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方法論記事

調製及び器官胸腺スライス培養の応用

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DOI:

10.3791/54355

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2016年8月6日

 ,  , 
1Centre de Recherche, Hôpital Maisonneuve-Rosemont, 2Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

我々は、フローサイトメトリーと組み合わせて、T細胞の開発の正および負の選択をモデル化するために使用することができ、胸腺切片の調製を記載します。胸腺スライスはまた胸腺細胞遊走、局在のその場での分析のために適合され、そして免疫蛍光及び二光子顕微鏡検査を介してシグナル伝達することができます。

要約

機能性、自己寛容T細胞レパートリーの生成をもたらすユニークかつ高度に組織化された胸腺微小環境における胸腺の選択に進む。T系譜コミットメントと開発を研究するためのin vitroモデルは、このプロセスに貴重な洞察を提供してきました。しかしながら、これらのシステムは、T細胞の発達に必要な完全な三次元胸腺環境を欠いており、従って、 インビボ胸腺選択の不完全な近似値です。モデル化T細胞の発達に関連した課題のいくつかは、完全にT細胞を開発する胸腺選択をサポートする完全な胸腺の微小環境を提供し、その場モデルで使用することによって克服することができます。胸腺スライス器官培養物は、 その場での技術に存在補完します。胸腺スライスは、胸腺皮質と髄質領域の整合性を維持し、定義された発生段階の、または内因性のT cのオーバーレイ胸腺細胞の発達を研究するためのプラットフォームを提供します成熟胸腺微小環境内ells。マウスあたり〜20のスライスを生成する能力を考えると、胸腺のスライスは、ハイスループット実験のための拡張性の面でユニークな利点を提示します。さらに、多様な遺伝的背景は異なる胸腺サブセットまたは他の細胞集団をオーバーレイする胸腺スライスと可能性を生成する際の相対的な容易さは、この方法の汎用性を高めます。ここでは、胸腺スライス、単離および胸腺細胞のオーバーレイ、およびフローサイトメトリー分析のために胸腺スライスの解離を調製するためのプロトコルを説明します。このシステムは、非従来型のT細胞の発達を研究するだけでなく、胸腺細胞の移行、胸腺間質細胞の相互作用、及び二光子顕微鏡で胸腺の選択に関連するTCRシグナルを可視化するために適合させることができます。

概要

T細胞は、それらが機能的な、自己寛容T細胞レパートリー1-3の発生を確実にいくつかのチェックポイントが発生したその間胸腺における発生中間体の一連の分化します。正の選択は、皮質胸腺上皮細胞（CTEC）2,3上の主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）によって提示された中程度の親和性、ペプチドに低いと、認識することができるT細胞受容体（TCR）との胸腺細胞の生存を促進します。負の選択と制御性T（T REG）細胞の発達は、MHC 2,4によって提示される自己ペプチドに強く反応胸腺細胞の排除や流用を介した自己寛容の確立に貢献しています。未熟CD4 + CD8 +選択プロセスは、成熟T細胞亜集団に分化渡すTCRを発現しているダブルポジティブ（DP）胸腺細胞、MHCクラスであるの大半はI制限CD8 +細胞傷害性二次リンパ器官1-3エフェクター機能を実行するために胸腺を終了する前に、またはMHCクラスII拘束性CD4 +ヘルパー単一陽性（SP）T細胞。

T細胞発生の複雑さに加え、動的移動および間質細胞網5-9を通して胸腺細胞を発生する細胞の出会いです。これらの間質細胞は、胸腺細胞の開発に異なる役割を果たし、差動で正と負の選択が10を発生する胸腺皮質と髄質領域の間に分布しています。正の選択は、主に皮質で行われますが、DP胸腺細胞は、髄質に移動し、彼らは髄質は、正の選択および系統の完了に必要な追加の信号を提供することができることを示唆している成熟T細胞に分化する前に、TCR信号を必要とし続けることを蓄積証拠があります分化11,12。さらに、自己反応性胸腺細胞13,14の削除を促進する組織限定抗原を発現し、現在専門の髄質胸腺上皮細胞（MTEC）の存在にもかかわらず、負の選択の大部分は、遍在樹状によって提示された自己ペプチドを発現するために応答して、皮質で発生しますセル15,16。このように、T細胞の発達の正確なモデルは、胸腺細胞や間質細胞間の相互作用を促進し、これらの細胞は、正と負の選択を受けるよう胸腺細胞の移行をサポートし、無傷の皮質と髄質領域で、高度に組織化胸腺微小環境を提供する必要があります。

