現在の資源不足の状況では、研究者がより安価に、より速く、より正確に研究を行うことを可能にする新しい技術が出現しています。ここでは、複数の環境病原体へのヒトの曝露を同時に測定するためのビーズベースの唾液抗体マルチプレックス免疫測定法の開発について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
病因および環境病原体に対するヒトの曝露の影響世界中の主要な関心事であると、このように、効果的なコストを用いて露光し、感染を評価する能力、高スループットのアプローチが不可欠であろう。この原稿は、同時に複数の病原体に対するヒトの唾液中の抗体の存在を測定することができるビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイの開発と分析を記載します。血清より収集するために、非侵襲的に安価かつ容易であるため、唾液は、この用途に特に魅力的です。環境病原体からの抗原は、カルボキシル化ミクロスフェア（ビーズ）に結合され、ビーズに基づく、溶液相アッセイを用いたヒトの唾液サンプルの非常に少量で、抗体を測定するために使用しました。ビーズはカンピロバクター、ヘリコバクター・ピロリ菌、トキソプラズマ、ノロウイルス（G I.1およびG II.4）およびA型肝炎ウイルス由来の抗原と結合させました。抗原が十分に結合させたことを確認するために、ビーズは、結合は、ビオチン化抗種二次検出抗体およびストレプトアビジンR-フィコエリトリンレポーター（SAPE）とのインキュベーション、続いて、種特異的な、動物由来の一次捕捉抗体を用いて確認しました。非特異的結合を測定するための対照として、あるビーズセットは、それが任意の抗原に結合しなかった以外、他に同様に処理しました。抗原結合およびコントロールビーズは、次いで、フローサイトメトリーの原理に基づいて、ハイスループット分析器で測定し、プロスペクティブ・採取したヒト唾液試料と共にインキュベートし、そして各抗原に対する抗体の存在は、蛍光強度中央値の単位（MFI）を測定しました。 。このマルチプレックスイムノアッセイは少ないサンプルでより多くのデータを含む多くの利点を、持っています。コスト削減と労働;関心のある多くのターゲットにアッセイをカスタマイズする機能。結果は、唾液、マルチプレックスイムノアッセイをespeciaあり得る、以前の曝露および感染を識別することが可能であることを示しています大規模な人間の集団を含むサーベイランス研究でLLY有用。
概要
下痢関連の病気の85八パーセントは、全世界で約150万人の死亡を引き起こし、汚染された水へのヒトの暴露、危険な食品、および不衛生/衛生状態に関連付けられている、の大半は子供1です 。これは、公衆衛生当局や政策立案者のための懸念の主な原因です。水性およびその他の環境の病原体に関連したエクスポージャーや病気を調査するための努力で、我々は、ヒト試料2-4中の抗体を測定するためのマルチプレックスイムノアッセイを開発しました。この方法は、これらの病原体へのヒトの暴露を決定するために、より良いimmunoprevalence入射感染を定義するために疫学的研究に適用することができます。
唾液は、人間のバイオマーカー研究のための血清の代替としてかなりの可能性を秘めています。唾液を使用する利点の中でも、サンプル収集、低コストの非侵襲性と使いやすさであり、試料を容易に<子供5-7から収集することができます/ SUP>。血清および唾液サンプルは、Hに対する抗体のために広く研究されてきましたピロリ 2,3,8、 熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）9、 赤痢アメーバ 10、クリプトスポリジウム 3,11、....
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プロトコル
承認は、米国の一部として、プエルトリコ、ボケロンビーチでbeachgoersから刺激滲出唾液サンプルを収集するための治験審査委員会（IRB＃08から1844まで、ノースカロライナ大学チャペルヒル、ノースカロライナ州、米国）から入手しました環境保護庁（USEPA）国立疫学およびレクリエーション（NEEAR）水研究23の環境アセスメントは、水泳関連エクスポージャーや病気を評価しました。被験者は、インフォームドコンセントを提供し、訓練を受けたUSEPA請負業者によって唾液収集装置の使用を指示されました。唾液サンプルを受信すると、それらを遠心分離し、そして4に記載のように-80℃で保存し、氷上で輸送しました。
1.ビーズのアクティベーション
- ボルテックスし、20秒間超音波処理し、マイクロ遠心チューブにストックビーズ（400μL）の転送が約5.0×10 6により再懸濁ビーズセットを取り揃えております。
注：T彼は、12.5×10 6ビーズ/ mlの濃度で供給されているビーズ。 - 2分間万×gで遠心分離することにより、在庫ビーズをペレット化。
- 20秒間ボルテックスし、超音波処理により蒸留水（のdH 2 O）の上清を除去し、100μlのペレット化したビーズを再懸濁します。繰り返し手順1.2。
- 上....
