緑色蛍光タンパク質発現膵臓がん細胞（PANC-1 GFP)をBalb-c Ola Hsd-Fox1nuマウスの膵臓に同所的に移植し、腫瘍の進行と転移を評価する手順を紹介します。
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この記事について
サマリー
ここでは、
要約
膵臓癌は生存率は過去数十年で大幅に改善されなかったために癌の一つです。のみで診断された患者の7％が5年以上生存するであろう。理解し、膵臓腫瘍の微小環境を模倣するために、我々は、リアルタイムで腫瘍進行の非侵襲的イメージングを可能にする、膵臓癌のマウス同所性モデルを利用しました。緑色蛍光タンパク質（PANC-1 GFP）を発現する膵臓癌細胞を、無血清培地を用いて基底膜マトリックス、高濃度（ 例えば 、マトリゲルHC）中に懸濁させ、次いで、開腹を介して膵臓の尾部に注射しました。それが室温に達すると、高濃度の基底膜マトリックス中の細胞懸濁液は、ゲル状物質になります。それは注射部位にシールを作成し、任意のセルの漏れを防止、膵臓と接触すると、したがって、それはゲル化します。他の臓器への腫瘍の増殖および転移をライブで監視されています蛍光を使用して動物。 GFPの励起および発光のための適切なフィルターを使用することが重要です。研究者が簡単にヌードマウスでの手順を再現できるように同所移植のための手順は、この記事で詳しく説明しています。このプロトコルの主なステップは、細胞懸濁液の調製、外科的移植、およびin vivoイメージングにおける全身蛍光です。この同所性モデルは、原発性および転移性腫瘍に対する新規治療薬の有効性を調査するために設計されています。
概要
膵がんは他のがんに比べて増加した頻度と診断され、米国における癌関連死の4 番目の主要な原因です。診断時からは、患者の90％以上が5年1,2以内に死亡します。現在、外科的腫瘍摘出は、膵臓癌のための唯一の治療法ですが、診断時に病気が進行した段階にあり、3,4が転移しているので、患者の20％未満は、主に手術を受ける資格があります。特定の症状の欠如は、膵臓癌にサイレント病気になります。症状のいくつかは、腹痛、背部痛、食欲不振、黄疸や吐き気の損失が含まれます。これは、簡単に一般的な消化器の病気4と解釈することができます。このため、膵臓癌の診断及び治療を支援するために、新たな薬理学的ツールを開発することが重要です。
動物モデルの使用は、私たちはpancreの生物学を理解することができます癌ATICと人間にこの知識を適用することへの洞察を提供します。腫瘍が起源5の臓器に成長するため、膵臓癌の異種移植同所性モデルは、現実的です。細胞株または腫瘍断片を皮下移植された異機種とは対照的に、同所性モデルは、腫瘍の微小環境と模倣その周辺6による腫瘍細胞の相互作用を再現することを可能にします。ここで説明する異種移植モデルは、遺伝子、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するように操作されたヒト膵臓癌細胞株PANC-1 GFPから腫瘍を導出します。 GFPの検出は、腫瘍の増殖およ....
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プロトコル
以下で説明するプロトコルは、指導とウェスタン大学の動物実験委員会の承認の下に実行されます。すべての実験は、関連するすべてのガイドライン、規則および規制当局に準拠して行われています。
1.細胞培養
- 完全培地の調製
- クラスII生物学的安全キャビネットを使用して、無菌的にRPMI培地、500mlのボトルにウシ胎児血清（FBS）及びペニシリンストレプトマイシン（P / S）を添加することによって、完全培地を調製します。旋回により穏やかに混合します。各サプリメントの最終濃度は、10％FBSおよび1％P / S（v / v）です。例えば、56ミリリットルFBSおよび6ミリリットルP / Sとメディアの500ミリリットルを補足します。
- 37℃の水浴中で完全培地に置きます。
- 細胞を解凍し、伝播
- 液体窒素からPANC-1 GFP細胞を取得します。 37℃の水浴中で穏やかに撹拌することによって、バイアルを解凍します。
注意：（ - 3分約2）融解は迅速であるべきです。 - （a）細胞ライン名で使用するラベルT-75フラスコ、（b）は、継代数、（c）は、日付、および（d）研究者のイニシャル。
- 安全キャビネットに70％エタノールおよび転送バイアルとバイアルを拭いてください。....
