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方法論記事

再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学

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DOI：

10.3791/54371

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2016年9月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

この記事について

サマリー

ここでは、遺伝子欠失効率を改善するためのYarrowia lipolytica Po1g株の分子遺伝学的操作に関する方法を報告します。結果として得られた遺伝子組み換えY.リポリティカ株は、バイオ燃料および生化学生産への潜在的な応用が期待されています。

要約

ヤロウィアリポリティカは 、非病原性の二形性と厳密に好気性の酵母種です。その独特の生理機能や代謝の特性により、この型破りな酵母は真菌の分化の基本的な性質の研究のための良好なモデルだけではありませんが、また、生化学的生産と大規模な遺伝子操作を必要とする様々な生物工学的適用のための有望な微生物のプラットフォームです。 Y.のが、遺伝子操作リポリティカは 、主KU70遺伝子に起因することができ、効率的かつ安定的な遺伝的形質転換システムの欠如ならびに非相同組換えの非常に高い割合に限定されています。ここでは、効率的な遺伝的形質転換のためにとYにおける遺伝子欠失のための簡単かつ迅速なプロトコルを報告しますリポリティカ Po1g。 Y.への外因性DNAの効率的な形質転換のためにまず、プロトコルリポリティカ Po1gを確立しました。セコndは、標的遺伝子のさらなる削除のために強化された二重交差相同組換え率を達成するために、KU70遺伝子は、1kbの相同性ア ​​ームを担持破壊カセットを形質転換することにより削除されました。第三に、KU70遺伝子の欠失後の増強遺伝子欠失の効果を実証するために、我々は、個別にKU70ノックアウトプラットフォーム株に同じ手順を使用して、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルコールオキシダーゼをコードする11標的遺伝子を削除しました。これは、正確な相同組換えの割合が削除のために0.5％未満の実質的に増加することが観察されました Po1g KU70Δで11標的遺伝子の単一遺伝子欠失のための33％-71％にPo1gでKU70遺伝子の。ハイグロマイシンB耐性マーカーを有する複製プラスミドとのCre / loxPシステムを構築し、酵母ノックアウト株における選択マーカー遺伝子は、最終的にタージェ複数回のを容易にするために、Creリコンビナーゼの発現により除去しましたテッド遺伝子操作。得られた単一遺伝子欠失変異体は、バイオ燃料および生化学的生産において潜在的な用途を有します。

概要

サッカロマイセス・セレビシエ 、 ヤロウィアリポリティカ、型にはまらない酵母とは異なり、環境条件1,2の変化に応じて、酵母または菌糸体の形で成長することができます。したがって、この二形酵母は真菌の分化、形態形成および分類3,4,5の研究のための良いモデルとして使用することができます。一般に広く、有機酸、ポリアルコール、芳香化合物、乳化剤及び界面活性剤-6,7,8,9-などの食品添加物の多様を生成するために使用される安全な（GRAS）酵母種とし ​​て見なされます。これは絶対好気性自然細胞乾燥重量10の70％まで、多量、 すなわちに脂質を蓄積することができる周知の油性酵母です。また、栄養素11,12,13として廃資源における残基の異なる種類を含む、成長のための炭素源の広いスペクトルを利用することができます。これらのユニークな機能のすべてがYを作ります以下のための非常に魅力的リポリティカ様々なバイオテクノロジー用途。

Yの全ゲノム配列が、 リポリティカが 14,15を公開されている、この型破りな酵母の遺伝子操作は、他の酵母種よりも複雑です。まず、この酵母種の変換は、それほど効率的により安定的かつ効率的な形質転換系16,17が存在しないことです。全く自然なエピソームプラスミドシステムは、この酵母18で発見されていないように、第2の線形発現カセットの面倒なゲノム組み込みは、一般に、目的の遺伝子の発現のために使用されます。この酵母で正確な相同組換えを介して効率遺伝子ターゲッティングが低く、ほとんどの統合イベントは非相同末端結合（NHEJ）19を介して発生するため、遺伝的ノックアウトおよびノックインの第三に、世代が制限されています。

本研究では、Yのための最適化された形質転換プロトコルを報告しますリポリティカ の、簡単迅速、効率的かつ再現性のあるPo1g株。正確な相同組換えの頻度を高めるために、我々は、NHEJ経路における重要な酵素をコードするKU70遺伝子を削除しました。最適化された形質転換プロトコルを用いて、1キロバイト、Y.のKU70遺伝子のフランキング相同領域を含む直鎖ノックアウトカセットを形質転換することによってリポリティカ Po1gは正常に削除されました。この遺伝子の欠失方法のロバスト性は、その後Po1g KU70Δ株において、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルコールオキシダーゼ遺伝子を標的にすることによって実証されました。これは、KU70欠損株は、野生型Po1g株よりも標的相同組換えを介した遺伝子のかなり高い効率を示すことが観察されました。また、ハイグロマイシンB耐性マーカーを保有する複製Cre発現プラスミドは、マーカーレスキューを実行するように構築しました。マーカーレスキューは番目に遺伝子標的の複数のラウンドを容易にEは、遺伝子欠失突然変異体を得ました。遺伝子欠失に加えて、ここに記載の遺伝的形質転換および遺伝子欠失のための我々のプロトコルは、特定の遺伝子座に遺伝子を挿入するために適用することができ、およびY.に部位特異的変異を導入することリポリティカゲノム 。

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プロトコル

Yの1世代KU70欠失株リポリティカ

  1. 破壊カセットの構築
    注：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅に使用されるすべてのプライマーは、 表1を参照のこと。
    1. LEU2発現カセットをPCR増幅するために設計プライマー20は、Yから（ 表1参照します） リポリティカ（lipolytica）発現ベクターおよび長いフォワードプライマー（＃1、 表1）を用いてLEU2カセットの5 'および3'末端にLoxP部位を導入し、それぞれ、長逆方向プライマー（ 表1＃2）。クローニングプロセスの後続のステップのために追加の制限部位を導入するために、プライマー＃1におけるBamHI制限部位を加えます。
    2. 表2に詳述するように、高忠実度DNAポリメラーゼを用いてPCRを行います。
    3. PCR purificatioを使用して、PCR産物のLoxP-プロモーター-LEU2-ターミネーターのLoxPカセットを精製製造元の指示に従って、n個のキット。製造業者の説明書21に記載の精製されたPCR産物に3'-Aオーバーハングを加えます。 表3の通りプラスミドT-LEU2を得るためのTAクローニングベクターにAテールPCR産物を連結するために使用T4 DNAリガーゼ。
    4. PCRは、Yからプライマー＃3 /＃4を使用してKU70遺伝子の1キロバイトの5 '上流配列を増幅しますリポリティカ Po1g 表2に従って、ゲノムDNA 22は、製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いてPCR産物を精製します。
      1. ダブル。 表4のとおりのSacIIおよびBam HI酵素で精製したPCR産物とT-LEU2プラスミドの両方を消化し ​​、製造元の説明書に従ってPCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。精製を連結するためにT4 DNAリガーゼを使用して、 サック IIにPCR産物を消化/ T-LEU2ののBamHI部位を生成しますプラスミドT-LEU2-5E 表3のとおり。
    5. PCRは、Yからのプライマーを＃5 /＃6を使用してKU70遺伝子の1キロバイトの3 '下流配列を増幅しますリポリティカ Po1g 表2に従って、ゲノムDNA 22は、製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いてPCR産物を精製します。ダブル精製したPCR産物と表4のとおりのNot Iおよびんで酵素とT-LEU2-5Eプラスミドの両方を消化。
      1. 製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。その後、精製を結紮およびNot I / んで 表3に従ってT4 DNAリガーゼを用いてプラスミドT-KOを生成するT-LEU2-5EのI部位にPCR産物を消化し ​​ました。
    6. 破壊カセットを生成するために、表4のとおりのSacIIおよびんで I酵素によるプラスミドのT-KOダイジェスト（ 図1 ）。製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いて消化したDNA断片を精製します。
  2. コンピテントセルの調製およびYの変換Po1g株リポリティカ
    1. コンピテント細胞調製
      1. Yのコロニーを植菌YPD培地10ml（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％デキストロースおよび50mMのクエン酸緩衝液pH 4.0）を100mlフラスコ中で、新鮮な酵母抽出物-ペプトン-デキストロース（YPD）プレートからリポリティカ Po1g株。飽和するまで20時間（分光光度計を用いて測定し、OD約15の600）を225 rpmで30℃の振盪インキュベーター中でインキュベートします。
      2. 室温で5000×gで5分間遠心して細胞をペレット化。 20ミリリットルのTris-EDTA（TE）緩衝液（10mMのTris、1mMのEDTA、pH7.5）で細胞を洗浄し、ステップ1.2.1.2で説明したように、細胞をペレット。 （酢酸で調節してpH 6.0）を1mlの0.1M酢酸リチウム中で細胞を再懸濁し、そして室テンペで10分間インキュベートrature。
      3. 滅菌1.5ミリリットルチューブにテント細胞（100μl）を等分。直下変換ステップに進む、または長期保存のために-80℃で、最終濃度25％（v / v）を、店舗にグリセロールを加えます。
    2. 変換
      1. 穏やかにコンピテント細胞100μlと共に変性サケ精子DNA（10 mg / mlで）、精製破壊カセット1-5μgの10μLを混合し、15分間30℃でインキュベートします。
      2. （0.1 M酢酸リチウム液pH 6.0に溶解した）40％ポリエチレングリコール（PEG）-4000の700μl加え、よく混ぜ、60分間225rpmで30℃の振盪インキュベーター中でインキュベートします。
        注：（典型的には、従来の酵母の形質転換に使用される）の代わりにPEG-3350の、4000の平均分子量を有するPEGを使用することが重要です。
      3. 熱は、60分間39℃の水浴中に管を配置することによって、形質転換混合物に衝撃を与えます。
      4. 1ミリリットルをYPD培地を追加し、30°Cおよび225 rpmで2時間回復。室温で1分間、9000×gで遠心し、上清を除去し、TE緩衝液1mlでペレットを再懸濁します。
      5. 室温で1分間9000×gの遠心分離により細胞をRepelletし、上清を捨てます。 100μlのTE緩衝液にペレットを再懸濁し、選択プレート（ 例えば 、ロイシン欠乏プレート）上にプレートし、2〜3日間30℃でインキュベートします。
      6. 4〜10の単一コロニーを選択し、YPD培地2mlに別々に接種します。 225 rpmで30℃の振盪インキュベーター中で一晩インキュベートします。それぞれのプライマー＃55 /＃56、及び＃56 /＃57、の2セットを用いて、 表5のとおり形質転換体22からのゲノムDNAのPCR分析によって陽性コロニーを識別します。
        注：私は、直鎖状にpYLEX1ベクターがY.に変換されるわけではありません数をカウントすることにより形質転換効率を決定するためにPo1gテント細胞リポリティカμgのプラスミド当たりのコロニー形成単位（CFU）のDNAは、23を用います。

2.マーカーレスキュー

  1. Cre発現プラスミドの構築
    1. pYLEX1-CREとpYLEX1-HPHの構築
      1. デザインプライマー20は、CreおよびHPHのオープンリーディングフレームをPCR増幅します。フォワードプライマー＃82と＃84に開始コドンの上流の余分なアデニンヌクレオチドを追加し、PCRは、CREのオープンリーディングフレームを増幅するリバースプライマー＃83と＃85の中に終止コドンの下流のKpnI制限部位を挿入し、 表2のとおりpSH69（アクセッション番号HQ412578）24からHPH。
      2. CRE、製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを使用して、HPH断片の両方を精製します。 TABL通りのKpn I酵素で精製CREおよびHPH断片の両方を消化E 4。Pmlに基づくおよびKpnIでpYLEX1プラスミドは表4の通り酵素消化倍増。当たりの製造者の指示通りPCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。
      3. Y.のPmlに基づく I / KpnIのサイトに精製し、消化CREおよびHPH断片を連結するには、 表3の通り、T4 DNAリガーゼを使用します発現ベクターリポリティカ 、それぞれ、pYLEX1-CREとpYLEX1-HPHを得ました。
    2. pSL16-CRE-HPHの構築
      1. PCRは、プライマーに＃86を使用してpYLEX1-CREからのcreのプロモーター-遺伝子-ターミネーターカセットを増幅/＃87、表2のとおりのSal I / PstIの制限部位に隣接する。メーカーの指示に従って、PCR精製キットを用いてPCR産物を精製。
        1. 精製したPCR産物およびSal IでpSL16-CEN1-1（227）プラスミド25の両方をダブル消化し ​​、PST 表4に従って、I酵素は、製造業者の指示に従って、PCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。そして、 表3に従ってT4 DNAリガーゼを用いpSL16-CREを作成するために対応する部位にpSL16-CEN1-1（227）に精製し、消化し ​​たPCR産物を連結。
      2. PCRは、＃88 /＃89は、 表2の通りのXho I / のBglII制限部位に隣接するプライマーを用いてpYLEX1-HPHからHPHのプロモーター-遺伝子-ターミネーターカセットを増幅する。製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いてPCR産物を精製します。
        1. ダブル。精製されたPCR産物および表4のとおりのXho IおよびBgl II酵素とpSL16-CREプラスミドの両方を消化し ​​、製造元の説明書に従ってPCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。次に、対応するでpSL16-CREに精製し、消化したPCR産物を連結サイトは、 表3に従ってT4 DNAリガーゼを用いpSL16-CRE-HPHを生成します。
          注：結果のCre発現プラスミド、pSL16-CRE-HPHは、選択可能なハイグロマイシンBのマーカーを保有し、セントロメアおよびエピソーム的に複製するベクター（ 図2）です。
      3. 表4の通り（ベクターからの挿入を切り出すために、 例えば 、 サル I / PstIの ）適切な制限酵素で消化することにより全ての構築物を確認してください。
  2. Creリコンビナーゼ媒介マーカーレスキュー
    1. 上記のセクション1.2に記載の形質転換プロトコルに従ってKU70ノックアウト株のコンピテント細胞にpSL16-CRE-HPHを変換します。プレートは、YPDプラスハイグロマイシンB上に細胞（YPDH）プレート（400 / mlのハイグロマイシンBを含む）に形質転換し、2〜3日間30℃でインキュベートします。
    2. 正識別するためのプライマー＃84 /＃85を用いて、 表5の通りコロニーPCRを行います変換後のpSL16-CRE-HPHプラスミドを含むコロニー。
      注：フォワードプライマー＃84およびリバースプライマー＃85は、hph遺伝子（ 表1）のコード領域の内側に配置されています。唯一の陽性クローンをPCR反応に特異的なPCR産物を生成します。
    3. 陽性クローンを選択し、YPDH培地2mlに接種し、飽和するまで一晩225rpmで30℃の振盪インキュベーター中でインキュベートします。分光光度計を用いて細胞のOD 600を測定します。 〜15のOD 600で細胞を回収します。室温で5分間、5000×gで遠心分離し、滅菌水2mlで1回洗浄。
    4. 初期OD 0.1の600でYPD培地2mlに細胞を再接種し、細胞が一晩225rpmで30℃の振盪インキュベーター中で成長することができます。単一コロニー23を分離するYPDプレート上にストリーク一晩細胞培養物。 YPD、YPDH、およびロイシン欠乏プレート23上にレプリカプレートコロニーアップ。
      注：両方のLEU2マーカーを失っているとpSL16-CRE-HPHプラスミドのみをYPDプレート（ 図3）上に成長させることができるコロニーを。

アルコール脱水素酵素およびアルコールオキシダーゼ遺伝子の3削除

  1. Y.で検索を実行します削除の26の遺伝子候補を同定するために基本的なローカル配列検索ツール（BLAST）を使用してリポリティカゲノムデータベース。入力Sのタンパク質配列BLAST検索ツールにセレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼIを（http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa）。
    注：BLAST検索ツールは、Yに最も類似したタンパク質配列を返しますリポリティカゲノムデータベース。
  2. ＃56へのプライマー＃7（ 表1）を用いたPCRによって削除カセットを構築し、上記のセクション1.1に記載したのと同じ方法を用いて、制限酵素消化およびライゲーション反応を行います。
  3. 予備校KU70ノックアウト株のコンピテントセルは、ある変換を行い、上記のセクション1.2に記載のプロトコルに従うことにより、＃81（ 表1）に＃55のプライマー、＃58で陽性コロニーを同定するためのPCRを実施します。
    注：例として、YALI0E17787g遺伝子欠失のための手順は、 図4及び5に記載されています。相同組換え率に1キロバイトおよび2キロバイト長い相同領域の効果が報告されています。

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結果

線形化Y.リポリティカ（lipolytica）発現ベクターは、Yのゲノム中のpBRドッキングプラットフォームに挿入し単一交差組換え27を行うことにより、 リポリティカ Po1g株。本研究で確立された迅速な化学変換の手順を使用して、線形化Y.リポリティカ（lipolytica）発現ベクターは、正常> 100 CFU /μgのDNAの形質転換効率で野生型Po1g株に形質転換しました。 1キロバイトの相同配列によって隣接ノックアウトカセットは（ 図1）Po1g株に形質転換し、KU70遺伝子が正常に削除されました。ここでは、フォワードプライマー＃56は、KU70遺伝子の5 '相同性ア ​​ーム内に位置する配列にアニールします。リバースプライマー＃55は、LEU2マーカーのコード領域内に位置しています。リバースプライマー＃57は、KU70遺伝子のコー...

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ディスカッション

この研究のための私たちの目標は、Yに標的遺伝子ノックアウトの迅速かつ効率的な生成を可能にすることですPo1g株リポリティカ 。いくつかの考慮事項は、これを達成するために対処する必要があります。まず、高変換効率が必要です。したがって、Y.ための効率的で便利な化学的形質転換プロトコルリポリティカ Po1g株を本研究に記載されました。 PEG-4000を使用することは、この株の形質転換の成功のために重要な要素です。代わりにPEG-4000の（S.セレビシエの形質転換のために）PEG-3350を使用時に形質転換体は、プラスミド形質転換のために得られませんでした。また、新たに調製した細胞を用いてコンピテント細胞の調製は、この株において高い変換効率を得るために必要とされます。第二に、この株で優勢NHEJを介して非相同組換えおよびランダム組込み事象を減少させるために、効率的な形質転換法は、次にKU7を構築するために使用されました0ノックアウト変異体。第三に、相同組換えによる遺伝子置換の効率を向上させるために、長いフランキングア...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

私たちは感謝シンガポール（ETRP 1201102）の国家環境庁からの資金援助を認める、シンガポール国立研究財団（NRF-CRP5-2009-03）、シンガポールの科学技術研究庁の競争研究プログラム（ 1324004108）、グローバルR＆Dプロジェクトの計画、知識経済部、大韓民国（N0000677）、国防脅威削減局（DTRA、HDTRA1-13-1-0037）と合成生物学シンガポール国立大学のイニシアティブ（ DPRT / 943/9月14日）。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬/材料
オリゴヌクレオチドプライマー統合DNAテクノロジー25 nmole DNAオリゴ
Y. lipolytica株 Po1gYeastern Biotechロイシン補助栄養誘導体野生型株W29(ATCC 20460)
ベクターpYLEX1Yeastern BiotechFYY203-5MGY. lipolytica 発現ベクター
大腸菌 TOP10Invitrogenプラスミドのクローニングおよび増殖用
pGEM-T ベクター PromegaA3600TA クローニングベクター
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106プラスミド単離
用 ウィザード SV ゲルおよび
PCR クリーンアップシステム		PromegaA9282アガロースゲル
からDNA断片を抽出し、増幅反応からPCR産物を精製
iProof High-Fidelity
DNA ポリメラーゼ		Bio-Rad172-5302ハイフィデリティDNAポリメラーゼ
BamHI ニューイングランドバイオラボR0136S制限酵素
BglII New England BiolabsR0144L制限酵素
KpnINew England BiolabsR0142S制限酵素
NdeI ニューイングランドバイオラボR0111S制限酵素
NotIニューイングランドバイオラボR0189L制限酵素
PmlIニューイングランドバイオラボR0532S制限酵素
PstI ニューイングランドバイオラボR0140S制限酵素
SacIIニューイングランドバイオラボR0157S制限酵素
SalIニューイングランドバイオラボR0138S制限酵素
XhoIニューイングランドバイオラボR0146L制限酵素
T4DNAリガーゼニューイングランドバイオラボM0202LTaqDNA
ポリメラーゼ バイオ・ラッドM0267L
アンピシリンGibco-Life Technologies11593-027抗生物質
ハイグロマイシン BPAAP21-014抗生物質
GeneRuler 1 kb DNA ラダーThermo ScientificSM03121 kb DNA ラダー
PEG4000Sigma95904-F
TrisPromegaH5135
EDTABio-Rad161-0729
Salmon Sperm DNAInvitrogen15-632-011
酢酸リチウムΣ
酢酸Σ
ビーズ (425-600 & micro;m)SigmaG8772
RNAse AThermo ScientificEN0531
DNA ローディング色素Thermo ScientificR0611
バクト酵母抽出物BD212750
バクトペプトンBD211677
D-グルコース1st BaseBIO-1101
アミノ酸なしのYNBシグマY0626
DOサプリメント-LeuClontech630414
グリセロールシグマG5516
Difco LBブロスBD244620
Difco LB寒天BD244520
クト寒天BD214010
機器
PCRマシンBioradT100 サーマルサイクラー
ウォーターバスMemmertWNB 14
固定/振とうインキュベーターYihderLM-570RD
サーモシェーカーAllshengMS-100
マイクロ遠心分離機Eppendorf5424R
遠心分離機Eppendorf5810R
分光光度計エッペンドルフ バイオフォトメーターと
ゲルイメージャーGEAmersham Imager 600
ガラスバ

参考文献

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