競争力の移植は、造血幹細胞のフィットネスを評価します

サマリー

このプロトコルは、細胞選別による幹細胞の事前精製なしに造血幹細胞/前駆細胞機能を研究するための競争力のあるマウス骨髄移植実験を設定するための段階的なガイドラインを提供します。

要約

造血幹細胞(HSC)のゴールドスタンダードの定義は、放射線を照射されたレシピエントに移すと、レシピエントの生涯にわたって血液細胞の生産を再確立する能力を持つ細胞です。このプロトコルでは、2つの異なる遺伝子型のマウスの骨髄など、2つの異なる細胞集団のHSC容量を比較するための機能アッセイの設定方法と、フローサイトメトリーによるレシピエントマウスの解析方法について説明します。このプロトコルでは、標準化のために細胞選別ではなくHSC等価物を使用し、両方のアプローチの長所と短所について説明します。さらに、連続移植、制限希釈アッセイ、ホーミングアッセイ、非競合移植など、基本プロトコルのさまざまなバリエーションについて、これらのさまざまなアプローチの利点と好ましい使用法を含めて説明します。これらのアッセイは、HSC機能の研究の中心であり、生物学の基本的なHSC固有の側面の研究だけでなく、骨髄移植や培養におけるHSC拡大のための前臨床アッセイの開発にも使用できる可能性があります。

概要

造血が損傷、放射線と細胞死によって失われた血液細胞の補充を確実に再生プロセスです。この処理は、主に成人の骨髄に存在する造血幹細胞（HSC）によって保証されます。また、造血幹細胞は、自己免疫疾患、血液悪性腫瘍および免疫不全¹で治療目的のために使用することができます。よりよいそれらの増殖拡大と到達し、移植後のレシピエントの骨髄を生着する能力を含む、HSC機能を制御する機構を理解する必要性が存在します。最近の研究は、将来に向かって約50％の純度^2-4に大人のHSCおよび胎児HSCを豊かにするSLAMファミリーメンバーCD150及びCD48を含むいくつかの細胞表面マーカーを、報告しているが、機能的な造血幹細胞のためのゴールドスタンダード尺度はへのin vivo再増殖アッセイのまま血液cを再確立する能力を決定します照射されたホスト⁵のエル生産。

in vivoでのクローン再増殖アッセイは、最初にティルとマカロック⁶が開発し、以来、洗練され、拡張されました。もともと定義されているように、HSCは自己複製と分化を通じて生涯の血液細胞の生産を確保します。異なる血液細胞系統（Tリンパ球、Bリンパ球、顆粒球、単球）、および連続移植を介して、自己再生能力の分析を介して分化する能力を：照射レシピエントへのHSCの転送は、このように我々が評価することを可能にします。アッセイは、通常、機能性および/ ​​またはHSCの2つの集団の量の比較を伴うだろう、 例えば 、細胞が造血幹細胞の維持や拡大に影響を与える可能性が別の因子で処理または未処理された異なる遺伝子型または細胞の2匹のマウスから来ます文化インチドナーキメラ、または転送されたドナーのHSCトンの貢献O血液細胞産生は、受信者、またはホストからのドナー細胞を区別する細胞表面マーカーまたは他の方法を用いて、末梢血および骨髄にフローサイトメトリー解析によって決定することができます。最も広く使用されているマーカーは確かに私たちは下記の実施例のために選択した遺伝子PtprcまたはCD45白血球抗原⁷のための2つの対立遺伝子です。

クローン再増殖アッセイは、競合的または非競合的のいずれかであることができます。非競合的設定では、対照および試験HSCは別個のレシピエントマウスに移し、各細胞型のための結果は、他の独立したであろう。競争力のある設定では、試験および対照両方HSCの機能は、競合他社HSCの集団に対して測定されます。ここで説明するプロトコルは、競争力のある設定を使用しても、非競合的状況に適合させることができます。どちらのアプローチは、その利点と限界を持っている、と私たちは中に詳細にそれらを比較します討論。我々はまた、移植されたHSCの数の株式を確保するための様々なアプローチを説明し、希釈アッセイ（LDA）を制限することにより、HSCの定量化のためのアッセイを適合させ、結果の解釈のための成功と失敗の移植の両方の例を提供する方法について説明します。

