膵臓がんの蛍光同所性マウスモデル

サマリー

ここでは、

緑色蛍光タンパク質発現膵臓がん細胞（PANC-1 GFP)をBalb-c Ola Hsd-Fox1nuマウスの膵臓に同所的に移植し、腫瘍の進行と転移を評価する手順を紹介します。

要約

膵臓癌は生存率は過去数十年で大幅に改善されなかったために癌の一つです。のみで診断された患者の7％が5年以上生存するであろう。理解し、膵臓腫瘍の微小環境を模倣するために、我々は、リアルタイムで腫瘍進行の非侵襲的イメージングを可能にする、膵臓癌のマウス同所性モデルを利用しました。緑色蛍光タンパク質（PANC-1 GFP）を発現する膵臓癌細胞を、無血清培地を用いて基底膜マトリックス、高濃度（ 例えば 、マトリゲルHC）中に懸濁させ、次いで、開腹を介して膵臓の尾部に注射しました。それが室温に達すると、高濃度の基底膜マトリックス中の細胞懸濁液は、ゲル状物質になります。それは注射部位にシールを作成し、任意のセルの漏れを防止、膵臓と接触すると、したがって、それはゲル化します。他の臓器への腫瘍の増殖および転移をライブで監視されています蛍光を使用して動物。 GFPの励起および発光のための適切なフィルターを使用することが重要です。研究者が簡単にヌードマウスでの手順を再現できるように同所移植のための手順は、この記事で詳しく説明しています。このプロトコルの主なステップは、細胞懸濁液の調製、外科的移植、およびin vivoイメージングにおける全身蛍光です。この同所性モデルは、原発性および転移性腫瘍に対する新規治療薬の有効性を調査するために設計されています。

概要

膵がんは他のがんに比べて増加した頻度と診断され、米国における癌関連死の4 ^番目の主要な原因です。診断時からは、患者の90％以上が5年^1,2以内に死亡します。現在、外科的腫瘍摘出は、膵臓癌のための唯一の治療法ですが、診断時に病気が進行した段階にあり^、3,4が転移しているので、患者の20％未満は、主に手術を受ける資格があります。特定の症状の欠如は、膵臓癌にサイレント病気になります。症状のいくつかは、腹痛、背部痛、食欲不振、黄疸や吐き気の損失が含まれます。これは、簡単に一般的な消化器の病気⁴と解釈することができます。このため、膵臓癌の診断及び治療を支援するために、新たな薬理学的ツールを開発することが重要です。

動物モデルの使用は、私たちはpancreの生物学を理解することができます癌ATICと人間にこの知識を適用することへの洞察を提供します。腫瘍が起源⁵の臓器に成長するため、膵臓癌の異種移植同所性モデルは、現実的です。細胞株または腫瘍断片を皮下移植された異機種とは対照的に、同所性モデルは、腫瘍の微小環境と模倣その周辺⁶による腫瘍細胞の相互作用を再現することを可能にします。ここで説明する異種移植モデルは、遺伝子、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するように操作されたヒト膵臓癌細胞株PANC-1 GFPから腫瘍を導出します。 GFPの検出は、腫瘍の増殖および転移⁷の非侵襲的画像化およびモニタリングのために可能にします。腫瘍の発生は、自発的に、急速に発生し、密接にヒト膵臓癌患者の原発性腫瘍⁸のそれに似ています。同所性モデルは、一方で、治療薬に応答して、薬効のより正確な予測を提供します腫瘍微小環境を模倣します。

上記のように、この動物モデルは、リアルタイムで腫瘍増殖および転移の蛍光検出を可能にします。蛍光検出は、発光に比べて、より直接的/ライブイメージングを可能にします。蛍光で放出された光は、より短い波長の別の光による励起の結果です。発光のに対し、放射された光は、化学反応の結果であり、強い発光^9を有していなくてもよいです。また、 生体内蛍光イメージングにおける全身が動物に有害ではないと研究者は治療的処置に応答して、時間をかけて腫瘍の成長を監視することができます。