- 液体窒素からPANC-1 GFP細胞を取得します。 37℃の水浴中で穏やかに撹拌することによって、バイアルを解凍します。
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結果
この方法は、注射、げっ歯類のための適切な麻酔、開腹術を介して細胞懸濁液を送達するための細胞懸濁液の調製に焦点を当て、蛍光ヒト膵臓癌細胞の外科的同所移植を記載し、そして蛍光インビボ小動物イメージングの使用。 2と3週間の間に緑色蛍光シグナル（GFP信号）の検出移植後、研究者に開発膵臓癌腫瘍（ 図1）の存在を確認するための視覚的な手がかりを提供する。 図1は、とマウスの三つの画像で構成されていPANC-1 GFP蛍光腫瘍。最初は白色光（ 図1A）下で撮影されます。第2の画像が青色蛍光灯の下で撮影された（励起：455から495 nmのを;発光：513から557 nm）の画像へPANC-1膵臓腫瘍（ 図1B）から放出された緑色蛍光。第三は、の複合体であります第2およびマウス（ 図1C）の本体内腫瘍の位置を示しています。 GFPシグナルを示さない腫瘍を発症しない動物（ 図2）。
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ディスカッション
そこで我々は、 生体内蛍光イメージング（ 図1） に全身を使用して、腫瘍増殖の非侵襲的なモニタリングを可能にする、GFPを発現する膵臓癌の同所性マウスモデルを記載します。この技術は、リアルタイムで腫瘍の発生を監視するために私たちをことができます（ 図3）。それは膵臓癌に対する新規薬剤の治療効果を研究する研究者のための重要なツールとなります。このモデルのもう一つの重要な側面は、GFP蛍光が成功した着床および膵臓癌の増殖を示す視覚的な手がかりを提供することです。そうでなければ生きた動物で測定することは困難であろう。臨床的設定と一致して、このモデルは、転移に対する洞察を提供します。脾臓、腸間膜リンパ節、肝臓、および胃腸管（ 図4）：これは、周囲の臓器への転移を示します。我々は、早ければ7週間後の移植などの転移を観察しました。 PANC-1転移が担当者となっています18週11から10までの範囲でorted。転移が観察される時間は、移植細胞、移植及び可視化技術の数に依存し得ます。現在の研究.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
私たちは、学内助成金を提供してくださったウェスタン健康科学大学に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| ウシ胎児血清 | Gibco | 10437-077 | |
| ペニシリンストレプトマイシン | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| マトリゲルHC基底膜、高濃度 | コーニング | 354248 | |
| SutureVet PGA 6-0 PGA | ヘンリー・シャイン | 39010 | |
| アルケアまたは発泡消毒剤 ハンドラブ | ステリス | 639680 | |
| DPBS (デュベルコのリン酸緩衝生理食塩水) | Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB シリンジ 27 G 1/2 | ベクトン ディキンソン | 305620 | |
| イソフルラン | Blutler Schein | 50562 | |
| ケトプロフェン | フォート ダッジ アニマル ヘルス | ||
| サージカル ハサミ、5.5 インチ ストレート マヨネーズ | Henry Schein | 22-1600 | |
| PANC-1 GFP細胞株 | Anticancer, Inc | ||
| Small Animal Imaging System: iBox Scientia | UVP, LLC. カリフォルニア州アップランド | 生きた動物の蛍光腫瘍を観察するための小動物イメージングシステム |
参考文献
- Siegel, R. Pancreatic Cancer Stats: American Cancer Society: Cancer Facts & Figures. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/acspc-042151.pdf (2014).
- Smyth, E., Cunningham, D. Harrison's Principles of Internal Medicine. Kasper, D., et al. , 19th edn, McGraw-Hill Education. (2015).
- Mahipal, A., Frakes, J., Hoffe, S., Ki....
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再版と許可