プロトコル

このプロトコルで説明されているすべての手順は、制度上の動物の倫理委員会によって承認され、動物実験ガイドラインにカナダの評議会に従ってきました。

注意：滅菌/特定病原体フリーの住宅事情を維持するために、生物学的安全キャビネットまたは層流フードの内側に生きたマウスのダイレクトなハンドリングに関連するすべての手続きを行っています。適切に動物に提供される装置、住宅資材、飼料と水を抑制し、クリーンまたはケージを滅菌します。注射のための血液採取のためにのみ、滅菌、使い捨ての針を使用してください。無菌技術は、移植の準備中に重要です。

レシピエントマウスの作製

1. 時間をかけて末梢血および骨髄再構成の個々のフォローアップを有効にするには、耳のノッチ（またはローカルの動物倫理委員会⁸によって承認された他の方法）とレシピエントマウスを識別します。移植後のフォローアップのためのマウスを計量。米国（25g未満）7〜12週齢での電子のレシピエントマウス。
   注：提供された例では、CD45.1 ⁺ CD45.2 ^+レシピエントマウスは、コンジェニックB6.SJLマウスとC57BL / 6マウスを交配することによって家の中で飼育しました。
2. 造血活性を破壊するために450ラドの2用量でレシピエントマウスに照射。移植前、移植の前に最初の投与日及び第二の1〜2時間を与えます。
   注：X線またはガンマ線は、両方の適切な設備の利用可能性に応じて使用することができます。

ドナーと競合骨髄細胞の調製

1. ドナー（試験および対照を、CD45.2 ^+）を安楽死させると、競合他社（CD45.1 ^+; B6.SJL）頸椎脱臼や地元の動物倫理委員会によって承認された方法を用いて、続いてCO ₂窒息によりマウス。
2. 空のペトリ皿中または滅菌ガーゼ上で、オープン広い背中、足にマウスを置き、私は（清潔な作業面を維持します）生物学的安全キャビネットをnside。 70％エタノール/ 30％Hと皮膚と毛を湿ら₂ O（v / v）です。
3. 手術用ブレードまたは鋭いハサミで足を切断してください。脚部に沿って皮膚を開き、鋸歯状の鉗子を用いて皮膚を引き離すカット。余分な筋肉を切り取ります。
4. 足の骨を引っ張ると反力として骨盤に対してはさみの刃を使用して大腿骨を脱臼。膝頭から脛骨と大腿骨を外し、筋肉や腱の残りのビットを削除します。 6ウェル組織培養プレート2-3ミリリットル中に骨を滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を配置。
5. 5ミリリットル滅菌PBSで骨を洗い流すことによって骨髄細胞を収集します。
   1. ピンセットで軽く骨を持ち、骨の一端に満たした1mlシリンジに取り付けた25 Gの針を挿入します。プランジ​​ャーを押して、15ミリリットルコニカルチューブに細胞を収集します。骨の中心が白になるまで、必要に応じて繰り返します。
6. 繰り返しに針を通すことにより細胞を解離単一細胞懸濁液を得ます。気泡や過剰な力を避けてください。注：この段階で、細胞生存率を改善するために、わずかに大きい針（22 G）を使用します。
7. 均一な細胞懸濁液を確実にし、破片や凝集塊を除去するために70μmのナイロンストレーナを介して細胞を渡します。
8. 血球計数器を用いて細胞計数のためにアリコートを削除します。 4℃で5分間、200×gで、残りの細胞懸濁液を遠心。滅菌PBS（10 ⁸細胞/ ml）に、必要に応じて細胞密度を再調整します。細胞を氷上に保管してください。

