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方法論記事

腎、免疫細胞の信頼性と高効率抽出

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DOI:

10.3791/54368

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2016年8月19日

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 2Division of Biomedical Sciences, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 3Division of Endocrinology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital

この記事について

サマリー

腎臓免疫細胞の分離に信頼性と効率性を備えた技術が、下流のアプリケーションのために必要とされています。これには、少数の腎臓免疫細胞の表面抗体標識が必要です。ここでは、この目標を達成すると思われる腎臓免疫細胞の単離のための簡潔な方法について説明します。

要約

免疫系の活性化は、複数の腎臓病と病態生理学的過程で起こります。 免疫系は、適応型と自然性の両方の要素と複数の細胞型で構成されています。 場合によっては、目的の細胞タイプが、腎臓から単離された多数の全細胞のうち、非常に少ない数で存在します。 したがって、腎臓疾患に関連する免疫学的問題を研究するためには、腎臓単核細胞集団を信頼性と効率よく分離することが重要です。 従来、腎臓単核細胞の組織単離は、さまざまな種類と強度のコラゲナーゼ/DNAsを使用した酵素消化によって行われ、さまざまな数の生存免疫細胞が生成されてきました。 最近、単一細胞単離のための機械的組織破壊物質の開発により、コラゲナーゼ消化ステップは回避され、マウスからの抽出後に腎臓の単純な機械的破壊に置き換えられています。 ここでは、毎日の免疫細胞抽出のための腎臓単核細胞の単離のためのシンプルかつ効率的な方法を示します。 さらに、腎臓の免疫細胞のサブセット解析の例を示します。 重要なことに、この技術は、肝臓や脳などの他の軟組織や非繊維組織にも適応できます。

概要

免疫系の活性化は、複数の腎疾患および病態生理学的プロセス6,10,11,13で発生します。活発な研究の潜在的な領域は、免疫系の活性化のための様々なトリガーを含む、種々の細胞型が関与する特定の疾患の設定におけるサイトカイン/ケモカインパターンなどの特定の薬物による上述のプロセスの全ての調節は、虚血 - 再灌流中、例示するために傷害（急性腎障害のモデル）、（6週間後）の修復または線維症の期間を通じて維持される数時間内の免疫細胞または骨髄由来造血細胞またはCD45 +細胞の増加がある5、 12。これらの免疫細胞は修復5,12のプロセスを調整するために、炎症誘発性および抗炎症性サイトカインおよびケモカインの両方を分泌します。現在、単一細胞懸濁液中の細胞集団を標識するために同時に複数のフルオロフォアを使用する能力は、広告と増加しています4 5へのレーザーで近代的なフローサイトメトリー機のベント。これは、実質的にそれらの機能の状態3,7に基づいて細胞集団を区別するために能力を追加しました。例えば、正確に低 F4 / 80 ローのCD11b 高 Ly6b 高 CD206としてマクロファージを標識するために、少なくとも3以上のフルオロフォアは、同じ生細胞のためのゲートにサンプルボリューム、CD45 +（白血球）とLy6G-（好中球）に必要とされるであろうとこれは非常に可能な新しいフローサイトメータ3です。しかし、サイトカイン分泌、細胞増殖、細胞毒性、マクロファージの活性化およびリンパ球と単球の種々のサブセットの数の定量化のための下流のアッセイは、だけでなく、良い品質（生細胞、シングレット）が、細胞の十分な数が必要です。

腎臓における免疫系は、適応および先天性成分および複数の細胞型1,7,13両方から構成されています。例えば、マウスで2子供（1.4×10 6細胞）およびこれらの約5から15までパーセント（1,400-4,200）単離された全腎、免疫細胞のneysが一緒に百分の2から17を含むことが報告されている（28,000-266,000）CD45 +細胞は、CD4 +細胞の1です、5,12。これらのCD4 +細胞の小さな割合（百分の5から15まで、70から630までは）のFoxP3 +細胞（ 図1）1です。細胞の割合におけるこれらの段階的減少、関心の時には細胞集団（この場合、CD45 + CD4 + FoxP3の+細胞）への単なる〜100セルで表現されます。 CD45 + CD4 + FoxP3の+細胞の数が少ないことが不可欠総細胞の大多数が分離され、細胞は、サイトカイン分泌アッセイのような下流の研究のために良い品質のものであることになります。また、亜集団を定量化アッセイを実行するために十分に高い数値で表現されていないので、2-3匹のマウスから腎臓を組み合わせることが必要であり得ます。したがって、腎臓単核細胞集団の信頼性の高い効率的な分離は、スタッドのために望ましいですyの腎疾患に関連する免疫学的なスペクトル。