正および負の選択を研究する手段として、胸腺細胞のex vivo分析を補完するために、 インビトロ、インサイチュで 、およびT細胞の発達のin vivoモデルの数は、17-22を開発されてきました。要約する難しいことで知られています正のin vitroでの選択が、Notchリガンドを発現している間質細胞と幹細胞集団またはT細胞前駆体の共培養、特にOP9-DL1 / 4細胞は、へvitroモデルで非常に貴重なそれを作るT系譜コミットメントと制限された正の選択をサポートする機能を持っています研究T細胞の発達23-25。このシステムの限界は、しかしながら、これらの細胞が胸腺ストローマ細胞に見出される固有のペプチド加工機械や三次元の胸腺の微小環境を欠いているという事実が挙げられます。

しかし、より技術的に面倒な、 その場でおよび胸腺選択のin vivoモデルにおける in vitro系に関連する障壁のいくつかを克服することができます。再凝集胸腺器官培養（RTOC）は胸腺細胞と胸腺ストローマ細胞18,26,27の定義された混合物を含有します。これらの胸腺上皮細胞の再凝集は、MHCクラスIおよびII発現を維持し、developmeをサポートすることができNTの両方の従来のT細胞サブセットの、それでも定義皮質及び髄質構造を欠いています。胎児胸腺器官培養（FTOC）はlymphoreplete胸腺ローブにlymphodepleted胸腺ローブのハンギングドロップ培養を介して、または胸腺細胞の注射を介して胸腺細胞を播種することができ、T細胞の発達の人気モデルであり、CD4 +およびCD8 + Tの効率的な開発を支援します文化18,28-31の経時細胞。胎児胸腺葉の培養の開始時mTECsの不足はありますが、定義された皮質と髄質の構造は、条件に応じて時間をかけて開発することがあります。重要な考慮事項は、このモデルは、優先的に、成人T細胞の発達に対する胎児サポートすることができるということです。最後に、成体マウスで定義された胸腺前駆体の胸腺内注入は技術的に困難であるが、明らかにサポートするための環境を提供します in vivoでの T細胞の発達。 その場およびin vivoモデルでこれらは、優れたツールのトンですO研究T細胞の発達およびその使用は、実験ごとの実験に基づいて考慮されるべきです。

胸腺スライスは、しかし、最近ではユニークな、複雑で、一般的により高いスループット実験に対応するために、可能性とその場で胸腺選択を研究するための汎用性、補完的なモデルとして浮上しています。胸腺のスライスは、皮質と髄質領域の完全性を維持し、開発だけでなく、効率的なポジティブ及びネガティブ選択11,32-39時に胸腺細胞の移行をサポートしている間質細胞のフレームワークを提供します。胸腺のスライスの上に追加された胸腺細胞のサブセットは、組織内およびそれらの適切な微小環境ニッチ34,37に移行します。オーバーレイ胸腺細胞は、コンジェニックマーカーまたは蛍光標識を介して胸腺スライス内因性の細胞と区別することができ、数日間培養物中に維持することができます。胸腺スライス器官培養物は、様々な側面を研究するために使用することができます特に胸腺の選択、胸腺細胞の挙動（遊走と細胞の相互作用）、および胸腺細胞の局在化を含むT細胞の発生、の。マウスあたり〜20胸腺スライスを生成する能力が与えられ、実験のスケーラビリティは、胸腺選択の現場モデルにおいて 、一般に、他よりも大きいです。細胞死および封入膜の欠如を介して経時的に細胞の喪失による胸腺切片の調製は、ビブラトームように、特殊な装置を必要とし、培養物中の胸腺スライスの寿命が限られているが、胸腺スライスが優れたモデルを提供します成熟胸腺微小環境内の胸腺細胞の同期集団の胸腺選択の分析のため。ここでは、胸腺細胞の単離およびオーバーレイ、胸腺スライスの準備（胸腺を収穫含め、胸腺ローブのアガロース埋め込みおよび包埋組織のビブラトーム切片）を記述し、フローサイトメトリー分析のための胸腺スライスの解離。