3.ドナー細胞HSC同等の確立

1. フローサイトメトリー染色のために5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブに3×10 ⁶個^の細胞（30μL）と同等のものを転送します。 （2.5 / mlの最終濃度（PBS、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）および1mM EDTAを補充した）、染色緩衝液で希釈）、非特異的染色をブロックするためにCD16 / CD32に対する非標識抗体の等量を加えます。 RTで5分間インキュベート。
2. 、ビオチン化リネージュカクテル（B220、CD3e、のCD11b、GR1、TER119）のSca1、CD117、CD135、CD150：染色緩衝液中で調製90μlの蛍光標識抗体のマスターミックスを追加します。光から保護して30分間、氷上でインキュベートします。
   注：適切な希釈は、抗体のロットごとに決定されるべきです。本研究で用いた希釈液のための材料の表を参照してください。
3. 未結合抗体を除去するために4℃で5分間、200×gで細胞、ボルテックスおよび遠心分離に2ミリリットルの染色バッファーを追加します。フリックにより上清と再懸濁ペレットをデカント。
4. 染色緩衝液で希釈した10μlの蛍光色素結合ストレプトアビジンは（ 材料表を参照）を追加します。光から保護し、20分間、氷上でインキュベートします。未結合ストレプトアビジンを除去するためのステップ3.3のように洗ってください。
5. 少なくとも6つの検出器⁹とフローサイトメーターを用いて細胞サンプルを取得します。林の周波数を決定する^-のSca1 ⁺ CD117 ⁺ CD135 ^- CD150 +細胞（HSCを推定） 図2に示すように、以前に^10,11を報告^しました 。
   注意：その集団内の機能HSCの頻度は1/3と1/5 ^2,12の間に推定することができます。
6. 以下および図2で説明するように、ベースラインのような1つのサンプル（典型的には、競合他社、この例ではB6.SJL CD45.1 ^+）を使用して、すべてのサンプル¹¹の推定HSC当量を確立します。
   1. 以下の式を使用して、必要な細胞の数を計算します。
      HSCを#transplanted /受信者= 5×10 ⁵細胞のxは（ベースラインサンプルのために決定されるように、この数は、野生型C57BL / 6マウスを、75と125の間に通常ある）HSC頻度を推定^10-12。
      注： 図2では、試料Aのために、結果は139のHSCです。
      （他のサンプルのため、 図2の例のサンプルB）の合計＃移植された細胞=＃トランスHSC / HSC頻度を植えました。
      注： 図2では、試料Bの場合、結果は197826（または約2×10 ^5）総骨髄細胞です。
7. 上記で得られた結果を用いて、各サンプルのため移植片受容者ごとに必要な細胞の総数を計算します。
   注意：この数は、ベースラインサンプル（競合他社）のために5×10 ⁵であるべきです。
   1. レシピエントマウスの数でステップ3.7から得られた数を乗算し、シリンジ内のデッドボリュームを補うために、少なくとも2つのさらなるマウスについての十分な細胞を追加します。
8. ステップ3.6で計算され、滅菌PBSを使用して、注射当たり200μlのための最終的な音量を調整すると1 HSC当量比：（ 例えば 、CD45.1 ^+）競合他社と1の試験細胞（CD45.2 ^+）を混ぜます。
   注：5レシピエントマウスのグループが提案ボリュームは、このように3.5×10 ⁶競技者の骨髄細胞を含有する1.4以上mlである（またはであろうために973 図2のサンプルA）の推定のHSC、およびテストセルの等価数は（ 図2に、サンプルBの等価）は197826×7 = 1384782骨髄細胞であろう。