伝統的に、腎臓の単核細胞の単離のために、研究者らは、このようなDNアーゼ1 1,5,12を含むコラゲナーゼ1AまたはIIなどの酵素消化の様々なを使用していました。よくコラゲナーゼが最適濃度およびインキュベーション4,14,15の期間滴定を必要と、ロット番号とし、製造会社によって異なる酵素活性を有することが知られています。また、コラゲナーゼで消化が小片に腎臓を刻むための時間を追加し、反応を停止させるためのEDTA中でのインキュベーションのための加熱（37℃）バス、追加の時間で腎臓片のインキュベーションを必要とします。また、以下無菌性は、細胞培養を必要とするいくつかの下流の処置のために達成することができます。さらに重要なことは、関係する研究者と、すべての変数に応じて、それは研究室間のデータと解釈のばらつきにつながります。最近では、と機械的組織撹乱/ホモジナイザー16の開発は、コラゲナーゼ消化工程を完全に回避し、腎臓2 ​​の単純な機械的破壊によって置き換えられています。ここで、私たちは日常の免疫細胞の抽出のための腎臓の免疫細胞の単離のためのシンプルで効率的な方法を示しています。重要なことに、この技術は、肝臓および脳16のような他のソフト非線維組織に適合させることができます。

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プロトコル

実行されたすべてのプロトコルステップは、ミズーリ大学の動物実験委員会（ACUC）によってレビューされ、承認されました。任意の年齢で、理論的に任意の齧歯類は、実験のために使用することができるが、このプロトコルのために、15週齢の雄のC57BL / 6マウスを使用しました。これは、非生存手術であるため、安楽死は、放血および両側気胸により達成されます。

腎臓の1灌流

注：例えば、心臓、肝臓や腎臓などの臓器の灌流は、データの解釈を妨げる可能性が血液を除去します。したがって、可能であれば我々は常に臓器を灌流。

  1. それは不動であるまで、イソフルラン（3 ml /分）誘導チャンバー内にマウスを置きます。次に、チャンバーの外にマウスを削除解剖台に背側にそれを置き、マウスの鼻の上にイソフルランコーンを置き、レギュレータを介して、1.5ミリリットル/分の速度でイソフルランを押してください。
  2. つま先のピンチRESPONSをチェック動物が麻酔の外科的平面を達成しているかどうかを評価するためにピンセットで電子。生理食塩水で腹側腹部をきれいにし、はさみで腹部を切開し、マウスの左側に（手術野のうち）腹部臓器を押してください。
  3. 1ccのシリンジに25ゲージの針を固定と下大静脈から血液を採取し、0.5M EDTA10μlのを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに追加します。
    注：血のコレクションはオプションです。プラズマは、生化学的測定のために使用することができます。白血球は、フローサイトメトリー分析のために使用することができます。
  4. はさみを使用して、次のステップから血液とPBSの混合物を外に出すために、右心房に小さなカットをします。
  5. 50 ccのシリンジを取り、氷冷PBS（20-30 CC）で満たします。次に、（鉗子の間で静かに心を保持している間）にその頂点に左心室を穿刺、注射器に21-25 Gの針を取り付け、ゆっくりかけてリン酸緩衝生理食塩水のpHが7.4（PBS）で左心室を灌流1-2分の。
    注：心はすぐに灌流の最初の数ミリリットルの際に白く。これは灌流が大静脈を介して静脈還流を経由して肝臓から血液を排出していることを示すように、ブランチングのために肝臓を守ってください。また、これは右心室の穿刺を示しているように、肺は注入の間に拡大されていないことを確認してください。肺が拡大した場合、少し戻って左心室に針を撤回し、灌流を続けます。安楽死が達成されるまで、最初の切開部から採取された時間が2分未満であります

腎臓の2.解剖

  1. 潅流が完了すると、その添付ファイル（血管、脂肪および副腎）と消費税から右の腎臓を解剖するためにハサミやピンセットを使用しています。
  2. 静かに切断し、鉗子で解剖することによって、腎臓をカバーするカプセルを削除します。腎臓を計量。
    注：腎臓を計量することは任意です。しかし、いくつかの実験組織のグラムあたりの細胞収量を正規化するために使用され得る腎臓サイズ/重量の変化をもたらすことができます。
  3. 腎臓を計量した後、0.5％FBSを含むRPMI-1640の1ミリリットルに置くか、染色緩衝液サイトメトリー（50mlコニカルスクリューキャップチューブ）を流れ、さらに使用するまでチューブを氷上に置きます。
    注：説明を簡単にするために、我々は、フローサイトメトリー染色緩衝液中の免疫細胞の単離の残りの部分について説明します。両方の腎臓または腎臓の1 + 1/3 回目は、下流の実験（オプション）に応じて使用することができるが、また、我々は、単一の腎臓からの免疫細胞の単離を記載します。腎臓の1/3は、タンパク質/ RNA実験のために凍結することができ、および1/3は、免疫組織化学または透過型電子顕微鏡用バッファに配置することができます。

腎臓の3均質化

  1. サンプル識別情報を5-80 mLの容量の均質化バッグを標識内部のストレーナー（STR）を削除し、それを捨てます。氷冷フローサイトメトリー染色緩衝液5mlで袋を記入し、バッファに腎臓を転送します。第二のサンプルや処理を必要とするより多くのサンプルについて、この手順を繰り返します。
  2. 半分はフローサイトメトリー染色緩衝液中に沈め腎臓を持っており、残りの半分は、単にその上に折り畳まれるように、半分に均質化バッグを折りたたみます。
  3. 組織ホモジナイザーをオンにして、高速（設定）回転数に設定します。下端に近いパドルを、直面している腎臓と折り畳まれた均質化バッグを置きますが袋の下端がパドルの下縁の下にスライドされていないことを確認してください。
    1. 2パドルがあるとして同時に第二のサンプルを処理します。 120秒のような時間を選択します。パドルを守って腎臓を均質化するために、前後に移動します。
      注：なお、この停止時間は、最初の2つの処理され、一方2以上の腎臓（または他の組織）の試料を調製するために使用することができます。
    2. 均質化の最初のセットで完了した後、氷に荷物を転送し、その次のサンプルのセットとして組織ホモジナイザーをリロードします。視覚的に腎臓が十分に均質化しており、何の大きな塊が表示されていないことを確認してください。
      注意：一般的に、高速回転で組織ホモジナイザーで2分間は、腎臓のために十分です。
    3. 氷上で50ミリリットルコニカルチューブに100μmのセルストレーナーを配置します。次に、セルストレーナーに完全にホモジネートをピペット。 4℃で1分間、50×gで床遠心分離機を設定し、遠心分離機にサンプルをロードします。
      注：遠心分離は（細胞を含む）すべてのホモジネートは、セルストレーナーを通過したことを保証します。
    4. 遠心機からチューブを外し、氷上に戻って置きます。セルストレーナーを破棄し、ホモジネートを保ちます。均一な細胞懸濁液を作製するために細胞ペレット/上澄みピペットまでに数回上下1×RBC溶解緩衝液の等容量（〜6ml）に加えます。 VisuaLLY、すぐにサスペンションの減少に赤色のいくつかを観察します。最大RBC溶解を達成するために、5分間氷上でチューブを残します。
      注：治験責任医師は、腎臓灌流および少ない細胞操作が望まれるの確信している場合、RBC溶解工程を省略することができます。我々は、RBC溶解細胞懸濁液を施していないことにより、腎細胞収量の有意な増加を観察しました。
    5. 細胞ペレットを形成するために、5分間500×gで、4℃に設定した遠心分離機でチューブをスピン。
      注：ステップ3.6と3.7の間に、コロイダルシリカ（パーコール）ベースの密度勾配遠心分離のために準備します。
      1. 底ポリプロピレンチューブラウンド10ミリリットルを取り、対応するサンプル番号とラベルを付け、チューブのラックに配置します。
        注：以下は、4腎臓サンプルのために十分な密度勾配試薬を作成する方法について説明します。
      2. フローサイトメトリー染色緩衝液の7ミリリットルを取り、15ミリリットルコニカルチューブにそれをピペット。に2 Mショ糖の1ミリリットルを追加します。0.25 Mショ糖を準備します。
      3. 次に、別の15ミリリットルコニカルチューブに密度勾配試薬およびピペットそれの7.2ミリリットルを取ります。 72％の密度勾配試薬および0.25 Mショ糖を準備するためにフローサイトメトリー染色緩衝液および2の1.25ミリリットルMショ糖の1.55ミリリットルを追加します。
      4. ピペット各サンプルに対して1つの丸底ポリプロピレンチューブに72％の密度勾配試薬を1ml。

    4.勾配遠心

    1. ステップ3.7の後、チューブを取り出し、軽く1滑らかな動きで上清をデカントし、また管を逆さまに保持されている間に形成する液体の横にあるドロップをデカント。
      注：このステップは、利回りの変動を作成するのに十分な密度勾配を変更することができ、過剰の液体を残して以来、重要です。チューブは直立バック設定されている場合は、〜液体の200から300μlを細胞ペレットに残っています。
    2. ピペットと穏やかに、しかし積極的に細胞ペレット上に0.25 Mショ糖の1ミリリットルアップピペットとブリンまでグラム均一な懸濁液への細胞。次に、再び36％の密度勾配試薬を形成するために、細胞を混合し、激しくピペット1mlに72％の密度勾配試薬（3.7.4）を細胞懸濁液を追加し。
    3. ポリプロピレンパスツール（転送）ピペット内に72％の密度勾配試薬の1ミリリットルを取ります。電球にさえ圧力で（先端に液柱を保持し、気泡形成を防ぐ）、静かに細胞懸濁液（36％の密度勾配試薬）の底にパスツールピペットを挿入し、形成するために、72％の密度勾配試薬をアンロード個別の重い層。
    4. 静かにサンプルチューブを選択し、このステップの室温で遠心分離、に置きます。 500×gで20〜30分間スピン。
    5. 一方、対応するサンプル識別子を持つ底遠心チューブラウンドポリプロピレンの別の2セットを準備します。
    6. ステップ4.4が完了した後、最小限に振盪しながら、優しくポリプロピレンチューブを含むサンプルを削除し、それを下に設定管ラックに。
    7. 最初のサンプル管とそれに対応する空のチューブを拾います。ポリプロピレンパスツールピペットで、穏やかに、しかし完全に測定吸引、上部の「ジャンク層」または「ネバネバ物質」を削除し、空の丸底遠心管に入れて。
      1. （赤み[赤血球]でオフホワイト表示さ​​れる場合があります）に到達する「バフィーコート」までの勾配の上部を取り外す進みます。 〜3mmの高さは「バフィーコート」から到達した場合吸引を停止します。
        注：吸引に進む前に、勾配の上部からこのようなものが完全になくなっていることを確認してください。
    8. 新鮮なパスツールピペット、新鮮な丸底遠心管を取り、静かにバフィーコートを除去します。細胞のほとんどを回収し、適切なサンプル識別子を持つ2 番目の新しい丸底チューブに添加されていることを確認するために、軟膜下の5ミリメートル- 3を吸引し続けます。
    9. Oミリリットル1-2を追加します。2 番目のチューブにフローサイトメトリー染色緩衝液fおよびピペッティングにより完全に混和します。
    10. 4℃で5分間、500×gで細胞をスピンダウン。フローサイトメトリー染色緩衝液で2 回目の洗浄ステップはオプションです。フローサイトメトリー染色緩衝液500μlの中に再懸濁し、血球計数器を用いて細胞数を計測するに進みます。

    5.オプション（細胞標識）

    1. 同数の細胞のための各サンプルAliqout。 10 6個の細胞あたり0.5μgの（抗CD16 / CD32のFcR）の希釈で遮断抗体を加え、15分間氷上でインキュベートします。
    2. 前の実際の実験に、研究者がお互いにうまく動作するように決定された一次抗体（適切なフルオロフォアにコンジュゲート）の所望のカクテルを追加します。氷上で30分間インキュベートします。 PBSで細胞を洗浄。
      注：この原稿のための腎臓の免疫細胞標識のデモンストレーションのために、我々はT-LYを使用しましたmphocyteおよびマクロファージ/樹状細胞パネル。 BV421、アンチのFoxp3（クローン：FJK-16）APC、抗CD127（クローン：A7R34）：Tリンパ球パネルは修正可能生存率ステインFVS510、抗CD45（30-F11クローン）から構成されていたPE / Cy7の、抗CD44（クローン：IM7）PerCPを/のCy5.5、抗CD4（クローン：RM4-5）APC-Cy7を、抗CD8（クローン：53-6.7）BV785。 BV421、アンチLy6G（クローン：1A8）FITC、抗CD11b（クローン：M1 / 70）PerCPを-のCy5.5、アンチ：マクロファージパネルは修正可能生存率ステインFVS510、抗CD45（30-F11クローン）から構成されていましたF4 / 80（クローン：BM8）APC、抗CD11cの（クローン：N418）BV785。
    3. 修正可能生存率ステインを追加し、5分間のベンチトップに残します。修正可能生存率ステインの過剰を除去するために、フローサイトメトリー染色緩衝液で細胞を洗浄。
    4. 固定/透過化試薬を追加し、4ºCで一晩インキュベートします。透過性の溶液中で洗浄します。
    5. 細胞内染色のために、10分間抗CD16 / 32のFcRと再びブロック。細胞内の汚れを追加し、20〜30分間インキュベートします。 PEでウォッシュ2倍rmeabilizationソリューション。
    6. FACS装置3,9を介して、フローサイトメトリー染色緩衝液および実行サンプル中の再懸濁。