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プロトコル

Hôpitalメゾヌーブ-ローズモント - すべての動物実験のためのプロトコルは、センターデRECHERCHEで動物実験委員会によって承認されました。

胸腺スライスや単一細胞懸濁液の調製のための1収穫マウス胸腺

  1. 頸椎脱臼に続いてCO 2でマウスを安楽死させます。
  2. 層流フードでは、解剖ボードにマウス腹側をピンアップ。 70％エタノールでマウスをスプレーします。胸腔に入ると組織を損傷からエタノールを防ぐために、ガーゼで軽くたたくことによって、任意の過剰のアルコールを除去します。
  3. ピンセットで胸骨の基部に皮膚を持ち上げ、皮膚を介してカットをします。各前肢に上向きに皮膚のカットを拡張します。
  4. 胸郭からダイアフラムを分離するために胸骨の基部に追加のカットを行います。その後、鎖骨に向かって胸郭の両側をカット。胸腔を露光ヘッドに向けて胸郭を裏返し。の2つのローブ胸腺は、心臓の上に横たわります。
  5. 鉗子、マイクロ解剖ハサミ、および/または鋭い湾曲したハサミを使用して、胸腺の葉の周りの結合組織を削除します。下からや結合組織を、残りを経由して、個々のローブを持ち上げるために先端の細い湾曲鉗子のペアを使用してください。
    注：直接胸腺を把握しないでください。
  6. PBSを含む15ミリリットルコニカルチューブに胸腺葉を置き、必要になるまで氷上に取っておきます。

2.アガロース埋め込みおよび胸腺ローブのビブラトームスライス

  1. 50ミリリットル滅菌PBSで2グラムの低融点アガロースを溶解し、アガロースが完全に溶解するまで低設定に電子レンジにより埋め込むための4％アガロース溶液を調製します。使用するまで55℃の水浴中でアルミホイルと場所で、フラスコをカバーしています。
  2. 組織培養フード中で、10％ウシ胎児血清（FBS）を含有する完全RPMI-1640培地を調製し、4mMのL-グルタミン、1×ペニシリン/ストレプトマイシン、および10μM2-メルカプトエタノール。
  3. 6ウェル細胞培養プレートて1.5 mlをウェル当たり完全RPMI-1640培地を加え、各ウェル中の細胞培養インサートを配置します。必要になるまで37℃のインキュベーターに置いてプレートを設定します。
  4. 氷のバケツに水と氷でぬかるみ氷水浴を準備します。
  5. 慎重に先端の細いピンセットを用いて、各胸腺葉を取り巻くすべての残りの結合組織を除去します。組織への転写をPBSに浸し、または解剖顕微鏡下でワイプ後に胸腺葉を、組織培養皿にPBS中に沈めている間にこれを行います。
  6. フラスコは、組織の過熱を防ぐため、触るとちょうど暖かいときアガロースは、40℃以下に冷却することができます。約1センチの高さに組織型の中にアガロースを冷却し、4％を注ぎます。
  7. 慎重に組織ワイプや組織に損傷を与えることなく、それを乾燥させるために軽くロールに胸腺葉を転送するためにピンセットを使用してください。組織が完全に乾燥していることを確認またはそれはスライス中にアガロースの外にスライドします。
  8. 慎重にアガロースにローブを挿入し、金型の底部に（スライスの数を増加させる）のいずれかの横方向（各スライスの表面積を増加させる）、または垂直に配置。アガロースが固化することを可能にするために5〜10分間氷水中で金型を置きます。
  9. この間、バッファトレイを取り付け、試料ディスクを組み立て、そしてビブラトームのブレードを挿入することにより、スライス用のビブラトームを準備します。検体ディスク上の実験室でのテープ片を置きます。 70％エタノールできれいに、組み立てられたワークスペースを滅菌します。
  10. アガロースが固化したら、アガロース埋め込まれたローブを解放するためにその中心に静かに金型とプレスを反転。
  11. 下部に0.5センチメートル両側にアガロース〜2ミリメートルを残してと〜葉の周囲の過剰なアガロースをトリミングする鋭い刃を使用してください。
  12. 試料ディスク上のテープ片に組織接着剤のドロップで各アガロースブ​​ロックを固定します。複数のブロックは、テープに接着することができます。
  13. ビブラブレードのwiを合わせますアガロースブ​​ロックの先頭番目。ブレードとアガロースブ​​ロック（複数可）が完全に浸漬されるまで、滅菌PBSでバッファトレイを埋めます。
  14. セクションアガロース包埋組織は400-500ミクロンの厚さの切片を得ました。 0.225ミリメートル/秒の速度、100 Hzの周波数、および5°の角度にビブラトームを設定します。
  15. 彼らはカットされているように滅菌PBSを含む組織培養プレートに胸腺のスライスを収集するために曲がったへらを使用してください。最初と最後のスライスを破棄します。
  16. 4Xの倍率で光学顕微鏡下でスライスを調べます。無傷の胸腺組織と周囲のアガロース（ 図1A）でスライスを選択してください。
  17. 優しく細胞培養インサート上に曲がっへらから胸腺のスライスをスライドするようにピペットチップを用いて、ステップ2.3で調製したプレートにスライスを転送します。各インサートは〜3スライスを収容することができます。スライスが互いにまたは細胞培養インサートの壁に触れないようにしてください。
  18. 必要になるまで37℃でプレートを維持します。
3。オーバーレイのための胸腺細胞の調製