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結果
一つのユニークなビーズセットは、変動をサンプリングするために、非特異的な結合とサンプルを測定するための対照として使用しました。これらのビーズは、それらがカップリング工程の任意の抗原と共にインキュベートされなかったことを除いて、抗原結合ビーズと同じように処理しました。全唾液試料とインキュベートコントロールビーズから得られた> 500 MFI値は、血清からの原因が疑われる汚染をさらなる分析から除去し、残りの応答は、分散ログました。歯茎が収集装置に、または研究の参加者が歯周病を持っている場合は添付のスポンジであまりにも激しくこすっている場合、唾液、血清で汚染することができます。対数変換されたMFIのデータは、平均プラスログMFI値の3標準偏差に基づいて、505 MFIの免疫カットオフポイントを計算するために使用しました。さらに、抗原結合ビーズを希除くすべての方法で試験ウェルのように処理した特定のウェルに添加しました。uted唾液は、バックグラウンド蛍光との交差反応性を評価するためにPBS-1％BSAで置換しました。これらのバックグラウンドウェルで得られたMFI値は、各唾液.......
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ディスカッション
これらの結果は、マルチプレックスイムノアッセイ法は、免疫または免疫陰性である唾液サンプルとを区別するために有用であることを示しています。免疫陽性を決定するために、シングルカットオフポイントは、平均+唾液試料のすべてでテスト制御カップリングしていないビーズの対数変換MFI応答の3つの標準偏差を計算することによって開発されました。カットオフポイントは、単一または複数の病原体への曝露とimmunoprevalenceを評価する能力を得ました。この弁別力は、環境および他の病原体への曝露に関連した健康リスクを調査するために集団研究において有用であり得ます。
MFIの分布、非結合対照とどの研究が答えるように設計された質問に応じてカットオフ点を決定するために用いることができる他のいくつかの方法があります。カットオフを決定するためのいくつかの例は、有限混合モデル24-26を含む平均プラス3コントロールへの応答の標準偏差、平均値プラスコントロールへの応答の2標準偏差、および3回のコントロール27,28に対する応答の平均。単純なスクリーニングのために、あま.......
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開示事項
研究開発のその事務所を通じて米国環境保護庁が資金を提供し、ここで説明する研究を管理していました。これは、庁の行政審査を受け、出版が承認されました。商号又は商業製品に関する記述は、使用のための承認または推奨するものではありません。
謝辞
Clarissa Curiosoは、米国エネルギー省と米国環境保護庁との間の省庁間協定を通じて、オークリッジ科学教育研究所が管理する米国環境保護庁の研究参加プログラムへの任命を通じて支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 機器とソフトウェア | |||
| マイクロ遠心分離 | サーモエレクトロンコーポレーション | 75002446 | サンプルを遠心分離するために使用されます |
| ボルテックスミキサー | VWR | G560 | サンプルを混合するために使用されます |
| ソニケーター (ミニ) | フィッシャーサイエンティフィック | 15-337-22 | ビーズを分離するために使用されます |
| ピペッター P10、P20、P100、P1000、8チャンネル。 | キャップ | 各種 | |
| 血球計算盤(ブライトライン) | Housser Scientific | 3200 | 結合ビーズを数えるために使用 |
| マルチスクリーン真空マニホールド | ミリポア | MSVMHTS00 | 上澄みを除去するための洗浄ステップで使用 |
| マイクロシェーカー | VWR | 12620-926 | インキュベーション中にビーズを攪拌するために使用 |
| チューブラック(1.5mlおよび0.5ml)(アソート) | VWR | 30128-346 | |
| 計量スケール | メトラーまたはその他 | バッファー作製用洗浄試薬の測定に使用 | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | カップリングインキュベーションステップで使用 |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | 抗体応答データの分析に使用 | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | 抗体応答データの分析に使用 | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus: p-particle | Xi の実行に使用江(CCHMC)* | NA | *シンシナティ小児病院。ファイナル・コンc. 5 µg. |
| GII.4 ノロウイルス VA387: p-粒子 | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *シンシナティ小児病院.ファイナル・コンc. 5 µg. |
| A型肝炎ウイルス:細胞培養からのグレードII濃縮物 | Meridian Life Sciences | 8505 | 抗原は100 & microで結合。g |
| ヘリコバクター ピロリ: ライセート | Meridian Life Sciences | R14101 | 抗原 25 & micro;g |
| トキソプラズマ原虫:組換えp30(SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | 25で結合しました。g |
| Campylobacter jejuni:熱は全細胞を殺しました | KPL | 50-92-93 | 抗原は50で結合しました。g |
