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方法論記事

大人のための味の好みアッセイ

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DOI:

10.3791/54403

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2016年9月8日

 , 
1Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine-South Bend

この記事について

サマリー

味覚は、有益な物質への引き寄せと有毒物質の回避を促進する重要な感覚プロセスです。 このプロトコルは、所与の化合物に対するショウジョウバエの味覚選好を決定するための簡単な摂取アッセイを記載しています。

要約

環境の嗅覚と味覚の知覚は、動物の生存にとって不可欠です。 これらのケモセンスの最も明白な用途は、良質な食料源と潜在的に危険な食料源を区別できることです。 「味覚」は、ニューロンの表面に発現する味覚受容体を通じてシグナルを送ることができる化合物との物理的接触を必要とします。 昆虫では、これらの味覚ニューロンが動物の体全体に配置されているため、味覚がさまざまな行動で重要な役割を果たすことができます。 昆虫は通常、糖を含む化合物を好みますが、苦味があると見なされる化合物は避けられます。 味覚の基本的な生物学的重要性を考えると、この感覚様式の根底にある分子メカニズムを理解することに強い関心が寄せられています。 私たちは、特定のテイスタント化合物に対する動物の好みを反映した成体のショウジョウバエ味覚アッセイについて説明します。 このアッセイは、任意の遺伝的背景を持つ動物に適用して、目的の可溶性化合物の味の好みを調べることができます。

概要

動物は不利な条件とは別に有利な条件を区別するためにchemosensationを使用しています。この認識は、最良の食料源を決定する有毒物質を避けるか、最高の交配相手1を決定するようなもののために重要であることができます。嗅覚と味覚の五感：Chemosensationは、多くの場合、2つの感覚のコンポーネントに分割されています。これらの感覚の主な際立った特徴は、嗅覚（臭い）が味覚（味）は、不揮発性基板との物理的接触を必要としながら、周囲のガス状の化学環境をサンプリングするために使用されていることです。どちらの感覚モダリティは、適切な魅力や反発動作2を生成するために、脳内で処理し、デコードされた神経学的応答を刺激します。これらの感覚は、動物の生存のためにきわめて重要です。

キイロショウジョウバエのショウジョウバエは理解での使用のために人気が成長を続けているモデル生物であります昆虫は香りと味を感じるかる。ショウジョウバエは、分子の細胞、および行動経路の解剖のために利用可能な遺伝子ツールの富のために他のモデルシステムを超える多大な利点を提供します。過去15年間の仕事は、特定の細胞のアイデンティティ、神経細胞の受容体を特徴付けるし、香りと味の両方に関与するシグナル伝達機構に特に尽力してきました。さて、 ショウジョウバエ遺伝学の力はさらにこれらのプロセスは、単一のニューロンと単一回路レベル3-6で符号化されているかを解明するために使用されています。したがって、感覚経路に変更の容易得点読み出しを提供するアッセイは、これらのフィールドの継続的な前進に不可欠です。

多大を符号化し、脳内でどのように処理されるか嗅覚信号については知られているが、はるかに少ないが味覚経路における同様のメカニズムについて理解されています。ここで味preferenを確認するために使用できるプロトコルを記述します苦味化合物とは対照的に、 ショウジョウバエ 。 ショウジョウバエのCEは、哺乳類のように、一般的に甘味化合物を好みます。これらの食物源の任意の組み合わせは、遺伝子改変は、味の選択にどのように影響するか、既知決定するために、この実験の設計に利用することができます。さらに、薬理学的介入戦略は、同様に動物の味覚嗜好に対するそれらの効果について評価することができます。このアッセイの使いやすさと柔軟性はショウジョウバエの味覚知覚の性質を理解するために有用なパラダイムになります。

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プロトコル

1.飢餓

  1. 標準フライバイアルの底に18.2MΩの水でコットンボールを飽和させることにより、フライ飢餓バイアルを準備します。また、同様にバイアル内の角度で18.2MΩ水と場所とのろ紙の小片を飽和。
  2. CO 2パッドの上に〜100の動物のセットにハエを収集してから、準備されたバイアルにハエを追加します。
    注：最良の結果が5日未満齢である動物を用いて得られます。しかし、動物の正確な年齢は、経時的な味の好みの変化を決定するための実験変数として制御することができます。
  3. バイアルを閉じて固定するためにコットンボールやフォームストッパーを使用してください。環境制御インキュベーター中で彼らの側にバイアルを置きます。 25℃の温度、および70％以上の湿度を維持。 24時間そのままのバイアルを残します。

2.味の好みアッセイ

  1. 同じ日Aのアッセイのためのすべての味物質を準備sのテスト。
    注意：使用する正確な味物質が求められている実験的な質問によって異なります。以下は、このプロトコルで使用される例の味物質です。最適化のためのセクション4を参照してください。
    1. 100mMのスクロース溶液10μl、食紅の13μlを、および18.2MΩの水977μLを組み合わせることにより、制御味物質（1 mMのスクロース）を準備します。
    2. 100mMのスクロース溶液50μl、青色食品着色料を10μl、および18.2MΩの水940μLを組み合わせることにより、実験的味覚（5 mMのスクロース）を準備します。
  2. 以下のようにして調製し、標準的な100ミリメートル×15ミリメートルのプラスチックシャーレを用いたアッセイチャンバーを行います。
    1. 12時位置にプレートの端に最も近い制御味物質の三10μlの滴と6時位置に別の3滴を置きます。液滴間の間隔が類似していることを確認してください。
    2. 3時とでプレートの端に最も近い実験味物質の三10μlの滴を置きます他の3は、9時位置にドロップします。液滴間の間隔が類似していることを確認してください。
    3. 所望のように繰り返しては、多くの複製のために2.2.1と2.2.2を繰り返します。
  3. CO 2パッドの上に〜100飢えたハエの空のバイアル1本だけの十分な長さのすべての動物（約10秒）を麻酔しました。準備された検定室の中央に動物をブラシと皿蓋でカバーしています。
    注：CO 2露出が回復時間を改善し、摂食行動との干渉を制限するために避けるべきであるの長い期間を。氷（約5分）への暴露も、限られた暴露から生じ得るCO 2行動の影響を回避するために麻酔のために使用することができます。
  4. 不透明な段ボール箱に分析室を置きます。テストされている状態と遺伝子型と箱の外側にラベルを付けてください。
  5. 2時間の少なくとも70％の湿度で25℃のインキュベーターに全体のセットアップ（ステップ2.4​​から段ボール箱内に含まれるアッセイ室）を配置します。
  6. 繰り返しは、すべての複製のために2.5を介して2.3を繰り返します。
  7. 2時間後、定量化のための準備が整うまで直接-20℃の冷凍庫の中に、まだ段ボール箱内に含まれるアッセイチャンバーを配置。

3.味の好みアッセイ定量化

  1. 単一のアッセイチャンバーは室温（約5分）まで昇温することを可能にします。
  2. 赤、青、紫やクリア（ 図1）：解剖顕微鏡下では、ブラシや鉗子のペアを使用して、グループの動物、その腹部の色に基づいて。
  3. 各グループの動物数を記録します。アッセイに参加していないために、したがって、任意の計算に含めていない明確な動物を考えてみましょう。
  4. 以下の式のいずれかに記載の優先度を計算します。
    1. 関心の実験味覚が赤色染料に追加された場合、（ 紫 0.5N + 赤 N）/（N 赤 + N 青 + N purplを使用E）。
    2. 実験味物質が、青色色素に追加された場合、（ 紫 0.5N + 青 N）/（ 紫 N 青 + N 赤 + N）に式を調整します。
  5. すべての実験条件および複製のための計算を繰り返します。

