ゼブラフィッシュ胚からの内因性受容体の親和性ラベリング検出

サマリー

ゼブラフィッシュの胚に存在する低存在量の内因性受容体を検出するための新しい技術が説明されています。免疫沈降に関連するリガンドによる受容体の親和性標識で構成されているため、AFLIPと名付けました。

要約

Affinity LabelingとImmunoprecipitation（AFLIP）の力を組み合わせることにより、ゼブラフィッシュの胚における低存在量の受容体を検出する技術が実装されました。この技術は、免疫沈降の特異性を持つリガンドによる特定の受容体のアフィニティー標識によって付与される選択性と感度を利用します。私たちは、ゼブラフィッシュの初期発生過程において、AFLIPを用いて、ベタグリカンとも呼ばれるIII型TGF-β受容体(TGFBR3)を検出しました。AFLIPは、TGFBR3モルファントゼブラフィッシュの表現型の有効性を検証するのに役立ちました。最初のステップでは、胚タンパク質抽出物を調製し、¹²⁵のI-TGF-β2-TGFBR3複合体を作製し、免疫沈降によって精製します。その後、これらの複合体は共有結合的に架橋され、SDS-PAGE分離とオートラジオグラフィー検出を使用して明らかになります。この手法では、検出される受容体に対する標識リガンドおよび受容体に対する特異的抗体の利用可能性が必要であり、これらの要件を満たす任意の成長因子またはサイトカイン受容体を同定するために容易に適合させる必要があります。

概要

>jove_contentin situハイブリダイゼーション（ISH）で同族のmRNAを測定することによって得られた発現プロファイルを検証するためには、胚発生中に発現するタンパク質の特異的な検出が必要です。これは通常、胚抽出物のウェスタンブロットとそれに続く特異的抗体による検出によって達成されます。しかし、このアプローチは、存在量が非常に少ないタンパク質や、ブロッティング中の定量的移動を妨げる特性を持つタンパク質に適用するのは困難です。ベタグリカンは、III型トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)受容体(TGFBR3)とも呼ばれ、これらの困難の一例です。TGFBR3は、そのコアタンパク質¹を介してTGF-βに結合するパートタイム膜プロテオグリカンであり、アイソフォームTGF-β2に対する親和性が著しく高く、これは他のTGF-β結合タンパク質²と区別する特性です。ゼブラフィッシュのTGFBR3は、8 hpf以降で発現し、そのmRNA³のRT-PCRによって検出されるように、最大72 hpfに達します。

しかし、非常に特異的な抗体³が利用可能であったにもかかわらず、その翻訳産物をウェスタンブロットで検出する試みはすべて失敗に終わりました。この失敗の原因は、TGFBR3のプロテオグリカンの性質と推定される存在量の少なさにあると考え、TGFBR3のTGF-β2に対する高い親和性を利用した検出法AFLIPが考案されました。この方法では、プールされた胚からのタンパク質抽出物が¹²⁵I標識TGF-β2に特異的に結合することを許され、受容体-リガンド複合体は免疫沈降によって精製され、SDS-PAGEによる分離の前に架橋されます。ゲルのオートラジオグラフィーによって観察された移動パターンは、標識された受容体種の存在と性質を明らかにしました。このアプローチは、アフィニティー標識のリガンド特異性と特異的抗体による免疫沈降を組み合わせ、検出範囲を拡大し、TGFBR3の非効率的なトランスファーブロッティングを回避します。AFLIPアッセイは、その固有の特性により、定量的なアッセイではありませんが、分析された受容体の相対的な実験差を自信を持って測定するために使用できます。

プロトコル

FLC40-14：動物で行わ全ての実験はCICUAL-プロトコル番号の下、メキシコ自治大学（UNAM）の実験動物管理使用委員会によって承認されました。 （CICUAL：「ComitéInstitucionalパラエルCuidado yの嘘・デ・ロス・Animales・デ・ラボラトリ・デル・研究所・デ・FisiologìaCELULAR、ナショナル大学自治・デ・メキシコ」）。

