムアルデヒド | VWR | 43368.9M | 機器 |
| Freezone 4.5凍結乾燥機 | Labconco | 7750020 | 機器 |
| スパッタコー | ターJeol Ltd. | JFC-1600 | 装置 |
| 走査型電子顕微鏡 | (株) | JSM 5310 | |
| Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I Abcam | ab6308 | ||
| Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L グルコース w/ L-Gln | Lonza | 12-604F | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| 100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0.25% トリプシン EDTA | Gibco | 25200-056 | 機器; 37 °C、5%湿度 |
| Forma Steri-Cycle CO2インキュベーター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 371 | |
| ハウサーブライトライン相血球計 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 02-671-6 | |
| 哺乳類細胞用生/死生存能力/細胞毒性キット | ライフテクノロジー | ズ L3224 | |
| CCK-8 Assay | 同人堂研究所 | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
| Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | ||
| Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| 抗マウス一次抗体 (CYP3A4, アルブミンに対して) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 ラベル付き Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| クロロホルム | VWR | 22706.326 | |
| イソプロパノール | フィッシャー サイエンティフィック | 67-63-0 | |
| DPEC 水 | サーモフィッシャー サイエンティフィ | AM9916 | |
| ナノドロップ2000c 分光光度計 | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | バイオ・ラッド・ラボラトリーズ | 1708840 | |
| SYBR は、CFX | Life Technology | 4472937 | |
| CFX96 | |||
| リアルタイムシステム、C-1000 タッチサーマルサイクラー | Bio Rad | Laboratories SOFT-CFX-31-PATCH |
参考文献
- Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
- Abboud, G., Kaplowitz, N.
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再版と許可
