方法論記事

定量的なアプリケーションのための均質なMALDI試料の調製

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DOI：

10.3791/54409

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2016年10月28日

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1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University, 3Department of Chemical Engineering and Biotechnology, National Taipei University of Technology

この記事について

サマリー

サンプルの乾燥工程時の基板温度を調節することにより、MALDI質量分析法におけるイオン信号の空間的な不均一性を低減するためのプロトコルが示されています。

要約

このプロトコルは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析中にイオン信号の空間的不均一性を低減するための簡単なサンプル調製を示しています。イオンシグナルの不均一性はMALDIの深刻な問題であり、データの再現性が低下し、MALDIは定量分析に適していません。サンプル調製中にサンプルプレートの温度を調節することにより、サンプル溶液の液滴内の熱誘起流体力学的流れにより、不均一性の問題を減らすことができます。MALDIサンプルプレートを保持する温度制御された銅製ベースブロックを備えた室温のサンプル調製チャンバーは、サンプルの乾燥条件を正確に制御します。サンプル液滴の乾燥後、サンプルプレートの温度を室温に戻し、その後の質量分析のためにチャンバーから取り出します。サンプルの領域をMALDIイメージング質量分析で調べ、サンプル中のすべての成分の空間分布を取得します。温度制御をせずに周囲条件下で試料を調製する従来の乾燥液滴法と比較して、ここで示した方法で調製した試料は、空間分布と信号強度が有意に良好である。炭水化物とペプチドのサンプルを使用した観察によると、乾燥プロセス中に周囲を周囲温度に保ちながら基質温度を下げると、イオンシグナルの不均一性を効果的に低減できます。この方法は、一般に、サンプルとマトリックスのさまざまな組み合わせに適用できます。

概要

質量分析(MS)は、複雑なサンプルの分子組成を分析するための最も重要な分析技術の一つです。MSで使用されるすべてのイオン化法の中で、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)は、バイオアナリシスアプリケーションで最も感度が高く、広く使用されている方法です。1 他のイオン化技術と比較して、MALDIは塩分汚染物質に対して最も高い感度と高い耐性を持っています。このような分析特性により、MALDIは炭水化物分析や多くのプロテオミクスアプリケーションの最初の選択肢となっています。しかし、サンプル調製は、MALDI-MSで高品質のデータを取得するための重要なステップです。

MALDI-MSで最も一般的に使用されるサンプル調製方法は、サンプル液滴を表面に堆積させ、周囲条件下で乾燥させる乾燥液滴法です。この乾燥方法はシンプルで、一般的に効果的です。2-5 しかし、乾燥液滴法の一般的な問題は、得られた分析物/マトリックス結晶が通常不規則に分布することです。多くの場合、結晶はサンプル領域の周辺で凝集し、いわゆるリングステイン形成を引き起こします。6-8 不均一な結晶形態は、分析種分子の空間分布に影響を及ぼし、その結果、サンプル領域全体でイオンシグナルが激しく変動します。このような激しいシグナル変動とデータの再現性の低さは、MALDI-MSの「スイートスポット」問題として知られています。9 したがって、MALDI-MS乾燥液滴アプリケーションにおける空間的不均一性を低減することが非常に求められています。

サンプル液滴の流体力学的な流れは、乾燥液滴法で調製されたサンプルの空間分布を決定する上で重要な役割を果たします。10-12 溶媒の蒸発により、液滴内の毛細管現象が外向きに流れ込み、これがリングステイン形成の原因となることがわかった。7,10対照的に、接線方向の表面張力勾配によって誘発される再循環流は、外側の毛細管現象の流れを相殺する可能性があります。13再循環流速が外向きの毛細管流の速度よりも速い場合、サンプルを効率的に再分配して不均一性の問題を減らすことができます。14

名

この研究では、液滴乾燥プロセス中に効率的な再循環の流れを誘発するための単純な乾燥チャンバーでサンプルを調製するための詳細なプロトコルを示します。液滴の乾燥条件は、サンプルプレートとその周囲の温度、チャンバー内の相対湿度など、正確に制御されています。モデル分析種には、マルトトリオース鎖とブラジキニン鎖が含まれます(1-7)。デモンストレーションに使用したマトリックスは、2,4,6-トリヒドロキシアセトフェノン(THAP)です。サンプルをTOF(Time-of-Flight)MSで調べ、データを定量的に分析して、不均一性の減少を示します。

