タンデムアフィニティータグ法を用いた構造解析のためのネイティブ複合体の精製

Summary

タンデムアフィニティー精製法は、プロテオミクスのための細胞抽出物、主に真核生物から天然複合体を単離するために広く使用されてきました。ここでは、構造研究のための天然複合体の精製に最適化されたTAPメソッドプロトコールを紹介します。

Abstract

アフィニティー精製のアプローチはプロテオミクス特性評価用のネイティブ複合体を単離することに成功しています。構造的不均一性との複合体の組成不均一性の程度は、通常、このような研究を行うの進展が妨げられることはありません。これとは対照的に、構造的な特徴付けのために意図された複合体は、両方の組成と構造的に均質なだけでなく、プロテオミクスのために必要とされるよりも高い濃度である状態で、精製されるべきです。近年、大規模な高分子複合体の構造を決意する電子顕微鏡の応用において重要な進歩がありました。これは、電子顕微鏡による構造決意するのに十分な質と量のネイティブの複合体を精製するためのアプローチへの関心を高めています。タンデムアフィニティー精製（TAP）メソッドは18サブユニットを抽出し、精製するために最適化されている、〜出芽酵母から0.8 MDAリボアセンブリ（ サッカロマイセス・セレビシエ）

Introduction

多くの主要な細胞プロセスは、大きなタンパク質およびタンパク質-RNA複合体¹によって行われます。このような複合体の生物物理学的および構造的な研究を行うに重大なボトルネックは、適切な品質（ すなわち 、均一性）の、適切な濃度でそれらを得ることです。天然の供給源から複合体を分離することにより、サブユニットの関連する転写後および/または翻訳後修飾を保持し、適切な複雑なアセンブリを保証を含め、多くの利点があります。しかし、大規模な細胞複合体は、低コピー数で、多くの場合、細胞内に存在していると精製は非常に効率的で、複雑な整合性が維持されていることを確認するために近くの生理的条件下で発生する必要があります。真核生物源から複合体を精製することは特に困難であり、財政的に法外することができます。したがって、効率的でかつ均一な複合体をもたらす戦略または方法が非常に望まれています。

されている戦略彼らの初期の特性のために、真核細胞からの天然の複合体を精製することに成功は、タンデムアフィニティー精製（TAP）法^2,3です。 TAPの方法は、最初因子（複数可^）2相互作用との複合体で出芽酵母（S.セレビシエ）から天然のタンパク質を精製するために考案されました。 TAP法は、同じタンパク質をコードする遺伝子配列をタンデムに融合した各タグを二つのタグを利用しました。タイトかつ選択的な生理学的溶液条件の近くに....

Protocol

注：以下のプロトコルは、細胞培養の4 L、細胞の約40グラム湿重量から複合体を精製するために考案されました。調製したら、すべてのバッファは、4℃で保存し、それらの調製の月以内に使用すべきです。還元剤およびプロテアーゼ阻害剤は、使用直前に緩衝液に添加されます。

タンデムアフィニティー精製のための全細胞抽出物の調製

1. S.の成長セレビシエ細胞
   1. ストリーク希望TAPはS.をタグ付けしました。酵母ペプトンデキストロース（YPD）プレート上に貯蔵（-80℃）からセレビシエ株。酵母細胞は、白とふわふわ表示されるまで、5日間（30℃）で - 3インキュベートします。
   2. 50ミリリットルの円錐形ポリプロピレン遠心チューブに10ミリリットルYPD培地にプレートからの新鮮な細胞の約2ミリメートル²の連勝を接種します。毎分180回転（rpm）で一晩（C°30メートル）でチューブを振ります。
   3. オーバーの2ミリリットルを接種します2 Lの三角または三角フラスコ中のYPD培地1リットル当たりの夜の文化。毎分180回転（30℃）で振ります。 2に後期対数期、1.8のOD ₆₀₀まで、600 nmの（OD _600）の光学密度で細胞増殖を監視し、一般的に20から24時間。 <....

Results

修正されたTAP法はSから精製しましたU1 snRNP、18サブユニットリボ核タンパク質複合体をセレビシエ 。公開されたプロトコル^2,3次複合体の初期TAPの精製は、銀上の3つのバンドは、ネイティブポリアクリルアミドゲル（ 図2A）で染色として移行し、異機種登場複合体を得ました。 TAP法の最適化の複数のラウンドは、より均質なアセンブリ（ 図2A）を示す天然ゲル上で主に単一バンドとして移動錯体を得ました。タンパク質や核酸の両方を染色する蛍光色素を使用して、それを精製した複合体が存在し、両方の生体高分子（ 図2B）を有していたことが立証されました。

精製された複合体は、また、TAPタグ抗体（ 図3A）を用いたSDS PAGEおよび.......