4.骨髄移植

1. 血管の拡張を確実にするために、横尾静脈をより見やすくするために、赤加熱ランプとステップ1.2で照射レシピエントマウスをウォームアップ。
2. 27 G針（または小さい）を装備した1ミリリットルツベルクリン注射器を準備します。吸引し（3レシピエントマウス用）調製した細胞懸濁液の約750μlの。シリンジ内に気泡がないことを確認してください。
3. 拘束装置にマウスを挿入します。尾を調べ、尾の両側にはっきりと見えるはず外側尾静脈を探します。エタノールで注射部位を拭きます。 、アップベベル針を挿入し、皮膚に平行で、静かにプランジャーを押してください。注射は簡単にする必要があります。力再ある場合quiredは、針が静脈ではありません。
   注意：古いマウスは厚い皮を持って、より困難な静脈を見つけることができます。針が静脈内にない場合は、最初の注射部位に注射針の近位を挿入します。
4. 針を外し、出血を止めるために数秒間滅菌ガーゼで注射部位を押してください。きれいなケージにマウスを転送します。
   注意：針があまりにも鈍くなることがあり、その後3回の注射のために同じ注射器と針を使用してください。
5. 移植後のフォローアップのために、最初の5日間、マウスを再水和するために滅菌PBSを皮下1ミリリットルを注入。感染を防ぐために水を飲んで抗生物質を追加します（必要に応じて、オプション）。最初の3週間は2〜3日ごとにマウスを計量し、その移植前の体重（またはローカルの動物倫理委員会によって決定される）以上の15から20までパーセントを失ったマウスを安楽死させます。

末梢血の5.分析

1. 一滴の血液を収集する（Approx。 EDTAチューブに50-100μl）を。
   1. 下顎静脈から血液を採取するには、顎骨の下に位置するヘアレススポットに近い顔の皮膚を穿刺し、血液¹³の滴を受け取るために捕集管を配置するために、ランセットまたは22 G針を使用しています。多系列再構成に従うように、移植後4、8、12および16週目に血液を採取します。
2. ステップ5.1.1で採取した血液の低下に1ミリリットル新たに調製したRT赤血球溶解バッファー（9部0.16 M NH ₄ Clで+ 1部0.17 Mトリス塩酸pHは7.65）を追加します。混合し、フローサイトメトリーに適した5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブにサンプルを移します。 RTで4分間放置してみましょう。
3. 氷冷PBSの4ボリュームを追加します。エンド・ツー・エンドを回して混合し、氷上ですぐに転送します。 4℃で200×gで遠心分離10分。
4. フリックにより上清と再懸濁ペレットをデカント。上清を明確にし、赤でなければなりません。簡単にバッファと渦を染色2ミリリットルを追加します。 200 XGAで5分間遠心トン4°C。
5. フリックにより上清と再懸濁ペレットをデカント。
6. CD45.1、CD45.2、CD3e、CD19、GR1：ステップ3.3から3.1に詳述さ一般的なプロトコルを使用して染色、フローサイトメトリーと、次のマスターミックスのための抗体を続行します。
7. 少なくとも6つの検出器⁹とフローサイトメーターを用いて細胞サンプルを取得します。 図3に設けられた分析テンプレートを使用して、各試料中の各系統（CD19 ⁺ Bリンパ球、CD3e ⁺ Tリンパ球、GR1 ^明るい顆粒球）および^10,11を公開としてドナー由来細胞の頻度を決定します。

骨髄再構成の6分析

1. 部2ステインにマスターミックスのためのステップ3.3から3.1に詳述さ一般的なプロトコルを使用してフローサイトメトリー分析のための細胞と以下の抗体を詳述したように骨髄細胞を収集：リネージュカクテル、のSca1、CD117、CD135、CD150、CD45.1 、CD45.2。 LINを検出ステップ3.4で説明したように蛍光色素結合ストレプトアビジンを使用してEAGEカクテル抗体。
2. 少なくとも8の検出器⁹とフローサイトメーターを用いて細胞サンプルを取得します。のみ6が利用可能な場合はCD135 ⁺細胞が除外されるように、系統パネルと同じチャンネルにCD135を追加します。 図4に^、10が公開され提供される分析テンプレートを使用して、各サンプル中のCD150 ⁺のHSC ^-のSca1 ⁺ CD117 ⁺ CD135 ^-ドナー由来林の周波数を決定します。

結果

二次移植（さらに後述）を含む競争力の移植設定の一般的な説明は、 図1に見出すことができる。移植前の骨髄のHSCのための代表的な分析は、図2に記載されています。ダブレットの除外に関するより詳細な情報と死んだ細胞は、他の場所⁹見つけることができます。

