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方法論記事

マウスにおける超音波ベースのパルス波速度の評価

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DOI：

10.3791/54362

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2017年2月14日

 ,  ,  , 
1Institute of Life Science, Scuola Superiore Sant'Anna, 2Institute of Clinical Physiology, National Research Council, 3Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa

この記事について

サマリー

動脈硬化は、動脈硬化の代理指標と考えることができ、心血管疾患とパルス波速度（PWV）の重要な要素を表します。このプロトコルは、異なる動脈部位に適用された超音波画像処理に基づいて、マウスにおいてPWVを算出するための画像処理アルゴリズムを記述する。

要約

動脈硬化は、脈波伝播速度（PWV）、 すなわち 、脈波管容器内で移動する速度を計算することにより評価することができます。このパラメータは、ますます、特定の遺伝子型/治療に関連血管機能の変化を評価するために、または心血管疾患の進行を特徴付けるために使用される小型の齧歯類モデルで研究されています。このプロトコルは、超音波（US）画像のみを使用して、マウスでの非侵襲的動脈PWV測定につながる画像処理アルゴリズムを説明します。本手法は、マウスの腹大動脈のPWVを評価し、その年齢に関連した変化を評価するために使用されています。

腹部大動脈米国スキャン高周波米国プローブを備えた特定のUS装置を用いて、気体麻酔下マウスから得られます。 Bモードとパルス波ドプラ（PWドプラ）の画像は、それぞれ、直径を求め、速度の瞬時値を平均するために分析されています。この目的のために、エッジ検出や輪郭追跡技術が採用されています。シングルビートは、直径と速度波形が時間直径-速度（LND-V）ループを実現するために整列され、組み合わされている意味します。 PWV値は、初期の収縮期に対応するループの直線部分の傾きから得られます。

本発明の方法を用いて、マウスの腹部大動脈約解剖学的及び機能的情報を非侵襲的に達成することができます。 US画像の処理を必要とするだけで、その弾性特性の点で、マウスにおける異なった動脈部位の非侵襲的な特徴付けのために有用なツールを表すことができます。本技術の適用は容易従って、マルチサイト動脈硬化の評価を取得する可能性を提供し、そのような頸動脈のような他の血管の地区に拡張することができます。

概要

マウスモデルは、ますます、心血管疾患（CVD）の調査のために使用され、特に、疾患の発症1の異なる相の特徴付けを可能にする長手方向の研究に使用されています。大動脈の弾性特性は異なる病理学的状態に関連しています。技術的な観点から、動脈硬化は、パルス波が導管容器2内を移動する速度を表す脈波伝播速度（PWV）を測定することによって評価することができます。理由は、その臨床的重要性は、ますますも前臨床小動物モデル3で測定されます。

異なる技術は、マウスにおけるPWVを評価するために利用可能です。侵襲的なアプローチは、カテーテル先端の圧力変換器の使用に基づいています。 PWVは、二つの異なる動脈部位に圧力信号を取得する二つの測定の間の距離を割ることによって評価されます信号4との間の時間シフトによってITES。技術のこれらの種類に関連する主な欠点は、2つの測定位置と、従って、縦研究に使用することができないとの間の距離を評価するための動物の犠牲を必要とすることです。この制限を克服するために、異なる画像化技術に基づく非侵襲的なアプローチが、開発されています。以前の研究は、速度エンコードされた磁気共鳴画像データ5とパルスドップラー信号6の通過時間法を適用したマウスにおいて、PWVの評価を報告しています。しかしながら、これらの方法で得られたPWV値は、動脈硬化の地域の評価です。実際には、大きさや弾性特性の点で異なる動脈を占め、平均値を表しています。また、評価のこれらの種類はinfができ、エラーの原因である二つの測定部位間の距離の評価を必要とします最終的な結果をluence。

PWVは、直径、速度（LND-V）ループ7を用いて評価することができます。この方法は、選択された容器の直径及び流速値の同時評価に基づいています。この手法によれば、LND-Vループは自然対数の直径の値をプロットした対速度値を平均し、PWVは、早期収縮期に対応して得られたループの直線部分の傾きを計算することによって推定されます。この方法の実用化に関しては、以前の作品は、すでにin vitroでのセットアップシステム7への応用と人間8の両方の頸動脈および大腿PWVの評価のためのその使用に関する結果を報告しています。

本研究の主な目的は、Uを用いて、マウスにおいて非侵襲的動脈PWV測定値を提供する画像処理アルゴリズムの詳細な説明を提供することですS映像のみ。提案されたアプローチは、Bモードとパルス波ドップラー（PW-ドップラー）画像の両方の処理により、局所動脈硬化を評価することができ、そのような腹部大動脈として、重要な鍵の動脈に適用することができます。