  1. 項1に記載のように、2％FBSを含む滅菌PBS 5mlで満たされた滅菌15 mlの組織グラインダーを使用して単一細胞懸濁液を作製するために手動でローブを解離胸腺ローブを分離します。 15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移します。
  2. 4℃で5分間、545×gで細胞を遠心。上清を廃棄し、赤血球を溶解するために3分間室温で1×ACK溶解緩衝液（0.15 M NH 4 Cl を 、10mMのKHCO 3、0.1mMののNa 2 EDTA）1ml中に細胞を再懸濁。
  3. PBS、2％FBSを含有する15ミリリットルにチューブを埋めます。 4℃で5分間、545×gで細胞を遠心。
  4. 2％FBSを含有する10mlのPBSで細胞を再懸濁し、255ミクロンのメッシュフィルターを通してセルを通過します。
  5. 血球計数器を用いて細胞を数えます。 4℃で5分間、545×gで細胞を遠心分離し、concentrで2％FBSを含むPBS中で細胞ペレットを再懸濁1mlあたり1×10 7細胞のエーション。
  6. セルラーようなカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルなどの染料（CFSE）スライス内因性細胞から区別するためにコンジェニックマーカーまたは遺伝的にコードされた蛍光レポーターを発現するマウスから胸腺細胞を使用していない場合は、製造業者のプロトコルに従って用いて細胞を標識。
  7. 標識された細胞の最終洗浄後、15μlの当たり1-3×10 6個の細胞で完全RPMI-1640培地中で細胞ペレットを再懸濁します。

4.胸腺スライス上に胸腺細胞のオーバーレイ

  1. インサート上の胸腺のスライスを囲む任意の液体を吸引するピペットを使用してください。
    注：アガロースを損傷しないように注意してください。アガロースが損傷している場合は、オーバーレイ胸腺細胞は、表面張力の損失にスライス表面に付着しません。
  2. ピペットチップでスライスを触れることなく、オーバーレイ各胸腺スライスにセクション3で調製した胸腺細胞の15μlの。
  3. ナンプラーをインキュベート細胞は胸腺スライスに移行することを可能にする2時間37℃でTE。
  4. 2時間後、まだ組織に移行していない余分なオーバーレイ胸腺細胞を除去するために、1mlのPBSで胸腺のスライスを3回すすいでください。
  5. 胸腺スライスが実験に応じて、通常、1から72時間、収穫する準備が整うまで、37℃でプレートをインキュベートします。

フローサイトメトリーのための胸腺スライスの5解離

  1. 2％FBSを含むPBS150μlのを追加することによって、各スライスのためのマイクロチューブを準備します。
  2. 胸腺スライスを持つ組織培養インサートに2％のFBSを含む1mlのPBSを加え、穏やかに細胞培養インサートの表面からスライスを切り離すために曲がったへらでかき混ぜます。
  3. 曲がったスパチュラを用いてマイクロチューブに挿入からスライスを転送します。
  4. 手動マイクロチューブサンプル乳棒を使用してスライスを混乱させる。最終容量300に、2％FBSを含むPBS150μlのを追加します。μlの。
  5. 新しいマイクロチューブに40μmのフィルターを通して解離した組織をフィルタリングします。フィルタリング細胞は、フローサイトメトリー分析40のために染色される準備ができています。
  6. すべてのアガロースを除去し、フローサイトメーターを詰まらせないようにするために、フローサイトメーター上に通す前にフィルタセルもう一度。
  7. フローサイトメーターで細胞を取得し、あらかじめ40に記載されているように、データを分析します。