図3及び図 4はそれぞれ、末梢血および骨髄の分析テンプレートフローサイトメトリーの例を提供します。いくつかのホストのTリンパ球を検出するために正常である（すべてのT細胞の20％まで; 図3B）、T細胞がより放射線抵抗性であるように。競合他社由来細胞はすべての3つの系統で存在すべきです。検出限界は内2万セルの合計を分析するために獲得した総細胞の数に大きく依存するが、我々の経験で単一白血球...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、既知の競合他社のHSCに対するドナー（テスト）HSCの相対的な適合性を評価するために設計されています。競争の状況は（幹細胞のフィットネスの緩やかな減少を検出する可能性が高い）アッセイの相対感度を向上させ、照射し、注射の有効性のための内部の技術的な制御を提供します。しかし、それはHSCのフィットネスの絶対的な尺度として使用されるべきではありません。競争力の再構築の減少は、自動的にHSCが競争の不存在下でうまく機能しないことを意味するものではありません。それは競争力の設定がより良い出発点であることを主張することができますが、競合細胞が不良HSC機能を救出され、すべてのレシピエントマウスは生存するように、1は、結果の解釈には注意すべきです。非競争的環境の中で結果を確認するとの結論を固めるます。

ここで紹介する実験計画は、HSC等価クを使用しています総骨髄細胞のantitiesの代わりに-sorted HSCを、フローサイトメトリーの純粋な集団。異なるドナー間の変動を排除し、表現型HSC周波数の変動がHSC機能¹⁴の変化として解釈されないこ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
K2EDTA付きマイクロテーナーチューブ	BD Biosciences	365974
20 G ニードル	BDシリンジ		顎静脈からの採血用
LabQuake Shaker rotisserie	Thermo Scientific	C415110
Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block)	BD Biosciences	553142	2.50 μg/ml
Pe-Cy7-標識抗マウスCD3e(クローン145-2C11)	eBioscience	25-0031	0.25 μg/ml
PE標識抗マウスCD19(クローン1D3)	eBioscience	12-0193	0.25 μg/ml
APC-eFluor780 (APC-Cy7 当量)-標識抗マウス GR1 (クローン RB6-8C5)	eBioscience	47-5931	0.25 μg/ml
FITC標識抗マウスCD45.1(クローンA20)	eBioscience	11-0453	2.50 μg/ml
eFluor450-標識抗マウスCD45.2(クローン104)	eBioscience	48-0454	1.00 μg/ml
ビオチン化抗ヒト/マウス CD45R (B220) (クローン RA3-6B2)	eBioscience	13-0452	1.25 μg/ml
ビオチン化抗マウス CD3e (クローン 145-2C11)	eBioscience	13-0031	1.25 μg/ml
ビオチン化抗マウス CD11b (クローン M1/70)	eBioscience	13-0112	1.25 μg/ml
ビオチン化抗マウス GR1 (クローン RB6-8C5)	eBioscience	13-5931	1.25 μg/ml
ビオチン化抗マウス TER119 (クローン TER119)	eBioscience	13-5921	0.625 μg/ml
V500 ストレプトアビジン	BD Biosciences	56149	0.5 μg/ml
PE標識抗マウスCD117(クローン2B8)	BD Biosciences	553355	0.25 μg/ml
PE-Cy7-標識抗マウス Ly6A/E (Sca1) (クローン D7)	BD Biosciences	558162	0.25 μg/ml
PerCP-eFluor710-標識抗マウスCD135(クローンA2F10)	eBioscience	46-1351	0.5 μg/ml
Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2)	Biolegend	115918	0.625 μグラム/ミリリットル BD BiosciencesとeBioscienceは、同じクローン
mlツベルクリンシリンジと27 G針BD	シリンジ	309623
1 mlツベルクリンシリンジ25 G針BD	シリンジ	309626
70 μMセルストレーナー	BD Falcon	352350

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