味の好みアッセイの4最適化

  1. 経験的に次のように食品着色料は、味アッセイの結果には影響しませんので、使用する食品着色料指標の濃度を決定します。
    1. ステップ2.1で示したように同じ塩基化合物（ 例えば、5 mMのスクロース）を用いて、4味物質を準備したが、食品着色料を省略します。
    2. 味物質の1に1.3％食紅を追加します。各チューブ内の様々な濃度の青色食品着色料（ 例えば 、0.6％、1％、および1.3％）で、残りの3味物質を作ります。
    3. 完全なプロトコルは、それぞれの味物質ペアについて3.4を介して2.2ステップ：1.3％赤対0.6％青; 1.3％赤対1パーセントの青と1.3％の青対赤の1.3％。
    4. 選好指数平均までの青色食品着色料の異なるパーセンテージ0（ 図2）の値を持つ手順を繰り返し4.1.1-4.1.3。
      注：出発点として、1％の青色食品着色料と相まって1.3％食紅は、典型的には、良好な結果をもたらします。青い食品着色料の満足のいく濃度が1.3％の染料に一致することができない場合は、4.1.3を経てステップ4.1.1は、赤色の着色と青の食品着色料の一定濃度の様々な濃度で繰り返すことができます。
    5. 同じ最適化された食品着色料の濃度で試験されるべきすべての条件を分析します。

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結果

味覚嗜好アッセイからのいくつかの典型的な結果を以下に示します。ほとんどの実験では、腹部発色強度のいくらかの変動は、（ 図1）に見られるであろう。強烈なまたは弱いか腹部内の任意の着色は、正の摂取であると考えられます。任意の潜在的なバイアスを制限するように、研究者は実験条件に盲目ながら動物を獲得することはことをお勧めです。

好みのアッセイの結果には影響しません食用色素の濃度を選択することも重要です。様々な食品着色濃度を用いた結果の例を図2に示されている青色食用色素の量を変化させながら、この例では、赤色食用色素の量を1.3％に維持した。0.6％、1％、および1.3 ％。各色素は、アッセイの参加者の高い割合を確保するために、5 mMのスクロースを添加しました。味prefereNCEアッセイを各条件と3.4.1において式に従って計算優先度から3反復で行いました。 1.3％の赤色染料と結合された1...

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ディスカッション

私たちは、 ショウジョウバエの味の好みを決定するための簡単で効果的なプロトコルを記述しています。このアッセイのバージョンは、日常の味覚化合物の異なる品質（苦味、甘味、酸味、塩味、うま味）を知覚する味覚受容体（GRS）の拠出を決定するための実験で使用されています。 ショウジョウバエのゲノムは、選択的スプライシング8,9により68識別された味覚受容体をコード化する約60の遺伝子が含まれています。しかしながら、このようなイオンチャネル型グルタミン酸受容体とTRPチャネルのような他のタンパク質もまた、味10-13において役割を果たすことが実証されています。したがって、昆虫における味の識別力に広範な多様性があります。また、匂いの受容体とは異なり、味覚受容体は、全てのハエの上に位置する細胞で発現されます。異なる味覚受容体を発現するニューロンの組み合わせを含む感覚器は唇弁、脚、翼と14産卵管で見つけることができます。など、ショウジョウバエは求愛と産卵を含む栄養買収を超えて行動のホストの味の差別に依存しています。

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この原稿を批判的に読み、このプロトコールの準備中に有益な提案をしてくださったTessier研究室のメンバーに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
青色食品着色料(水、プロピレングリコール、FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)McCormickN/A
Cryo/Freezer Boxes w/oDividersFisher 03-395-455
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-20
Glacial AceticAcid FisherBP2401-500
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscopeW. Nuhsbaum, Inc.
シャーレ(100mm×15mm)BD Falcon351029洗って乾かすれば再利用可能
クイックスナップマイクロチューブサイエンティフィックC3017
赤色食品着色料(水、プロピレングリコール、FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)McCormickN/A
スクローIBI ScientificIB37160
10446294 アルカリ社ス

参考文献

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再版と許可

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