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プロトコル

注意：このプロトコルは、乾燥液滴法を用いて調製した（1-7）マルトトリオース及びブラジキニンフラグメントの空間的な不均一性を減少させるために開発されています。プロトコルは、調製及び前処理、試料堆積、乾燥、及び質量分析データ分析を含む三つの主要な段階からなります。手順は、以下でより詳細に概説し、説明します。

1.準備と前処理

  1. サンプルプレートのクリーニング
    1. ニトリル手袋を着用し、洗剤と蒸留脱イオン水（DDW）で穏やかにサンプルプレートを手で洗います。
    2. メタノール（MeOH）でとDDWでサンプルプレートをすすぎます。
    3. 600ミリリットルのビーカーにサンプルプレートを挿入し、DDWでいっぱい。
    4. 超音波浴（200 W、40キロヘルツ）で15分間、DDWでサンプルプレートを超音波処理します。
    5. ビーカーからDDWを削除し、MeOHでビーカーを埋めます。
    6. 超音波浴（200 W、40キロヘルツ）で15分間、MeOH中でサンプルプレートを超音波処理します。
    7. 窒素ガスをプレート上で溶剤滴を吹き飛ばすとサンプル堆積前にサンプルプレートの乾燥を保ちます。
  2. 乾燥チャンバーの温度を調節します
    注：乾燥室は35×20×45 cm 3である（幅×奥行き×高さ）アクリルチャンバー図1は、この乾燥システムの写真を示します。チャンバは、乾燥室の内部に設置較正湿度計によって監視低い相対湿度を維持するために一定の流量でガス流量計を介して室温窒素ガスでパージされます。プログラムされた恒温水循環装置を備えた乾燥室中の銅ベースブロックは、ステンレス鋼サンプルプレートを収容するために使用されます。銅ベースブロックを25℃に5からのサンプルプレートの温度を調節することができます。空気、銅ベースのブロック、及びサンプルプレートの温度は、K型熱電対によって監視されます。
    1. ドアを開け、急速に銅をサンプルプレートを置きますベースブロックは、その後、ドアを閉じます。
    2. 手動で時間当たり10標準立方フィート（SCFH）で窒素流量を設定するためにガス流量計を調整します。
    3. 相対湿度が常に25％未満である保証するために、湿度計と微調整ガス流量計による乾燥チャンバ内の相対湿度を監視します。
    4. K型熱電対によってサンプルプレートの温度を監視し、サンプルプレートは、実験又は対照を室温（25℃）が5℃になるまで手動で水循環温度を調整します。
      注：設計温度でサンプルプレートを安定させるために、水循環装置の温度は、典型的には、設計されたサンプルよりも低い0〜5℃に設定されています。例えば、サンプルプレートに5℃を維持するように、水循環装置の温度設定は、0℃〜2の範囲です。 25℃でのサンプルプレートを維持するために、水循環装置の温度設定は23℃〜25℃の範囲です。
    5. 必要な温度と相対湿度はサンプル堆積の前に（ 表1）に達していることを確認します。
      注：異なるサンプルプレートの温度が乾燥プロセスのすべてのパラメータ、ならびにそれらの設定値を表1に示します。
      注：室のドアを長時間開いている場合は、低いサンプルプレートの温度では、サンプルプレート上の結露が発生することがあります。結露が発生した場合は、ドアを閉じて、結露が出て乾燥するまでの任意のサンプルを堆積しないでください 。
  3. マトリックスと分析物溶液の調製
    1. マトリックス溶液の調製
      1. 50％DDW水溶液：50％アセトニトリル（ACN）と0.1 M THAP溶液を調製します。
    2. 検体の準備
      1. DDWで10 -4 Mマルトトリオース溶液を調製します。
      2. 10 -5 Mのブラジキニン断片（1-7）溶液を50％アセトニトリル中で調製します（ACN）：50％DDW水溶液。