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プロトコル

動物実験は、欧州指令（2010年版/ 63 / UE）、イタリア法（D.Lvo 2014分の26）に従って行われ、それが実験動物ケアの原則に従いました。地域の倫理承認パネルが試験を承認しました。

1.イメージング手順

  1. 1リットル/分純酸素中の2.5％イソフルランで満たされた麻酔導入チャンバー内にマウスを置きます。つま先のピンチに無反応によって麻酔の深さを確認してください。
  2. 仰臥位で温度制御された基板上の動物を置きます。ドライ実行しているそれらを回避するために、眼軟膏で動物の目を湿ら。専用のノーズコーンにマウスの鼻を配置することによって、麻酔ガスの流れ（1.5％イソフルラン）を供給する。必要に応じて、研究対象の動物に応じて、ケースにケースからイソフルランの割合を調整します。 40℃の基板温度を修正しました。
  3. コートに埋め込まれたECG電極上に導電性ペーストやテープそれらを持つ動物の四肢ボード。ワセリンで潤滑直腸プローブで体温を測定します。すべての生理学的測定（ECGおよび呼吸信号だけでなく、温度）が正しく取得されて表示されることを確認してください。
  4. 脱毛クリームと音響結合ゲルとコートをして腹部から化学的に髪を削除します。
  5. メカニカルアームに（13-24 MHz）の米国のプローブを配置します。
  6. 動物への米国のプローブの並列を修正し、焦点ゾーンに位置する関心領域と腹部大動脈の長手方向の画像を得るために、その位置を調整します。
  7. 解剖学的情報を収集します。
    1. 高フレームレート、心電同期獲得9を可能にするボタンをクリックして、700 fpsのに等しいフレームレート取得を選択し、取得を開始します。注：この方法では、単一の心周期に関連する血管の解剖学的画像を取得することができます。
  8. 流速の情報を収集します。</強いです>
    1. 同じスキャン投影を使用して、PW-ドップラーボタンをクリックして、血管の中心にサンプルボリュームを配置し、シネループが3秒より短くはないことを保証する画像を取得します。これらのデータは、できるだけ小さい角度補正を維持し得た米国の投影に基づいて事例にケースからそれを調整し得ます。
  9. 温度制御ボードから動物を削除し、完全な回復を待ちます。
    注：我々の経験では、これは約10分かかります。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人のままにして、動物しないでください。

2.後処理

  1. DICOMファイルとしてエクスポートBモードとPW-ドップラー画像やパソコン上に保存します。 .TIFF画像にPW-ドップラーDICOMファイルを変換します。
  2. 工程Bモード画像。
    1. 専用のグラフィカルユーザインタフェース（GUI）を使用して、対応するDICOMファイルをインポートします。
    2. 、輪郭を初期化する（それを起動するためのシングルクリック、ダブルクリック、それを終了させるための）容器の奥の壁に近く、ライン描画するには近くの壁に近いダブルクリックします。奥の壁にその近くに平行な線が自動的に表示されます。 「ANALYSE」ボタンを押すことにより、単一のフレーム上のアルゴリズムを適用します。
    3. 結果を確認してください。エッジが正しく同定されている場合（ すなわち 、初期化されたポイントの進化は後部と前壁の両方を検出した）、「GO」ボタンをクリックすることで、全体シネループ上のアルゴリズムを適用します。エッジが正しく識別されていない場合は、「クリア輪郭」をクリックすることで、それらをクリアし、ポイント2.2.2を繰り返すことによって、それらを再度初期化します。
      注：このアルゴリズムは、エッジ検出や輪郭追跡法に基づいており、以前に詳細10に記載されています。
    4. 「RECORD」ボタンを押すことによって、最終的な結果を取得し、CORRを保存単一の心周期に関連した瞬間直径値を含む.MATファイルをesponding。
  3. LND-Vループの実装のためのGUIを開きます。
  4. ベロシティカーブを意味し、シングルビートにつながるPWドップラー画像処理を開始するために、「VELOCITY」ボタンをクリックします。
    1. PW-ドップラー・トレースを確認し、「WHITE LINE」ボタンを押して、ゼロに等しい速度値に対応する行を見つけます。
    2. それぞれ、（キャリブレーションパネルで）「VELOCITY」と「TIME」ボタンを使用して、速度キャリブレーションと時間のキャリブレーションを実行します。これらのボタンを押すと1は、その長さが挿入されたキャリブレーション係数に対応する線を描画することができます。
    3. 手動で「ROIの生理」ボタンを使って、生理的信号を含むROIを選択します。
    4. 手動で「ROI SIGNAL」ボタンを押して、PW-ドップラートレースを含むROIを選択します。
    5. CLI「ANALYSE」ボタンをCKとエンベロープが識別されているか確認してください。結果が得られない場合は、（「速度閾値「編集可能なテキストフィールドに新しい値を入力して）、閾値を変更して再度「ANALYSE」ボタンを押してください。画像の品質に応じてチューニングし、場合にしきい値、。 「精緻化」ボタンを押してください。
    6. ECG信号のRピークの位置を確認し、「UPDATE」ボタンをクリックすることで、それに応じて速度包絡線信号を分割します。ノイズによって壊れているか、「CHOOSE BEATS」ボタンをクリックすることで、吸気相に配置されていないビートを選択してください。このようにして、単一ビート速度波形を意味得ます。
  5. 周波数領域で選択したビートを補間し、それらのすべてが参照11で詳述したように同じ数の点からなるようにする方法を、高速フーリエ変換を使用してください。単にRETを押すことで、自動的にこの操作を実行ビート一度PCキーボード上の壷キーが選択されています。 「平均速度」チェックボックスが単一のビートをチェックされている場合平均速度信号は、放物線状の速度プロファイル12を仮定し、2によって最大速度曲線を分割することによって達成されます。 「OK」ボタンを押してください。
  6. 「直径」ボタンをクリックします。 「INTERPOLATE」ボタンを押すことにより、シングルビート速度信号と同じサンプリング周波数を有する単一のビート直径信号を得るために、時間領域における単一ビート直径波形を補間します。 「OK」ボタンをクリックします。
    注：単一のビートの直径を有し、同一のサンプル周波数とデータポイントの同じ数の速度曲線を意味するために、それらは周波数領域において補間されます。
  7. （直径と速度波形を表示するグラフの上）アライメント方式として「第二次誘導体」アプローチを選択し、「UPDATE」buttoをクリックしてくださいn個。 2つの曲線が二次微分法14を使用して自動的に時間整列されます。
  8. シングルビートに対するシングルビート直径値の自然対数をプロットすることにより、最終的なLND-Vループを構築するには、速度値を意味します。 2つの波形が並んでいるときにこれが自動的に行われます。注：5％シングルビートの最大値の90％の間に含まれる点が速度曲線を自動的に配置され、これらの点の線形補間は、ループの直線部分の傾きを評価するために適用されるわけ。
  9. 以下の式7に従ってPWVを計算します
    figure-protocol-1