プロトコル

以下で説明するプロトコルは、指導とウェスタン大学の動物実験委員会の承認の下に実行されます。すべての実験は、関連するすべてのガイドライン、規則および規制当局に準拠して行われています。

1.細胞培養

1. 完全培地の調製
   1. クラスII生物学的安全キャビネットを使用して、無菌的にRPMI培地、500mlのボトルにウシ胎児血清（FBS）及びペニシリンストレプトマイシン（P / S）を添加することによって、完全培地を調製します。旋回により穏やかに混合します。各サプリメントの最終濃度は、10％FBSおよび1％P / S（v / v）です。例えば、56ミリリットルFBSおよび6ミリリットルP / Sとメディアの500ミリリットルを補足します。
   2. 37℃の水浴中で完全培地に置きます。
2. 細胞を解凍し、伝播
   1. 液体窒素からPANC-1 GFP細胞を取得します。 37℃の水浴中で穏やかに撹拌することによって、バイアルを解凍します。
      注意：（ - 3分約2）融解は迅速であるべきです。
   2. （a）細胞ライン名で使用するラベルT-75フラスコ、（b）は、継代数、（c）は、日付、および（d）研究者のイニシャル。
   3. 安全キャビネットに70％エタノールおよび転送バイアルとバイアルを拭いてください。
   4. 細胞を増殖させるために、15ミリリットルコニカルチューブに完全培地の9.0ミリリットルを追加します。 1.0ミリリットルピペットを使用して、慎重に細胞懸濁液を転送し、完全培地9mlにそれを一時停止。
   5. 室温で8分間、125×gで遠心分離します。安全キャビネットに円錐バイアルを移し、ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
   6. 優しく上下サスペンションをピペッティングすることによって、新鮮な完全培地10mlにペレットを一時停止します。
   7. 血球計数器を用いて細胞をカウントし、2.1×10 ⁶細胞/フラスコの密度でT-75フラスコでそれらをプレート。 37℃のインキュベーターにフラスコを置き、5％のCO _2。
   8. 目で、顕微鏡下で毎日の細胞を監視します。インフルエンザの場合更新が必要とされているIDは、無菌的にフラスコから完全増殖培地を吸引し、廃棄します。新鮮な完全培地を等量加えます。
3. 細胞を増殖させます
   1. 無菌的にフラスコから培地を除去します。細胞を洗浄し、破棄するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）の5ミリリットルを追加します。
   2. 0.25％トリプシンを3mlを添加することによってフラスコから細胞を剥離。 5〜10分間、37℃でトリプシンおよび5％CO _2を含有_するフラスコをインキュベートします。
   3. 顕微鏡（倍率10倍）で細胞を観察し、彼らはラウンドと外れていることを確認します。
   4. 完全培地を等量加えることによって、トリプシンを中和し、穏やかにピペッティングにより塊を壊します。
   5. 血球計数器を用いて細胞をカウントし、1.2.7で述べた細胞密度で新しいフラスコに適当な細胞懸濁液の体積を移します。最終容量は、フラスコ当たり10ミリリットルであるように、十分な新鮮な培地を追加します。
4. 細胞Suspens注射用イオン調製
   注意：基底膜マトリックス、高濃度は、室温で固化するので、氷の上にすべての材料を保ちます。一晩冷凍庫内のすべての滅菌ピペットチップおよびバイアルを置き、サスペンションの作業をしながら氷上に保ちます。
   1. 氷の上の任意の添加剤を含まないRPMI培地のボトルを保管してください。製造業者の指示に従って、基底膜マトリックス、高濃度を解凍。好ましくは、複数の凍結融解サイクル^10を回避するために小さいバイアルにアリコート。
   2. 吸引すべてのフラスコからメディア、およびDPBSの5ミリリットルですすいでください。 1.3.4ステップまで、前のセクションのすべての手順を繰り返します。
   3. 室温で8分間、125×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にコンテンツを転送します。安全キャビネットに円錐バイアルを移し、DPBSの10ミリリットルを使用してペレットを再懸濁。
