このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

親油性ドキソルビシンプロドラッグミセルの調製とキャラクタリゼーション

14.5K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/54338

⸱

2016年8月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Hampton University

この記事について

サマリー

親油性のドキソルビシンプロドラッグの調製および特徴付けのためのプロトコルは、1,2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- Nロード- [アミノ（ポリエチレングリコール）-2000]の（DSPE-PEG）ミセルが記載されています。

要約

Micellesは、抗がん剤の送達に成功裏に使用されています。両親媒性ポリマーは、自己組織化により水性環境でコアシェル構造のミセルを形成します。ミセルの疎水性コアは、薬物の貯蔵庫として機能し、疎水性薬物をカプセル化します。親水性シェルは、ミセルの凝集を防ぎ、生体内でのミセルの全身循環を延長します。このプロトコルでは、ドキソルビシン親油性プロドラッグであるドキソルビシン-パルミチン酸(DOX-PA)を合成する方法について説明し、ミセルへの薬物負荷を強化します。pH感受性ヒドラゾンリンカーを使用して、ドキソルビシンを脂質と結合させ、がん細胞内での遊離ドキソルビシンの放出を促進しました。合成したDOX-PAをジクロロメタン/メタノールを溶離液としてシリカゲルカラムで精製しました。精製したDOX-PAを薄層クロマトグラフィー(TLC)および1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy(1H-NMR)で分析しました。DOX-PAを装填したDSPE-PEGミセルを作製するために、フィルム分散法を用いた。さらに、DOX-PA濃度およびカプセル化効率の決定、粒子サイズおよび分布の測定、ならびにin vitro抗癌活性の評価を含む、ミセル製剤を特徴付けるためのいくつかの方法について説明する。このプロトコルは、薬物負荷ミセルの調製と特性評価に関する有用な情報を提供し、したがって、新しいミセルベースのがんナノメディシンの研究開発を促進します。

概要

化学療法は一般に、癌の種々の形態を治療するために使用されます。すべてではないが、ほとんどは、化学療法薬は、より多くの生命を脅かす条件に、このような吐き気や下痢などの管理がマイナー条件と異なる場合があり毒性の副作用を持っています。ほとんどの抗がん剤は毒性があるので、正常組織へのこれらの薬剤の非選択的露光は、必然的に毒性を引き起こします。したがって、選択的に癌細胞に薬物を送達することができる治療的アプローチのための大きい必要性があります。抗がん剤の投与と別の課題は、それらの難水溶性です。通常、可溶化剤は、これらの難溶性薬物を処方するために必要とされます。しかし、ほとんどの可溶化ジメチルスルホキシド（DMSO）、クレモフォールELなどの薬剤、およびポリソルベート80（ツイーン80）は、肝臓と腎臓毒性、溶血、急性過敏性反応や末梢神経障害を引き起こす可能性があります。1ので、安全で、生体適合性の製剤は、のために必要とされています貧しい人々の臨床使用LY可溶性抗癌剤。ナノキャリアは、上記の課題に対処するための薬物送達システムが期待されています。これらのナノキャリアは、リポソーム、2ナノ粒子、3ミセル、4-7ポリマー-薬物コンジュゲート、8および無機材料が挙げられる。9、いくつかのナノ医療製品は、（ 例えば 、ドキシル、アブラキサン、およびGenexol）は癌患者を治療するための規制当局によって承認されています。 10

高分子ミセルは、正常抗癌剤を送達するために使用されているナノスケール薬物送達キャリアを、期待されている。4-7,11,12典型的な高分子ミセルは、自己組織化プロセスを介して両親媒性ポリマーから調製されます。コア - シェル構造化された高分子ミセルは、親水性シェルと疎水性コアを含みます。親水性シェルは、立体的にミセルを安定化し、血流での循環を延長することができます。疎水性コアは、効果的に疎水性Dをカプセル化することができますラグ。そのため、小さなミセルのサイズ（一般的には200nm未満）および長期循環特性により、高分子ミセルは、強化された透過性および保持（EPR）効果（受動的腫瘍標的）を介して腫瘍ターゲッティングを達成すると考えられています。

薬物負荷の安定性は、ミセルの能力を腫瘍ターゲティングのために重要です。最適な腫瘍標的化を達成するために、ミセルは、腫瘍部位に到達する前に、最小限の薬物の漏出を有し、まだすぐにがん細胞を入力した後に薬物を放出すべきです。製剤の安定性は、製品開発の実現可能性、ならびに開発された製品の貯蔵寿命を決定するために加えて、製剤の安定性は、製品開発のための必須要件です。最近、多くの努力は、送達担体への薬物の負荷を改善するためになされています。親油性プロドラッグアプローチは、脂質ナノ粒子及び乳剤に薬物負荷を改善するために検討されている戦略である。13,14 CONJ薬物と脂質のugationは大幅に親油性を向上させ、ナノキャリアの親油性成分でロードと保持を高めることができます。