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結果

提案されたアプローチは、以前の研究11匹のマウスの腹部大動脈に適用されています。次の図は、実際のマウスの画像に記載されたアプローチの適用の結果を示します。これらのデータは、1匹の動物（：C57BL6、重量：13週齢の野生型マウス、株33 G）からのものである。特に、 図1は、米国の画像の解析の結果を表します。高フレームレートECGゲーティングモダリティで取得Bモード画像に適用されたエッジ検出と輪郭追跡技法は、直径波形を提供します。一方、PWドップラー信号の包絡線の識別は、速度曲線の評価を意味する単一のビートをもたらします。シングルビートの評価速度波形を意味するが、異なる心周期からのデータの平均値を含みます。示したデータは、速度曲線の標準偏差を（で得られた標準偏差の平均値として計算します各時点）は0.0137メートル/秒です。

シングルビート径と平均速度波形は、周波数と時間...

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ディスカッション

この研究では、マウスでPWV評価のLND-Vのループに基づいて、画像処理アルゴリズムを詳細に説明してきました。提案されたアプローチは、米国の画像処理に基づいてのみ、したがって、既存の技術6、マウスモデルにおける動脈硬化の評価のために13への有効な代替物を表すことができます。実際には、逆に動脈圧力信号の取得に基づいて屠殺される動物を必要とする侵襲的な方法6に、この技術は、完全に非侵襲的であり、従って、縦方向の研究の場合に特に好適であり得ます。また、地域や地方のない動脈硬化の評価を提供します。提案される方法は、反射波15によって影響されることが知られているが、それはローカルPWのために他の米国ベースのアプローチに対するより正確なPWVの評価を提供することができますこのような断面の投影におけるカラーフローデータの取得を必要とする流れ面積技術13に基づいて、そのようなV評価。 1.69メ...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
VEVO2100FUJIFILM VisualSonics Inc., Toronto, Canadaマイクロ超音波装置
MS250 超音波プローブFUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada超音波プローブ
EKV SoftwareFUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, CanadaSoftware
Matlab R2015a MathWorks Inc, Natick, MA, USAソフトウェア
導電性ペーストオペレーターラボ材料
ワセリンオペレーターラボ材料
脱毛クリームオペレーターラボ材料
音響カップリングゲル オペレーターされました 実験室の材料
開発されたMatlabソフトウェア著者は、ソフトウェアに関心のある研究者と協力し、彼らの監督の下でソフトウェアを利用できるようにする用意があります
マイクロが選択 が選択 が選択 によって選択

参考文献

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