   4. 静かにペレットを分割するには、上下サスペンションをピペット。血球計数器を用いて細胞を数えます。
   5. 秒で概説し、再び遠心分離してくださいTEP 1.4.3。上清を吸引し、細胞の数に応じて、50μlの容量に3×10 ⁶個^の細胞を得るために適切な希釈剤を追加します。 1（v / v）の比：希釈剤は1で無血清培地と高濃度基底マトリックス膜の混合物です。
   6. 優しくサスペンションをボルテックスし、すべての回で氷上に保ちます。サスペンションは今、注射の準備ができています。
5. 外科的移植
   注：すべての外科手術用材料や器具が滅菌されていることを確認してください。すべての回で無菌技術を練習。
   1. テーブルの上に加熱パッドを配置し、滅菌ドレープでカバー。麻酔マシンをセットアップすると、すべての電源が手の届く範囲内にあることを確認します。
   2. 麻酔マスクに動物の鼻を配置し、酸素の1リットル/分、2.5％イソフルランに麻酔を設定します。
   3. 静かにヨウ素と動物の脇腹をスクラブし、70％エタノールですすいでください。 3回繰り返します。
   4. 確認します動物は完全に後足をつまんで麻酔されています。応答が観察されない場合、動物は完全に麻酔をかけ、手術の準備ができています。しかし、動物がフリンチ行動場合、気化器で十分な麻酔があることを確認し、動物を麻酔下で完全に行くために多くの時間を可能にします。
   5. 負荷は約18 G針で1.0ミリリットルのTBシリンジに200μlの細胞懸濁液は、（以前に冷却します）。 27 G針で針を交換して使用する準備まで氷上に戻ります。
   6. 脾臓（腹部の左上の象限）の一般的な領域を見つけ、鉗子は、その領域の上に皮膚をつまんで使用して。手術用はさみを使用すると、ポケットを作成するためには約1.0センチ切開を行います。同様に、脾臓の上に平滑筋をピンチし、腹腔にアクセスするために、カットスルー。
   7. ゆっくり脾臓の尾の端をつかみ、体から引き出します。膵臓、脾臓に添付されます。濡れた目を使用して膵臓を広めますerile Qティップは、膵臓の尾を見つけて。
   8. 膵臓の尾に50μlの注入を提供し、10秒間の内側の針を離れ、ゆっくりと膵臓の外に針を回転させます。移植の成功は、任意の漏れのない表面的な泡のようになります。
   9. 腹膜腔に膵臓と脾臓を返します。まず筋肉を囲み、その後別々肌を囲みます。切開部を閉じるために、6-0縫合またはステープルを使用してください。管理ケトプロフェン皮下（SC）（5ミリグラム/ kg）を24時間かけて、動物に苦痛を避けるために。 （ - 0.1ミリグラム/キログラム0.05）36時間にわたり12時間ごとあるいは、ブプレノルフィンの皮下投与します。
   10. 麻酔から動物を回復し、そのケージに戻します。また、痛みのために監視します。手術 - 動物は（先制あるいは前）の時点で疼痛緩和が提供されなければなりません。追加の疼痛緩和がでで規定されIACCUC-プロトコルに従って、または痛みを経験する動物に提供されなければなりません獣医師または指名を傾向。
6. in vivoイメージングで
   注：画像キャプチャ暗室およびGFPイメージングのための適切なフィルターを備えた商業イメージングシステムを用いて行きました。 （ - ;放出495 nmの455：513 - 557 nmで励起）画像取得は、CCDカメラと互換励起/発光レンズからなる光学系を用いて達成しました。明視野画像は、各時点で、1×1ビニングでフィルタなしで捕捉しました。 GFPの励起は、キセノンマルチスペクトル光源を利用しました。動物は、撮像システムの暗い室内に組み込まガス麻酔マニホールドに麻酔機を接続することにより、画像形成プロセスを通して麻酔下に維持しました。
   1. 1.5.2で概説されるように動物を麻酔。麻酔マスクは、画像中に麻酔下で動物を維持するために商業的イメージングシステムの暗室の内部にありますプロセス。
   2. 正しい励起および発光フィルタを設定します。
   3. 白色光だけを使用して初期画像を取得することから始めます。イメージングセッションを通じて動物の同じ位置を維持し、第二の画像を取るために、GFPフィルターに切り替えます。
   4. 最良の結果を得るために両方の画像を重ね合わせます。蛍光面積と強度のための画像を分析します。

