このプロトコルは、細胞選別による幹細胞の事前精製なしに造血幹細胞/前駆細胞機能を研究するための競争力のあるマウス骨髄移植実験を設定するための段階的なガイドラインを提供します。
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この記事について
サマリー
要約
造血幹細胞(HSC)のゴールドスタンダードの定義は、放射線を照射されたレシピエントに移すと、レシピエントの生涯にわたって血液細胞の生産を再確立する能力を持つ細胞です。このプロトコルでは、2つの異なる遺伝子型のマウスの骨髄など、2つの異なる細胞集団のHSC容量を比較するための機能アッセイの設定方法と、フローサイトメトリーによるレシピエントマウスの解析方法について説明します。このプロトコルでは、標準化のために細胞選別ではなくHSC等価物を使用し、両方のアプローチの長所と短所について説明します。さらに、連続移植、制限希釈アッセイ、ホーミングアッセイ、非競合移植など、基本プロトコルのさまざまなバリエーションについて、これらのさまざまなアプローチの利点と好ましい使用法を含めて説明します。これらのアッセイは、HSC機能の研究の中心であり、生物学の基本的なHSC固有の側面の研究だけでなく、骨髄移植や培養におけるHSC拡大のための前臨床アッセイの開発にも使用できる可能性があります。
概要
造血が損傷、放射線と細胞死によって失われた血液細胞の補充を確実に再生プロセスです。この処理は、主に成人の骨髄に存在する造血幹細胞（HSC）によって保証されます。また、造血幹細胞は、自己免疫疾患、血液悪性腫瘍および免疫不全1で治療目的のために使用することができます。よりよいそれらの増殖拡大と到達し、移植後のレシピエントの骨髄を生着する能力を含む、HSC機能を制御する機構を理解する必要性が存在します。最近の研究は、将来に向かって約50％の純度2-4に大人のHSCおよび胎児HSCを豊かにするSLAMファミリーメンバーCD150及びCD48を含むいくつかの細胞表面マーカーを、報告しているが、機能的な造血幹細胞のためのゴールドスタンダード尺度はへのin vivo再増殖アッセイのまま血液cを再確立する能力を決定します照射されたホスト5のエル生産。
in vivoでのクローン再増殖アッセイは、最初にティルとマカロック6が開発し、以来、洗練され、拡張されました。もともと定義されているように、HSCは自己複製と分化を通じて生涯の血液細胞の生産を確保します。異なる血液細胞系統（Tリンパ球、Bリンパ球、顆粒球、単球）、および連続移植を介して、自己再生能力の分析を介して分化する能力を：照射レシピエントへのHSCの転送は、このように我々が評価することを可能にします。アッセイは、....
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プロトコル
このプロトコルで説明されているすべての手順は、制度上の動物の倫理委員会によって承認され、動物実験ガイドラインにカナダの評議会に従ってきました。
注意：滅菌/特定病原体フリーの住宅事情を維持するために、生物学的安全キャビネットまたは層流フードの内側に生きたマウスのダイレクトなハンドリングに関連するすべての手続きを行っています。適切に動物に提供される装置、住宅資材、飼料と水を抑制し、クリーンまたはケージを滅菌します。注射のための血液採取のためにのみ、滅菌、使い捨ての針を使用してください。無菌技術は、移植の準備中に重要です。
レシピエントマウスの作製
- 時間をかけて末梢血および骨髄再構成の個々のフォローアップを有効にするには、耳のノッチ（またはローカルの動物倫理委員会8によって承認された他の方法）とレシピエントマウスを識別します。移植後のフォローアップのためのマウスを計量。米国（25g未満）7〜12週齢での電子のレシピエントマウス。
注：提供された例では、CD45.1 + CD45.2 +レシピエントマウスは、コンジェニックB6.SJLマウスとC57BL / 6マウスを交配することによって家の中で飼育しました。 - 造血活性を破壊するために450ラドの2用量でレシピエントマウスに照射。移植前、移植の前に最初の投与日及び第....