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結果

実行することができるパネルの数は確実に腎臓から抽出することができる免疫細胞の数に依存します。ここで、我々は2パネル、Tリンパ球用とマクロファージ/樹状細胞のための1つを実行する能力を示します。 Tリンパ球のパネルでは、まず、前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）のパターンを見て、 図1（左上のドットプロット）に示すように、関心の人口を描きます。次に、生存能力マーカーは、この場合、定着生存染色（FVS510）が解析（ 図1、上部中央のドットプロット）から死細胞を除外するために使用されます。 CD45、骨髄由来の造血細胞のマーカーは、典型的には、腎臓、免疫細胞の輪郭を描くために使用され、これらは、典型的には、年齢、性別、歪みに応じて、総腎免疫細胞2-18％の範囲で、マウスの炎症状態（ 図1、右上のドットプロット）。 CD45 +から SUP>骨髄は1ゲートTリンパ球のマーカーとしてCD3イプシロンのいずれかで、造血細胞をすること...

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ディスカッション

ここで信頼性の高い効率的な方法で腎臓から免疫細胞を得るための方法を提示しています。広く使用されているコラゲナーゼ消化工程（組織の機械的破壊）の主要な変更は約30分を保存し、実行可能な免疫細胞の多数の単離は4腎臓試料で2時間の下でかかります。また、私たちの研究の質問に応じて、我々は今だけ私たちの免疫細胞の単離のために（他の腎臓は、ウェスタンブロット、免疫組織化学およびPCRによるmRNAの解析によってタンパク質分析のために使用することができます）、単一の腎臓を使用し、日常〜2×10 6個の細胞を得ます分離あたり。我々は（データは示さず、機械的破壊と組み合わせた心臓のための多酵素消化）は、肝臓と心臓から免疫細胞を大量に分離するために、このメソッドを使用するが、機械的破壊のような他の非線維性組織に適用することができると確信しているしています脳16。

任意のプロトコルと同様であるします組織から免疫細胞をオラート、細部に付着することは成功のために重要です。腎臓の灌流が重要な場合、その後の練習はフィブリルから、または右心室にすぎ...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

この作業は、Dialysis Clinics Inc.およびUniversity of Missouri Research Board Grantからの研究助成金によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Stomacher 80 Biomaster ラボシステムSeward
Stomacher 80 Classic bagsSewardBA6040/STR
Sorvall Legend XFR CentrifugeThermo Scientificまたは同等の機器 
血球計算盤電子顕微鏡 Sciences63514-11
分析フローサイトメーターBD LSR-X20 Fortessa
Percoll シグマP1644
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 1x (DPBS)Gibco, Life Technologies14190-250
ポリプロピレンチューブ、キャップなしベクトン・ディキンソン352002
固定可能な生存率染色BD Biosciences FVS510,  564406
抗CD16/32 (クローン:93)EBioscience14-0161
anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 BD Pharmingen103133/4
Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APCEBioscience17-5773
Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7Biolegend135013/4
anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5Biolegend103031/2
anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7Biolegend100413/4
anti-CD8 (Clone: 53-6.7)BV785Biolegend100749/50
Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITCBiolegend127605/6
Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5Biolegend101227/8
Anti-F4/80 (Clone: BM8) APCBiolegend123115/6
Anti-CD11c (Clone: N418) BV785Biolegend117335/6
Anti-CD301 (Clone: LOM-14)PE-Cy7バイオレジェンド145705/6
抗CD26 (クローン:H194-112) PEバイオレジェンド137803/4
100 μmフィルター フィッシャーサイエンティフィック22363548
フィッシャーブランドチューブ 50 mlフィッシャーまたは同等の機器 
フィッシャーブランドチューブ15mlフィッシャーまたは同等の機器 
ショ糖フィッシャーケミカルS5-3
トランスファーピペットファインチップSamco Scientific232または同等の機器 
Flow Cytometery Staining Buffer SolutionEBioscience00-4222-26または同等の機器 
1x RBC Lysis BufferEBioscience00-4333-57または同等の機器 

参考文献

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