結果

この方法は、注射、げっ歯類のための適切な麻酔、開腹術を介して細胞懸濁液を送達するための細胞懸濁液の調製に焦点を当て、蛍光ヒト膵臓癌細胞の外科的同所移植を記載し、そして蛍光インビボ小動物イメージングの使用。 2と3週間の間に緑色蛍光シグナル（GFP信号）の検出移植後、研究者に開発膵臓癌腫瘍（ 図1）の存在を確認するための視覚的な手がかりを提供する。 図1は、とマウスの三つの画像で構成されていPANC-1 GFP蛍光腫瘍。最初は白色光（ 図1A）下で撮影されます。第2の画像が青色蛍光灯の下で撮影された（励起：455から495 nmのを;発光：513から557 nm）の画像へPANC-1膵臓腫瘍（ 図1B）から放出された緑色蛍光。第三は、の複合体であります第2およびマウス（ 図1C）の本体内腫瘍の位置を示しています。 GFPシグナルを示さない腫瘍を発症しない動物（ 図2）。

ディスカッション

そこで我々は、 生体内蛍光イメージング（ 図1） に全身を使用して、腫瘍増殖の非侵襲的なモニタリングを可能にする、GFPを発現する膵臓癌の同所性マウスモデルを記載します。この技術は、リアルタイムで腫瘍の発生を監視するために私たちをことができます（ 図3）。それは膵臓癌に対する新規薬剤の治療効果を研究する研究者のための重要なツールとなります。このモデルのもう一つの重要な側面は、GFP蛍光が成功した着床および膵臓癌の増殖を示す視覚的な手がかりを提供することです。そうでなければ生きた動物で測定することは困難であろう。臨床的設定と一致して、このモデルは、転移に対する洞察を提供します。脾臓、腸間膜リンパ節、肝臓、および胃腸管（ 図4）：これは、周囲の臓器への転移を示します。我々は、早ければ7週間後の移植などの転移を観察しました。 PANC-1転移が担当者となっています18週^{11から10まで}の範囲でorted。転移が観察される時間は、移植細胞、移植及び可視化技術の数に依存し得ます。現在の研究...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMI media 1640	Caisson Labs	RPL03-500ML
ウシ胎児血清	Gibco	10437-077
ペニシリンストレプトマイシン	Thermo Ficher Sci	15140-122
マトリゲルHC基底膜、高濃度	コーニング	354248
SutureVet PGA 6-0 PGA	ヘンリー・シャイン	39010
アルケアまたは発泡消毒剤 ハンドラブ	ステリス	639680
DPBS (デュベルコのリン酸緩衝生理食塩水)	Thermo Ficher Sci	21300025
TB シリンジ 27 G 1/2	ベクトン ディキンソン	305620
イソフルラン	Blutler Schein	50562
ケトプロフェン	フォート ダッジ アニマル ヘルス
サージカル ハサミ、5.5 インチ ストレート マヨネーズ	Henry Schein	22-1600
PANC-1 GFP細胞株	Anticancer, Inc
Small Animal Imaging System: iBox Scientia	UVP, LLC. カリフォルニア州アップランド		生きた動物の蛍光腫瘍を観察するための小動物イメージングシステム