ここでは、親油性のドキソルビシンプロドラッグロードミセルを調製するためのプロトコルについて説明します。まず、親油性プロドラッグをドキソルビシンの合成手順を説明します。その後、膜分散法を用いてミセルを生成するためのプロトコルが導入されます。この方法は、正常に我々の以前の研究で使用されてきた。それは、正常ミセル薬物送達のために使用されているため、5 DSPE-PEGは、ミセルを調製するための担体材料として選択した。15,16最後に、我々は、ミセルを特徴付けるために使用されるいくつかのインビトロアッセイを記載抗癌活性を評価するための製剤および。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

DOX-PAの1の合成

  1. ドキソルビシン390mgのパルミチン酸ヒドラジドの243ミリグラムを秤量し、丸底フラスコに移します。
  2. ガラスシリンジでフラスコに無水メタノール150mlを追加します。ピペットでトリフルオロ酢酸（TFA）の39μLを加えます。マグネチックスターラーを用いて、暗所で室温で18時間、反応混合物を攪拌します。
    注：反応物質の量をスケールアップすることができ、またはダウンDOX-PAの異なる量を得ました。反応体の比率が同じ比率で維持されるべきです。 78 mgの1170ミリグラムの範囲でDOXの量を使用する反応は、通常の化学実験室で行うことができます。
  3. シリカゲルカラムを用いてDOX-PAの精製。17
    1. ロータリーエバポレーターで反応混合物中の溶媒を除去します。混合物の体積を約20 mlまで低下した後、シリカゲルを3gを加えます。乾燥粉末を得るために回転蒸発を続行し、トンを可能にするために、シリカゲルへの製品の吸着彼。乾燥粉末が形成された後、さらに30分間真空下でサンプルを保管してください。
    2. 溶媒としてジクロロメタンを用いてカラムにシリカゲル50gのパック。慎重にカラムに吸着した生成物を含有するシリカゲルのサンプルを追加します。
    3. 徐々にそれによって溶媒極性（ 表1）を増加させる、メタノールの割合を増加させながら、ジクロロメタンおよびメタノールの混合物でカラムを溶出します。
    4. 試験管（25ミリリットル/チューブ）における溶離液の画分を収集し、薄層クロマトグラフィー（TLC）によって進行状況を監視します。
    5. 純粋なDOX-PAを含む全ての画分を合わせ、乾燥粉末が形成されるまで、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去します。さらに真空O / Nの下で生成物を乾燥。
  4. TLCによるDOX-PAの分析。
    1. TLCプレートの4センチメートル×8センチセクションをカット。スポット試料溶液TLCがMETを使用して毛細血管をスポッティングとプレートの底から0.5センチメートル溶媒としてhanol。
    2. ジクロロメタンおよびメタノールの混合物を含有する現像室にTLCプレートを置き（3/1、v / v）でした。溶剤の深さはわずか0.5未満cmでなければなりません。
    3. 溶媒先端がプレートの上部に到達したときに現像室からプレートを取り外します。鉛筆で溶媒先端の​​位置をマークし、プレートを乾燥させます。サンプルを可視化するために、飽和ヨウ素蒸気を含む染色室にTLCプレートを置きます。
  5. 1 H核磁気共鳴分光法（1 H-NMR）によるDOX-PAの分析。18
    1. メチルスルホキシド-D6（DMSO）の1ミリリットル中にDOX-PAの15ミリグラムを溶解し、NMRチューブにサンプルを移します。
    2. NMR装置の磁石にNMR管を挿入します。溶媒としてDMSOを選択し、プロトンスペクトルを測定します。磁石からのNMRチューブを外します。 NMRの結果18を分析します。

2。フィルム分散法によるDOX-PAミセルの調製

  1. DSPE-PEG（40 mg）をDOX-PA（4 mg）を10mlのガラスバイアル中の2mlのメタノールで溶解します。
  2. バイアル中の薄膜が形成されるまで、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で有機溶媒を除去。
    注：また、膜を形成し、さらに、残留溶媒を除去し、真空デシケーター中でバイアルを維持するために、不活性ガス（ 例えば 、アルゴンまたは窒素）下で有機溶媒を蒸発させます。
  3. 転写ガラスバイアルにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4の、DPBS）2 mlです。
  4. ミセルを生成するために、室温で3分間、超音波浴中でバイアルを置きます。
    注：超音波パワーは超音波風呂の異なるモデル間で変化します。薄いポリマー/薬物フィルムを分散させるのに十分な超音波パワーを発生させることができるユニットを選択します。このプロトコルで使用される超音波浴の出力電力は110 Wです。
  5. 短期記憶のために4℃でミセルを維持し、-20長いため℃〜-termストレージ。
    注：また、ミセルはまた、凍結乾燥し、使用前に水で再構成することができます。通常、何の凍結保護剤または凍結保護剤は、この製剤のために必要とされていません。

DOX-PAミセルの3キャラクタリゼーション

  1. ミセルおよび薬物封入効率のDOX-PA濃度の決意
    1. 1μg/ mlで、5μgの/ mlで、20μgの/ mlで、50μgの/ mlの、および100μg/ mlの：DOX-PAは、5つの異なる濃度のDOX-PA溶液を調製するため、DMSO中に前の手順で合成し溶解します。 490nmでのUV-VIS分光計でDOX-PAソリューションの吸収を測定します。 DOX-PAの薬物濃度と490nmのそれらに対応する吸収に基づいて標準曲線を生成します。
    2. DMSOの500μlの薬物負荷ミセル25μlの希釈します。 UV-VIS分光光度計で490nmの吸収を測定します。 3.1.1で作成した標準曲線を用いて薬物濃度を計算します。
    3. 以下の式を用いて封入効率を計算します。
      薬物封入効率（％）=（ミセル中の薬物の量）/（添加薬剤の量）×100％
  2. 動的光散乱と粒子サイズの特性（DLS）
    1. 1mg / mlの最終DSPE-PEG濃度にDPBS（pH7.4）中でミセルを希釈します。 Z平均寸法及び多分散性指数（PDI）を得るために、粒子サイズ分析器で2mLのサンプルを分析します。
  3. インビトロでの抗癌活性の評価
    注：適切な滅菌技術を使用し、バイオセーフティキャビネット内で動作します。
    1. DU-145ヒト前立腺癌細胞を含む細胞培養フラスコ（ 例えば、T25）から細胞培養培地を除去し、DPBS 2mlの液（pH7.4）で細胞を洗浄します。
    2. 吸引DPBSを、トリプシン溶液1ml（0.25％）を添加し、細胞を剥離するために、37℃で2分間インキュベートします。
    3. 10メートルを追加ほとんどの細胞をフラスコから剥離された細胞培養培地のリットル（RPMI1640培地+ 10％ウシ胎児血清+ 1％抗生物質 - 抗真菌）。 15-ml遠心チューブと遠心分離機5分間千×gで細胞に細胞を移します。
    4. 細胞培養培地5mlで細胞ペレットを再懸濁し、血球計で細胞数をカウントするサンプルを除去します。 50,000細胞/ mlの濃度に細胞培養培地で細胞を希釈します。 96ウェル細胞培養プレート中に希釈された細胞懸濁液を加える（100μl/ウェル）。細胞接着を可能にするために18時間細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で細胞をインキュベートします。
    5. 希釈DOXのジメチルスルホキシド、それぞれ0.1μM、0.5μMの最終薬物濃度を得るための（DMSO）溶液と細胞培養培地とDOX-PA DMSO溶液を、2μM、5μM、及び10μM、。 0.5％に上記のすべてのサンプルで最終DMSO濃度を保ちます。最終薬物COを得るために、細胞培養培地を用いてDOX-PAミセルを希釈それぞれ0.1μM、0.5μMのncentrations、2μM、5μM、及び10μM、。ブランクの細胞培養培地にコントロールを使用してください。
    6. インキュベーターから96ウェル細胞培養プレートを取り外して、ステップ3.3.5で調製した異なる治療剤を含む培地100μlの細胞培養培地を交換し（各群n = 4）。さらに72時間細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で細胞をインキュベートします。
    7. 吸引培地、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）の0.5ミリグラム/ mlを含む培地100μlを加えます。
    8. さらに2時間、細胞培養インキュベーター中で細胞をインキュベートします。慎重に培地を除去し、ホルマザン結晶を溶解させるために100μlのDMSOを追加します。
    9. 波長570nmと670nmでの参照波長でマイクロプレート分光光度計で吸光度を測定します。
    10. 以下の式を用いて細胞生存率を計算します。
      細胞の生存率（％）=（ 試験 / 対照 ）×100％
      注：一元配置分散分析（ANOVA）統計的検定を用いて異なるグループ間での細胞生存率を比較します。薬物濃度データ対細胞生存率に基づいて、IC 50を計算します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

図1は、DOX-PAの合成スキームを示します。 DOX-PAは、pH感受性ヒドラゾン結合を通してドキソルビシンとパルミチン酸の結合により合成しました。パルミチン酸ヒドラジドのわずかに過剰に反応の完了を促進するために使用されました。この反応方法は、非常に高い効率およびドキソルビシンの少量は18時間の反応（ 図2）の後に残っています。収率は約88％でした。反応の終わりに、DOX-PAは、シリカゲルカラムを用いて精製し、純粋な赤色の固体生成物を得ました。 DOX-PAは、精製されたDOX-PA（ 図2）のための単一のスポットを示したTLCで分析した。 図3は、DOX-PAの1 H-NMRスペクトルを示す図 。ドキソルビシンおよびパルミチン酸の両方の特性NMRピークは、さらに結合反応の成功が確認され、観察されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