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結果

胸腺切片は、陽性および陰性選択などのT細胞の発達の様々な側面の分析をサポートします。成功した実験では、胸腺スライスの品質が最も重要です。 従って、胸腺スライスは胸腺組織の完全性を保証するために検査されるべきであり、胸腺スライスを囲むアガロースは、インタクトな（ 図1A）です。アガロースが組織内に移動胸腺細胞数の有意な減少を引き起こして破損しているときに表面張力が損なわれる可能性があります。したがって、アガロースにおける組織損傷またはニック/涙の適応症を持つ胸腺スライスが（ 図1B）は廃棄されるべきです。

TCRトランスジェニック（TG）マウスは、しばしばポリC以上の正の選択の頻度を増加させ、すべての胸腺細胞の表面上に定義された、機能的なTCRの表現に胸腺選択を研究するために使用されていますlonal集団。ポジティブ選択の各段階を捕捉するために、事前...

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ディスカッション

ここでは、胸腺スライスとフローサイトメトリーによるオーバーレイ事前選択MHCクラスI拘束性TCRトランスジェニック胸腺細胞の効率的な正と負の選択の代表的な結果を調製するためのプロトコルについて説明します。このシステムは、アゴニスト抗原、ネガティブ選択および胸腺のTreg開発11,12の存在下で、事前選択DP胸腺細胞32からのMHCクラスII拘束性CD4 + T細胞の正の選択をサポートするために、同様の成功を収めて使用されています36,38,39,43,44。このプロトコルは、阻害剤の存在下または非存在下での胸腺選択、定義されたペプチド、ならびに遺伝的に改変された胸腺細胞または間質細胞集団を研究するために修飾することができます。胸腺スライスはまた、胸腺細胞サブセット以外の細胞集団のオーバーレイに適しています。例えば、それは最近、胸腺のスライスの上に重ねた樹状細胞を効率的に組織に移行することが示されたと負のSelectIOをサポートすることができますnおよびTのregの開発39,...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

原稿に対するコメントをいただいたMarilaine Fournierさんと、技術支援をいただいたJosée Tessierさんに感謝いたします。C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1#4175はNIAID交換プログラム(NIH)を通じて入手しました。この研究は、SickKids FoundationとCIHR-IHDCYN(NI15-002)からの助成金、CIHR-III(MOP-142254)からの運営助成金、およびFRQS(Établissement de jeunes chercheurs)とHôpital Maisonneuve-Rosemont FoundationからのHJMへのスタートアップ資金によって提供されています。HJMは、FRQSのジュニア1奨学生であり、CIHR新人研究員(MSH-141967)、およびコール財団の早期キャリア移行賞を受賞しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ビブラトームライカバイオシステムズVT1000S 
NuSieve GTG アガロースロンザ50080低融点アガロー
埋め込みモールド (切り捨て - T12)Polyciences1898622 mm x 22 mm 正方形、12 mm x 12 mm に切り捨て
ダブル エッジ プレップ ブレードPersonna74-0002
組織接着剤3M 1469SB
0.4 & マイクロ;m 細胞培養インサート BD Falcon353090テストされたいくつかのブランドのうち、これらはスライスの上の細胞を維持しました 最高の
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水ThermoFisher21600-010
RPMI-1640 L-グルタミンWisent350-000-CL
ウシ胎児血清Wisent 080-110熱不活性化
L-グルタミン、200 mMWisent609-065-EL
ペニシリン/ストレプトマイシン、100xWisent450-201-EL
2-メルカプトエタノールAlfa AesarA15890
15 ml テンブルック ティッシュグラインダーウィートン357426
ナイロン メッシュ フィルターコンポーネント サプライU-CMN-255
マイクロ遠心チューブ サンプル 乳棒Bel-ArtF19922-0000
40 &マイクロ;mナイロンセルストレーナーBDファルコン352340
鉗子イノックスチップデュモン RS-5047細い先端湾曲鉗子、サイズ.17 x .10 mm
マイクロ鉗子デュモン RS-5090 
ス

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