再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学

Ai-Qun Yu; Nina Pratomo; Tee-Kheang Ng; Hua Ling; Han-Saem Cho; Susanna Su Jan Leong; Matthew Wook Chang

doi:10.3791/54371

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方法論記事

再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学

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DOI：

10.3791/54371

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2016年9月20日

Ai-Qun Yu¹^,² , Nina Pratomo¹^,² , Tee-Kheang Ng¹^,² , Hua Ling¹^,² , Han-Saem Cho¹^,² , Susanna Su Jan Leong¹^,²^,³ , Matthew Wook Chang¹^,²

¹Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, ²NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, ³Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

この記事について

サマリー

ここでは、遺伝子欠失効率を改善するためのYarrowia lipolytica Po1g株の分子遺伝学的操作に関する方法を報告します。結果として得られた遺伝子組み換えY.リポリティカ株は、バイオ燃料および生化学生産への潜在的な応用が期待されています。

要約

ヤロウィアリポリティカは 、非病原性の二形性と厳密に好気性の酵母種です。その独特の生理機能や代謝の特性により、この型破りな酵母は真菌の分化の基本的な性質の研究のための良好なモデルだけではありませんが、また、生化学的生産と大規模な遺伝子操作を必要とする様々な生物工学的適用のための有望な微生物のプラットフォームです。 Y.のが、遺伝子操作リポリティカは 、主KU70遺伝子に起因することができ、効率的かつ安定的な遺伝的形質転換システムの欠如ならびに非相同組換えの非常に高い割合に限定されています。ここでは、効率的な遺伝的形質転換のためにとYにおける遺伝子欠失のための簡単かつ迅速なプロトコルを報告しますリポリティカ Po1g。 Y.への外因性DNAの効率的な形質転換のためにまず、プロトコルリポリティカ Po1gを確立しました。セコndは、標的遺伝子のさらなる削除のために強化された二重交差相同組換え率を達成するために、KU70遺伝子は、1kbの相同性アームを担持破壊カセットを形質転換することにより削除されました。第三に、KU70遺伝子の欠失後の増強遺伝子欠失の効果を実証するために、我々は、個別にKU70ノックアウトプラットフォーム株に同じ手順を使用して、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルコールオキシダーゼをコードする11標的遺伝子を削除しました。これは、正確な相同組換えの割合が削除のために0.5％未満の実質的に増加することが観察されました Po1g KU70Δで11標的遺伝子の単一遺伝子欠失のための33％-71％にPo1gでKU70遺伝子の。ハイグロマイシンB耐性マーカーを有する複製プラスミドとのCre / loxPシステムを構築し、酵母ノックアウト株における選択マーカー遺伝子は、最終的にタージェ複数回のを容易にするために、Creリコンビナーゼの発現により除去しましたテッド遺伝子操作。得られた単一遺伝子欠失変異体は、バイオ燃料および生化学的生産において潜在的な用途を有します。

概要

サッカロマイセス・セレビシエ 、 ヤロウィアリポリティカ、型にはまらない酵母とは異なり、環境条件^1,2の変化に応じて、酵母または菌糸体の形で成長することができます。したがって、この二形酵母は真菌の分化、形態形成および分類^3,4,5の研究のための良いモデルとして使用することができます。一般に広く、有機酸、ポリアルコール、芳香化合物、乳化剤及び界面活性剤^-6,7,8,9-などの食品添加物の多様を生成するために使用される安全な（GRAS）酵母種として見なされます。これは絶対好気性自然細胞乾燥重量¹⁰の70％まで、多量、 すなわちに脂質を蓄積することができる周知の油性酵母です。また、栄養素^11,12,13として廃資源における残基の異なる種類を含む、成長のための炭素源の広いスペクトルを利用することができます。これらのユニークな機能のすべてがYを作ります以下のための非常に魅力的リポリティカ様々なバイオテクノロジー用途。

Yの全ゲノム配列が、 リポリティカが ^14,15を公開されている、この型破りな酵母の遺伝子操作は、他の酵母種よりも複雑です。まず、この酵母種の変換は、それほど効率的により安定的かつ効率的な形質転換系^....