Discussion

TAP法はタイトで、生理的溶液条件の近くに維持する欲求と親和性樹脂への結合選択性の必要性のバランスをとる二つのタグを利用しています。このバランスは、精製後の特徴付けのための因子（単数または複数）の相互作用でタグ付けされたタンパク質の安定な相互作用（複数可）を維持するのに役立ちます。また、個々のTAPは1つが、任意の酵母複合体のためにタグ付けされたタンパク質と任意の酵母株を得ることができるようにするORFは、商業的供給源から入手可能であるタグ付けされました。複合体の完全性および精製のための複雑で異なるタグ付きタンパク質サブユニットの使用をテストするために、リソースの可用性を維持することが本来の複合体を精製するためのTAP法を利用するための2つの利点があります。しかし、元のTAP法プロトコルは、精製された複合体は、組成と構造的に均質であることを確実にするために考案されませんでした。この目標を達成するために、上記で詳述したようTAP法は、したがって、変更されています。

さまざまなTAPの方法の工程は、組成と構造的に均質な複合体を精製するための最適なアプローチと条件を確立するために評価し.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. cerevisiae TAPタグ付き株	Open Biosystems	YSC1177	これは、TAPプロトコルの開発に使用された主要な酵母株です。その背景はS288Cです:ATCC 201388:MATa、his3Δ1、leu2Δ0、met15&デルタ;0、ura3&デルタ;0, SNU71::TAP::HIS3MX6
コーヒーグラインダー	Mr. Coffee	IDS77	細胞溶解
血球計算盤に使用, Bright Line	Hausser Scientific	3120	細胞溶解の評価に使用
JA 9.100 遠心分離機ローター	ベックマン・コールター		酵母細胞
JA 20固定角遠心分離機ローター	ベックマン・コールター社		不溶性細胞材料
Ti 60固定角遠心分離ローター	ベックマン・コールター社		可溶性細胞抽出物をさらに透明化するために使用されます
サーモミキサー	エッペンドルフ	R5355	温度制御シェーカー
Novexゲルシステム	サーモフィッシャーサイエンティフィック
IgG樹脂	GE Healthcare	17-0969-01	セファロース6 高速流
カルモジュリン樹脂	Agilent Technologies, Inc.	214303	アフィニティ樹脂
プロテアーゼ阻害剤カクテル、ミニ錠	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets
プロテアーゼ阻害剤カクテル、大粒錠	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra EDTA-free tablets
フェニルメタンスルホニルフッ化物 (PMSF)			イソプロパノール
2 ml Bio-spin カラム	Bio-Rad に溶解株式会社ラボラトリーズ	7326008	Calmodulin レジン
10 ml ポリプレップカラム	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	IgG樹脂の包装と洗浄に使用されます
プレキャストネイティブPAGE Bis-Trisゲル	Life Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% プレキャストポリアクリルアミドゲル
NativeMarkタンパク質標準	サーモフィッシャーサイエンティフィック	LC0725	ネイティブPAGEに使用される未染色タンパク質標準。ロード 7.5 μ銀染色ゲルの場合はl、5μl SYPRO Ruby染色ゲル用
プレキャストSDS PAGE Bis-Trisゲル	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% プレキャストポリアクリルアミドゲル
PageRuler タンパク質標準品	サーモフィッシャーサイエンティフィック	26614	ウェスタンブロッティング SDS ランニングバッファーに使用した未染色タンパク質標準品
	ライフテクノロジー	ズ NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS
BUFFER TAP ANTIBODY	サーモフィッシャーサイエンティフィック	CAB1001	CBP タグに対する一次抗体
二次抗体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31341	ヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ結合
BCIP/NBT	サーモフィッシャーサイエンティフィック	34042	5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸/ニトロブルーテトラゾリウム
透析ユニット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	88401	Slide-A-Lyzer ミニ透析ユニット
遠心フィルターユニット、100kDa MWCO	EMD ミリポア	UFC5100008	Amicon Ultra-0.5 遠心フィルターユニット、Ultracel-100メン
ブレン 界面活性剤吸収ビーズ	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	バイオビーズ SM-2 吸収剤
SYBR Green II	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S-7564	核酸染色用の蛍光色素は、SYPRO Rubyの存在で検出する場合は、励起波長488 nm、発光波長532 nm
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S-12000	蛋白質染色用の蛍光色素は、SYBR Green IIの存在で検出する場合、励起波長457nm、発光波長670nmの
銅格子	Electron Microscopy Sciences	G400-CP