2.サンプル沈着と乾燥

  1. プレミックス0.1 MのTHAP液の0.25μlの10 -4 Mのマルトトリオースまたは10 -5 Mブラジキニンフラグメント（1-7）マイクロ遠心チューブ内のソリューションの0.25μlの。
  2. 3秒間混合溶液をボルテックス。
  3. 遠心管の底に溶液を回収するために2秒（2,000×gで）混合液を遠心分離。
  4. 乾燥室のドアを開け、慎重にピペットでサンプルプレート上に溶液0.1μLを堆積し、すぐにドアを閉めます。
  5. 試料液滴が乾燥するのを待ちます。
    注：典型的に観察された乾燥時間の異なるサンプルプレートの温度を表1に記載されていると5℃のサンプルプレートの温度は、平均乾燥時間が800〜1000秒です。 25°Cのサンプルプレート温度について、平均乾燥時間は100〜150秒ですEC。
  6. 乾燥させた後、乾燥室の扉を開きます。
  7. 室温（25℃）での水循環温度を設定します。
    注：サンプルプレートは、乾燥工程中に、室温（25℃）で常に保たれている場合は、このステップをスキップします。
  8. 室温（25℃）にサンプルプレートの温度が戻った後、乾燥室からサンプルプレートを取り外します。
  9. 5Xの実体顕微鏡下でのサンプルの形態を調べ、スナップショット明視野像を取ります。
    注：予想通りの結晶形態ではない場合は、同様の手順を使用して新しいサンプルを用意する必要があります。典型的な結晶形態は、図2の上のパネルに示されています。
    注：このような5°Cなどの低サンプルプレート温度、との例では、乾燥室からそれを取る前に室温にサンプルプレートをウォームアップすることが重要です。サンプルを堆積すると、予混合solutioを保管しないでください10秒以上のピペットの先端中のn。サンプルを堆積した後、再び予混合ソリューションを使用しないでください 。 図2の上のパネルは、異なるサンプルプレートの温度を用いて調製した試料の明視野画像を示します。

3.質量分析データ解析

  1. 質量分析データ集録
    注：調製後、試料をイメージング質量分析を用いて分析することができます。現在の研究では、イメージングMS実験を実験室内蔵同期デュアル極性TOFを使用して行われる（DP-TOF）イメージング質量分析計。撮像能力を持つ15市販MALDI-TOF質量分析計は、また、そのような実験に適しています。質量分析計は、線形抽出と最適化された抽出遅延を有する陽イオンモードで操作されます。イオンの運動エネルギーは、20 kVです。レーザービームの大きさは、試料表面上の直径が35μmであり、すべてのスポットのスペクトルAVEあります5レーザーショットの怒り。
    1. MALDI質量分析計にサンプルプレートを挿入します。
    2. ステップ2.1から2.9に調製した試料を撮像する質量分析を実行します。
    3. 結果ウィンドウに表示される質量リストから特有の質量ピークを選択して、2次元イオン画像をプロットする「2D」をクリックします。
      注：THAPと混合マルトトリオースのために、特徴的なピークは、マルトトリオース、プロトン化THAPをナトリウムイオン付加し、THAPをナトリウムイオン付加されています。 THAPと混合ブラジキニン断片（1-7）について、特徴的なピークは、ブラジキニンフラグメント（1-7）、プロトン化THAPをプロトン化、およびTHAPをナトリウムイオン付加が含まれます。
    4. 信号強度の上限と下限を決定するために、ポップアップウィンドウに調整ボタンをクリックして、「画像を保存」をクリックします。この設定は、イオンの画像のコントラストを定義します。
      注：データのすべての個々のセットでは、ひび割れ領域及び低輝度を示すヌルスポットが除去されます。
    5. イオンを観察し、比較しますステップ2.9で撮影された明視野像と画像。
      注記：特定のイオンの画像のイメージング質量分析法及び構造は、市販の機器を使用して達成することができます。データ収集および解析ソフトウェアの様々な、ユーザーは、高品質の画像を取得するために、機器ベンダーが提供するソフトウェア命令に従ってください。
  2. データ分析
    注：サンプルの不均一性を定量的に分析されます。このデモでは、すべてのサンプルは、イオンの空間分布を分析するために、社内で開発されたソフトウェアにより、複数の同心円状の領域に分割されています。分析はまた、スタンドアロンのデータ分析ソフトウェアを用いて行うことができます。
    1. 重要でない領域を除去するために、結果ウィンドウに表示されているイオン像にヌルスポットやひび割れ領域をクリックしてください。
      注：この手順では、イオン像の本質的な領域を定義します。
    2. イオン像の最外層を見つけるために、「エッジを見つける」ボタンをクリックします。
    3. データベース内の最も外側の層のイオン存在情報を保存し、同時にイオン像から、この層を除去するために、「控除」をクリックします。この最外層を表すチェックボックスが結果ウィンドウの「出力データ」リストに表示されます。
    4. イオン像の中心が定義されるまで繰り返して、3.2.2と3.2.3を繰り返します。
    5. クリックして、「出力データ」リストのすべてのチェックボックスを選択して、データをエクスポートする「エクスポート」をクリックします。
    6. イオンの空間分布情報を取得するために、すべての層の平均イオン存在を計算するために、表計算ソフトを使用してエクスポートしたデータを開きます。