| Primary Antibodies | |||
| モルモット抗ノロウイルス | (CCHMC)* | NA | カップリング確認に使用 |
| マウス抗A型肝炎IgG | メリディアンライフサイエンス | C65885M | カップリング確認に使用 |
| 抗A型肝炎IgG | メリディアンライフサイエンス | C65885M | カップリング確認に使用 |
| BacTraceAffinity 精製抗体 Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | カップリング確認に使用 |
| ヤギ pAb to トキソプラズマ gondii | Abcam | Ab23507 | カップリング確認に使用 |
| BacTrace ヤギ 抗カンピロバクター種 | KPL | 01-92-93 | 確認 |
| に使用<ストロング>セカンダリ 抗体 | |||
| ビオチン-SP-結合型アフィニピュアロバ抗ヤギIgG(H+L) | ジャクソン | 705-065-149 | カップリング確認に使用 |
| ビオチン化ウサギ抗ヤギIgG(H+L) | KPL | 16-13-06 | カップリング確認に使用 |
| ビオチン化ヤギ抗マウスIgG(H+L) | KPL | 16-18-06 | カップリング確認 |
| に使用親和性精製抗体ビオチン標識ヤギ抗ウサギIgG(H + L) | KPL | 176-1506 | カップリングの確認 |
| 消耗品 | |||
| 1.5ml共重合体微量遠心チューブ | USAサイエンティフィック | 1415-2500 | 低結合微量遠心チューブとして使用 |
| 10 & マイクロ;lピペットチップリフィル | BioVentures | 5030050C | |
| 200 & マイクロ;lピペットチップリフィル | BioVentures | 5030080C | |
| 1,000 & マイクロ;lピペットチップは | BioVentures | 5130140C | |
| アルミホイル | 様々なベンダー | インキュベーション中にビーズを暗闇に保ちます | |
| ディープウェルプレート | VWR | 40002-009 | 唾液サンプルの希釈に使用 |
| マルチスクリーンフィルタープレート | ミリポア | MABVN1250 | アッセイを実行するために使用されます |
| Oracol 唾液収集システム | Malvern Medical開発限定 | 唾液採取に使用 | |
| <強>試薬 | |||
| カルボキシル化マイクロスフェア(ビーズ) | ミネックスコーポレーション | ビーズセットに依存 | 抗原はマイクロスフェアに結合しています |
| EDC (1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩) | Pierce | 77149または22980 | ビーズ活性化 |
| に使用スルホ-NHS(N-ヒドロキシスルホスクシンイミド) | Pierce | 24510 | ビーズ活性化に使用 |
| ステプタビジン-R-フィコエリトリン(1 mg / ml) | 分子プローブ | S-866 | レポーターとして使用 |
| MES(2-[N-モルフォリノ]エタンスルホン酸) | シグマ | M-2933 | |
| Tween-20(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート) | シグマ | のカップリングに使用P-9416 | 洗浄緩衝液で非特異的な結合 |
| <強>タンパク質緩衝液< | |||
| 強>PBS-TBNブロッキング/保存緩衝液(PBS、0.1%BSA、0.02%Tween-20、0.05%アジド、pH 7.4)** | フィルター滅菌して4°Cで保存します。C | ||
| PBS、pH 7.4 | シグマ | P-3813 | 138 mM NaCl、2.7 mM KCl |
| BSA | シグマ | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | シグマ | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| アジ化ナトリウム (0.05% アジド)** | シグマ | S-8032 | **注意: アジ化ナトリウムは急性毒性があります。皮膚や目との接触を避けてください。適切なPPEを着用してください。適用される法律に従って廃棄してください。 |
| MES/カップリングバッファー (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-モルフォリノ]エタンスルホン酸) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter 滅菌し、4°Cで保管します。C | ||
| PBS、1% BSA、pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl、2.7 mM KCl、1% BSA |
| 活性化バッファー (0.1 M NaH2PO4、 pH 6.2) | Filter 滅菌し、4°Cで保管してください。C | ||
| NaH2PO4 (リン酸ナトリウム、一塩基性無水) | Sigma | S-3139 | 0.1 M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter 滅菌して4°Cで保存します。C | ||
| PBS、0.05% Tween-20、pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl、2.7 mM KCl、0.05% TWEEN |
参考文献
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
- Augustine, S., et al.
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