胚のタンパク質抽出物の調製

1. 各条件は、例えば72時間後に受精（HPF）のために、所望の段階で（モルファント対野生型）を比較するための200の胚 - 100を収集します。
2. 先の細いピンセットを使用して場所の魚の水を含むペトリ皿中の胚（ 表1参照）、手動dechorionate胚。それは、標的受容体を消化することができるように、この段階（またはプロトコルを通じて、他のプロテアーゼ）中にプロナーゼを使用しないでください。
3. 1.5mlマイクロチューブに入れ胚と胚TWを洗います1×リン酸緩衝溶液（PBS）と氷（ 表1参照）。
4. （ 表1を参照）deyolk用緩衝液500μlを追加します。
5. （ - 40倍、約30）溶液中で胚を優しく上下にピペッティングにより卵黄のほとんどをリリース。 72 HPFと48 HPFの胚については、それぞれ、青と黄色のピペットチップを使用します。黄色のヒントが少し胚を壊さないようにカットする必要があるかもしれません。成功した卵黄の放出は、顕微鏡下で胚を観察することによって確認することができます。
6. 15秒間600×gで遠心分離することによって胚を収集します。
7. ピペットを使用して、慎重に上清を捨てます。
8. 洗浄胚は二回500μlの洗浄バッファーで穏やかに最低速でボルテックスすることによって（ 表1参照します）。
9. 15秒間600×gで遠心分離することによって胚を収集します。
10. ここから出発し、4°Cで手順を続行します。
11. ピペットを使用して、慎重に上清を捨てます。
12. 溶解バッファー350μlの再懸濁胚（表1を参照）、プラスチック製乳棒を用いて均質化します。
13. 4°Cで試験管ロッカーに溶解させた胚を攪拌しながら30分間インキュベート。
14. 遠心分離機は、不溶性の破片を除去するために15分間、11,000×gで胚を溶解しました。
15. 転送が新しいチューブにピペットを用いて上清をクリア。
16. Bradfordタンパク質アッセイ^4、または他の適切な手順により総タンパク質を決定します。 Bradfordアッセイを使用している場合、彼らは⁴標準タンパク質の過小評価を引き起こすように、溶解緩衝液中の界面活性剤の提示の等価な濃度の存在下で較正曲線を実行します。

2.検出内因性受容体タンパク質の

1. 親和性標識および免疫沈降（すべての手順4 ^{O C}で）
   1. 1.5mlマイクロチューブに総胚タンパク質の500μgのバッファ1（ 表1を参照）を1μg/μlに希釈する- 400を置きます。
      注：総胚タンパク質500μgのを得るためには、約100から200胚が最初に処理されなければなりません。 72 HPFの胚は、日常的にβグリカンの検出のために十分である総胚タンパク質、の〜5μgのをもたらします。
   2. 試験管ロッカーに150 PMの最終濃度に達すると攪拌しながらインキュベートし、4℃で2時間標識TGF-β2株式の十分なボリュームを追加します。 AFLIPが開始される前にCheifetz ら ⁵によって説明したように、TGF-β2は、クロラミンT法によって¹²⁵ Iで標識されなければなりません。
      注意：使用して私は、リガンドを標識した^125の処理中^に露出を最小限にするためにシールド。
   3. 100希釈および（インキュベーションは、O / Nであってもよい）4℃でさらに2時間インキュベーションを継続：1に到達するために、目的の受容体に対する希釈していない抗体の十分なボリュームを追加します。これは、この研究で使用され、他の場所^3を説明するが、ANの品質に応じて、抗血清＃31の最適希釈でありますtibody、より大きいまたはより小さい希釈が最適であってもよいです。
   4. 適切な免疫グロブリン結合ビーズの50μlを添加（例えば、以前にTNTEで平衡化し、1再懸濁させたGタンパク質セファロース、：TNTEで元の体積の5）と4℃で試験管ロッカー上で撹拌しながら50分間インキュベートしますC.
   5. 20秒間11,000×gで微量遠心によってビーズを回復。
   6. 適切な放射性ゴミ容器に上清を捨てます。
   7. 20秒間11,000×gで毎回ボルテックスし、微量遠心することにより、（ 表1を参照）IP洗浄緩衝液1mlでIP-ビーズを3回洗浄します。
   8. IP洗浄緩衝液250μlの中に再懸濁したIP-ビーズ。
   9. （10 mg / mlとでDMSOに溶解したDSS、​​）ジスクシンイミジルスベレートの1.5μlを添加します。ちょうどこの段階でその使用前にDSS溶液を調製します。
   10. 攪拌しながら4℃で15分間インキュベートします。
   11. 架橋反応をクエンチするために、500μlのOを加えます十分トリス-Cl pH7.4の在庫を補充したF IP洗浄緩衝液は、25mMのトリス-Clに到達します。トリス中の遊離アミノ基が未反応のDSSをキャプチャします。
   12. 20秒IP-ビーズを収集し、上清を廃棄するための11,0​​00×gで遠心分離します。
   13. 再懸濁IP-ビーズLaemmliバッファーを減らす30μlのインチ
   14. 沸騰サンプル94℃で5分間。
   15. 必要に応じて、製造業者のプロトコルを使用して、ガンマカウンターでサンプルを分析します。
2. 試料分析
   1. 変性SDS-PAGEの対象サンプル。受容体の質量のための適切な割合でポリアクリルアミドを使用し、標準的な手順の下でゲルを実行します。
   2. 固定液中でゲルを浸し、室温で30分間（ 表1参照）。
   3. 15分間蒸留水でゲルを洗浄してください。
   4. 以前に水和ろ紙にゲルを置き、サランラップフィルムでカバーしています。
   5. 1時間80℃で乾燥ゲル。
   6. 白ホスホイメージャSCREにゲルを公開RT O / Nでアン。
   7. 製造業者のプロトコルを使用して、ホスホイメージャを用いて露光画面をスキャンします。