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結果

明視野画像並びにサンプルプレート5の温度25℃で調製マルトトリオース及びブラジキニンフラグメント（1-7）のMS画像は、図1に示されている。ナトリウムイオン付加マルトトリオース、イオン信号主としてを移入の場合それは、25℃のサンプルプレートの温度を用いて調製された試料領域の周囲に。 5℃にサンプルプレートの温度を下げることにより、信号がサンプル全体の領域にわたって均一に移入します。 5°Cの下でサンプルを調製する唯一の顕著な欠点は、25°Cで作製した試料よりも多くの亀裂があるということです。プロトン化ブラジキニン断片（1-7）のイオン像は、ナトリウムイオン付加マルトトリオースのものと同様の傾向を示しています。イメージングMSの結果は下のサンプルプレートの温度下準備のサンプルが大幅に分子を再配布し、異質性を減らすことができることを示唆しています。

実験結果に基づき、統計分析は、イオン信号の不均一性...

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ディスカッション

以前の理論的予測に基づいて、液滴内の温度誘導性の流体力学的な流れは、溶媒の蒸発によって誘導される外向きの毛細管流れを克服することができます。温度は、液滴増大内勾配時の分子のような内部再循環の効率が向上します。周囲温度でその周囲を維持しながら、5℃下、サンプルプレートの温度を維持した場合に予測された結果によれば、液滴内の再循環流の平均速度は、外側にキャピラリーフローの約4倍高速です。サンプルプレートの温度が周囲と同じである場合、再循環流の平均速度は、外方毛細管流動よりも1,800倍遅いです。この計算の結果は、試料調製中にサンプルプレートの温度を低下させることが有利であることを示しています。実験観察は、この予測に同意します。

サンプルプレート気性ature正確サンプル調製プロセスを通して制御する必要がある。 表1は、異なるサンプルプレートの温度下で試料0.1μlの典型的な液滴の乾燥時間を示しています。プレート上の試料液を付着させる前に、サンプルプレートの表面が乾燥していることを保証することが重要です。低温下でのサンプルを調製する際に結露が発生した場合は...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益を宣言していない。

謝辞

この作業は、中央研究院ゲノミクス研究センターと台湾の中華民国科学技術部(契約番号104-2119-M-001-014)の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬
洗剤粉末アルコノックス242985
メタノールメルク106009
アセトニトリルメルク100003
2,4,6-トリヒドロキシアセトフェノン (THAP)シグマ-アルドリッチT64602 
ブラジキニンフラグメント (1-7)Sigma-AldrichB1651
MaltotrioseSigma-Aldrich47884
ピペットチップメトラー・トレド17005091
微量遠心チューブAxygenMCT-150-C
機器
Milli-Q 水質浄化システムミリポアZMQS6VFT1
パウダーフリーのニトリル手袋MicroflexSU-690
600 ml ビーカーデュラン2110648
超音波洗浄機デルタDC300H
湿度計ワイズウィンド5330
窒素ガス流量計ドワイヤーRMA-6-SSV
Kタイプ熱電対Digitron311-1670
遠心分離機セレクトバイオプロダクツフォースミニ 
ピペットレイニンピペットライト XLS
実体顕微鏡オリンパスSZX16
温度制御可能な乾燥チャンバーこのラボ
同期型デュアル極性飛行時間型イメージング質量分析計 (DP-TOF IMS)このラボ
MALDI-TOFステンレス鋼サンプルターゲットこのラボ

参考文献

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