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結果
二次移植（さらに後述）を含む競争力の移植設定の一般的な説明は、 図1に見出すことができる。移植前の骨髄のHSCのための代表的な分析は、図2に記載されています。ダブレットの除外に関するより詳細な情報と死んだ細胞は、他の場所9見つけることができます。
図3及び図 4はそれぞれ、末梢血および骨髄の分析テンプレートフローサイトメトリーの例を提供します。いくつかのホストのTリンパ球を検出するために正常である（すべてのT細胞の20％まで; 図3B）、T細胞がより放射線抵抗性であるように。競合他社由来細胞はすべての3つの系統で存在すべきです。検出限界は内2万セルの合計を分析するために獲得した総細胞の数に大きく依存するが、我々の経験で単一白血球.......
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ディスカッション
ここで説明するプロトコルは、既知の競合他社のHSCに対するドナー（テスト）HSCの相対的な適合性を評価するために設計されています。競争の状況は（幹細胞のフィットネスの緩やかな減少を検出する可能性が高い）アッセイの相対感度を向上させ、照射し、注射の有効性のための内部の技術的な制御を提供します。しかし、それはHSCのフィットネスの絶対的な尺度として使用されるべきではありません。競争力の再構築の減少は、自動的にHSCが競争の不存在下でうまく機能しないことを意味するものではありません。それは競争力の設定がより良い出発点であることを主張することができますが、競合細胞が不良HSC機能を救出され、すべてのレシピエントマウスは生存するように、1は、結果の解釈には注意すべきです。非競争的環境の中で結果を確認するとの結論を固めるます。
ここで紹介する実験計画は、HSC等価クを使用しています総骨髄細胞のantitiesの代わりに-sorted HSCを、フローサイトメトリーの純粋な集団。異なるドナー間の変動を排除し、表現型HSC周波数の変動がHSC機能14の変化として解釈されないこ.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
私たちは、手続きのフィギュアデザインとデモの支援のためにRoxannエテュ-アーバーに感謝しています。ラボでの研究が発見はありません付与、コール財団からの移行賞によってサポートされていました。自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）とイノベーションのためのカナダ基金（CFIリーダーファンドはありません。31377を付与）419226から2012。サンテ（FRQS） - KMHは、フォンデRECHERCHEケベックためChercheur-Boursierジュニアです。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| K2EDTA付きマイクロテーナーチューブ | BD Biosciences | 365974 | |
| 20 G ニードル | BDシリンジ | 顎静脈からの採血用 | |
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μg/ml |
| Pe-Cy7-標識抗マウスCD3e(クローン145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μg/ml |
| PE標識抗マウスCD19(クローン1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μg/ml |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 当量)-標識抗マウス GR1 (クローン RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μg/ml |
| FITC標識抗マウスCD45.1(クローンA20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μg/ml |
| eFluor450-標識抗マウスCD45.2(クローン104) | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μg/ml |
| ビオチン化抗ヒト/マウス CD45R (B220) (クローン RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μg/ml |
| ビオチン化抗マウス CD3e (クローン 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μg/ml |
| ビオチン化抗マウス CD11b (クローン M1/70) | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μg/ml |
| ビオチン化抗マウス GR1 (クローン RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μg/ml |
| ビオチン化抗マウス TER119 (クローン TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μg/ml |
| V500 ストレプトアビジン | BD Biosciences | 56149 | 0.5 μg/ml |
| PE標識抗マウスCD117(クローン2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0.25 μg/ml |
| PE-Cy7-標識抗マウス Ly6A/E (Sca1) (クローン D7) | BD Biosciences | 558162 | 0.25 μg/ml |
| PerCP-eFluor710-標識抗マウスCD135(クローンA2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μg/ml |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0.625 μグラム/ミリリットル BD BiosciencesとeBioscienceは、同じクローン |
| mlツベルクリンシリンジと27 G針BD | シリンジ | 309623 | |
| 1 mlツベルクリンシリンジ25 G針BD | シリンジ | 309626 | |
| 70 μMセルストレーナー | BD Falcon | 352350 |
参考文献
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and....
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