本研究では、ミセルの調製のための単純、迅速なフィルム分散法を説明します。この方法は、水性環境中でコアシェル構造のミセルを形成する両親媒性ポリマー（ 例えば 、DSPE-PEG）の自己集合特性を利用します。このミセルの調製方法は、いくつかの利点を有します。 1.これは、一般的に、リポソーム、ナノ粒子、およびナノエマルジ ​​ョンの調製に使用される（例えば、押出しまたは均質化のような）複雑なサイズ縮小工程の使用を回避する単純な処方プロセスを伴う。19 2。これは、良好な再現性を持っています。製剤を最適化し、確立された後、優れたバッチ間の一貫性を達成することができます。プロトコルは、超音波処理の強度及び時間のような製造プロセス変数の変動に耐性があります。 （このような透析アプローチまたはエマルジョン溶媒蒸発法など）他の方法は、フィルムの分散ミセルを調製するために利用可能であるが、この方法は、より便利で効率的です。従って、製薬産業におけるミセルの大規模製造における使用のために適合させる大きな可能性を秘めています。この方法の制限は、担体材料の自己組織化特性に依存するので、このような特性を有する材料に限定され...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、NIH-SC3助成金、NSF-PREM助成金、ハンプトン大学教員研究助成金によって支援されました。粒子サイズ分析器の使用について、バージニア海洋科学研究所(VIMS)のMichele A. Cochran氏に感謝します。また、原稿を査読してくださったCorinne R. Ramaley夫人にも感謝いたします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DSPE-PEG2KCordenpharmLP-R4-039>95%
ドキソルビシンLCラボラトリーズD-4000>99%
パルミチン酸ヒドラジドTCIアメリカ  P000425G>98.0%
メタノールACROS有機物610981000無水
塩化メチレン フィッシャー D151-499.90%
メチルスルホキシド-d6ACROS OrganicsAC320760075NMR溶媒
トリフルオロ酢酸 アクロスオーガニックスAC29381100099.50%
シリカゲルフィッシャー L-7446230-400メッシュ
ベイカーフレックスTLCプレートフィッシャー 
DPBSシグマ-アルドリッチD8537
DU 145 前立腺がん細胞ATCCHTB-81
MTTACROS Organics15899005098%
RPMI 1640 MediumMEDIATECH INC 10041CV
抗生物質-抗真菌薬 ライフテクノロジー 15240062100x ストック溶液
ウシ胎児血清LIFE TECHNOLOGIES 
核磁気共鳴分光Varian, Inc300 NMR 
Büchi R-3 ロタバポチ1103022V1 ロータリーエバポレーター
超音波浴ブランソン・ウルトラソニックス・コーポレーション 
CPX952318R 紫外可視分光器 Biomate 3Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90 Malvern InstrumentsParticle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer リオ・ラッド・ベンチマーク・プラス 
細胞培養インキュベーターNapcoCO2 6000
生物学的安全キャビネットNuaire
SigmaPlot Systatソフトウェア株式会社分析ソフトウェア
96ウェル細胞培養プレートBecton Dickinson353072
Trypsin  0.25%Corning Cellgro25-053-CI
NC999012910437077法 ブ

参考文献

  1. Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).
  2. Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).
  3. Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9 (55), (2011).
  4. Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd,, D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26 (9), 2081-2092 (2009).
  5. Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11 (10), 2610-2620 (2010).
  6. Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1 (6), 9(2011).
  7. Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143 (1), 151-158 (2010).
  8. Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54 (2), 223-233 (1998).
  9. Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7 (1), 111-120 (2012).
  10. Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
  11. Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48 (2), 101-111 (1999).
  12. Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11 (8), 2600-2611 (2014).
  13. Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334 (2), 253-262 (2013).
  14. Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86 (1), 93-100 (2003).
  15. Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164 (1), 95-102 (2012).
  16. Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46 (1-2), 67-71 (2012).
  17. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
  18. New Mexico State University. NMR Protocols and Specifications. , Available from: http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html (2015).
  19. Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
  20. Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87 (1-3), 33-47 (2003).
  21. Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13 (9), 11681-11693 (2012).
  22. Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11 (8), 2094-2102 (2010).
  23. Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8 (1), 20-36 (2012).
  24. Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449(2015).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

ミセル調製シリカゲルカラム薄層クロマトグラフィープロトンNMR分光法フィルム分散法粒子径解析封入効率インビトロ抗がん活性超音波洗浄機分散
親油性ドキソルビシンプロドラッグミセルの調製とキャラクタリゼーション
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。