結果

図1は AFLIPで得られた代表的な結果を示しています。 ¹²⁵ I-リガンドから来レーン1の信号は、共有ゼブラフィッシュβグリカンコアタンパク質（BGコア、150 kDaのマーカー以下）またはグリコサミノグリカンのアタッチメント（GAG、スミアによってそのプロテオグリカンの形に加工されたBGコアのいずれかにリンクされています）170キロダルトンからゲルの上部に及びます。移行のこのパターン、シャープなコアタンパク質プラス（GAG鎖の長さが原因で不均質に）塗抹プロテオグリカンは、TGFBR3 ²の特徴です。 DSSは共有結合で形成された一つ一つのリガンド-受容体複合体をリンクしていないので、ゲル^（125 I-TGF-β2）の移行前面に現れる自由¹²⁵ I-リガンドがあります。この無料のリガンドは、受容体に結合し、免疫沈降時にバインドされたままであったが、それは共有結合していないため、SDS-PAGEの手順の間に切り離さ。いいえnethelessは、その...

ディスカッション

目的のタンパク質に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロットの使用は、胚発生時にその発現^7を研究するため^の貴重なツールです。しかし、高度にグリコシル化されたタンパク質のイムノブロットは、その非効率的な転送およびニトロセルロースまたはPVDF膜^8,9に弱い結合に非常に成功していません。

プロテオグリカンは理由負に帯電しているとポリスチレン表面または疎水性のブロッティング膜のいずれにも結合しない彼らの共有結合したグリコサミノグリカン鎖（GAG）の、この欠点の良い例です。また、GAG鎖の大きさの不均一性が効果的にブロットの面積当たりの量を減少させる、ゲルのセクター上でタンパク質を「広がります」。目的のタンパク質が発現の低いレベルを有する場合に加えて、定期的なウェスタンブロットにより、その検出が困難なタスクです。受容体（TGFBR3）またはβグリカンβIII型トランスフォーミング増殖因子（BG）、哺乳類¹とゼブラフィッシュ³の1に2つのGAGの結合部位を有する膜受容体は、これらの特...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ジスクシンイミジルサブエレート(DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
台風 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO<サブ>4	J.T.ベイカー	3828
K2HPO4	J.T.ベイカー	3246
CH3OH	J.T. ベイカー	9070
CH3COOH	J.T. ベイカー	9508
HCHO	J.T. ベイカー	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
クリスタルシーマリンミックス	マリンエンタープライズインターナショナル	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix