高感度免疫組織化学を使用してシトシンの修飾された形態の検出

Summary

ここでは、ペルオキシダーゼ標識二次抗体の使用とチラミドシグナル増幅に基づいて、5mC酸化誘導体の空間分布をマッピングするための高感度免疫化学的方法を説明します。

Abstract

>jove_content<脊椎動物のゲノムで起こるシトシン塩基(5-メチルシトシン、5mC)のメチル化は、通常、転写サイレンシングに関連しています。5-ヒドロキシルメチルシトシン(5hmC)、5-ホルミルシトシン(5fC)、および5-カルボキシルシトシン(5caC)は、最近発見された修飾シトシン塩基で、5mCの酵素酸化によって産生されますが、その生物学的機能は比較的不明瞭なままです。生化学的手法から抗体ベースの技術まで、さまざまな生物学的システムにおけるこれらの修飾のゲノム分布と全体的な含有量を研究するために、多くのアプローチが採用されてきました。これらのアプローチのいくつかは、これらの修飾された形態の5mCの定量的評価に有用ですが、これらの方法のほとんどは、それらの機能的役割を正しく理解するために必要な、さまざまな細胞タイプにおけるこれらのDNA修飾の分布に関する空間情報を提供しません。ここでは、修飾型シトシンの免疫化学的検出のための高感度な方法を紹介します。この方法は、これらのエピジェネティックなマークをタンパク質系統マーカーと共検出することを可能にし、それらの核局在の研究に用いることができるため、さまざまな実験状況におけるそれらの潜在的な生物学的役割の解読に貢献します。

Introduction

DNA中のシトシン塩基（5MC）のメチル化は^{、1サイレン}シング転写に関連した脊椎動物のゲノム中に見出される主要なエピジェネティックなマークを表します。 5MC導入及び維持DNAメチルトランスフェラーゼ^2-5によって、ゲノムインプリンティング、X染色体不活性化、細胞の分化および発達^3,6を含む生物学的プロセスの数に重要な役割を果たすことが示されているされている。従って、の破壊を5MCゲノムパターンは疾病^{7、8月11日}の番号に関連付けられています。開発と疾患における5MCの役割を理解する上での進歩にもかかわらず、まだ、このマークを開発し、成体組織では削除されているかほとんどわかっていないされています。 ^{15、14、13、DNA}脱メチル化の潜在的なメカニズムは、最近¹²アクティブおよびパッシブ脱メチル化機構を含む提案されているいくつかの。十から十一の転座enzymによって媒介5MC逐次酸化の製品の発見5- hydroxylmethylcytosineとしてエス（tet1 / 2/3）（5hmC）、真核生物のDNA ^{16、17、18、19、5-formylcytosine（5FC）、}および5-carboxylcytosine（5caC）は、それらの中間体として機能することができるかどうかを推測を促し自分の権利¹³におけるDNA脱メチル化のプロセスや行為などの安定したエピジェネティックなマーク。塩基除去修復の成分は、チミンDNAグリコシラーゼ（TDG）は、DNA ¹⁹から5FCと5caCの両方に結合し、除去することができることを実証しながら^、20はアクティブなDNA脱メチル化における修飾5MC誘導体の役割を示唆しています。 5FC / 5caCが転写調節²⁹におけるこれらのマークの潜在的な関与にRNA IIの処理能力の点の速度を調節することができることを示す最近の証拠。 5MCの酸化形態のこの潜在的な生物学的な重要性を、生化学的及び抗体ベースの技術の範囲は、それらのゲノム分布とグローバルコンテンツ^{16、19-24を}研究するために使用されてきました。

トンのほとんどを考えます彼脊椎動物の器官は、異なる細胞型で構成され、修正されたシトシン塩基の分布は、組織及び細胞型特異^{16-18、20、23、25〜27}であることが、種々の組織における酸化5MC誘導体の空間分布を決定することは重要な実験になりますそれらの生物学的機能を発表するために必要なタスク。生化学的および抗体ベースのアプローチのほとんどは、異なる組織および細胞型における5MCの修飾された形態の分布に関するあらゆる空間情報を提供していません。これとは対照的に、免疫化学ベースの技術は5MC ²⁸とその酸化誘導体²⁰の空間分布および核局在化を評価するための迅速なツールを提供することができます。それを言われて、マウスゲノム¹⁸における5FC（各10 ⁶シトシン20）と5caC（各10 ⁶シトシン3）の報告が非常に低い存在量は、標準的な免疫化学のための重要な課題です。

ここに、我々は、堅牢提供し、高感度免疫化学的方法および哺乳動物の脳組織中のシトシンの酸化型の迅速な検出を説明します。信号増幅ステップと結合されたペルオキシダーゼ結合二次抗体を組み込むことによって、この方法は、5FCと5caCの非常に少量を検出する課題を回避します。また、この技術は、効果的にこれらのエピジェネティックマークの生物学的機能を解明する他のアプローチを補完し、系統特異的マーカーとシトシンの修飾形態を同時検出するために用いることができます。

Protocol

全ての動物-関与手順はノッティンガムの倫理審査委員会の大学に従って行われました。

1.免疫染色のための適切な組織標本を選択します

1. 以前²⁵記載されているように、野生型CD1マウス胚および成体の脳組織のパラフィン包埋切片を生成します。方法^25の免疫染色のために4％ホルムアルデヒド（FA）または4％パラホルムアルデヒド（PFA）のいずれかで固定した脳組織切片を使用します。
   注：パラフィン包埋組織切片の使用は、抗体標識の前に脱脂が必要です。 2を用いた治療ので - DNA変性のためのプロトコルで用いられる4 M塩酸（HCl）、最も抗原回復戦略とは互換性がありません、我々は、タンパク質と5MC酸化誘導体の同時検出のために冷凍のかミクロトームセクションのいずれかを使用することをお勧めしますマーカー。

2.脱ロウパラフィン包埋組織切片< / P>

1. 実行中のクラスII安全キャビネット内で、室温で、キシレンで満たされたコプリンジャー中で10分間2回ずつパラフィン包埋組織切片を洗浄します。
   注：これは、不完全なパラフィン除去が一貫性のない染色パターンにつながることができますように新鮮なキシレンを使用することが重要です。
2. 脱ワックス後、急速に95、75、そして室温で10分間、50％エタノール中で連続して洗浄す​​ることにより組織切片を再水和します。

3.固定および冷凍のとミクロトーム切片の透過処理

1. RTで15分間、氷冷4％PFAまたは4％FAのいずれかでそれらを置くことによって再水和した組織切片を修正しました。
2. 室温で5分間、PBS中のセクション（リン酸緩衝生理食塩水）を洗浄することにより、過剰な固定液を除去します。
3. RTで30分間PBXが充填されたコプリンジャー（PBS中0.5％トリトンX-100）中に配置することによって、組織切片を透過。 PBT（PBS中0.01％のTween 20）でまもなくセクションを洗浄することにより、過剰なPBXを削除してください。

jove_title "> 4。オキシナイト5MC誘導体の免疫染色

1. DNAの脱プリンをRTで60分間、2 N HCl中で透過処理セクションを配置します。
   注：より効率的なDNA変性へのHCl（ 例えば、4 N）の鉛のより高い濃度が、これらはDAPIでオキシ-MCSの同時検出のために互換性がありません。
2. 塩酸を中和するために、室温で30分間、10mMトリス - 塩酸（pH8.5）中のセクションを配置します。また、PBS中で5分ごとにセクションを3回洗浄します。室温で5分間PBTのセクションをインキュベートします。
3. 慎重に組織切片を静かにスライドを振盪することにより、任意のステップで完全に乾燥させることなく、組織切片を周囲から液体を除去します。セクションに触れずにセクションを取り囲むように、疎水性バリアペンを使用してください。
   注：疎水性バリアペンは、組織を染色するために必要な抗体の量を減少させ、複数のセクションがdifferenで染色することができるようにすることができます同じスライド上のトン抗体。
4. 湿潤チャンバー中、室温で1時間ブロッキング溶液（PBS中10％のウシ血清アルブミン）100μl中のセクションをインキュベートします。
   注：このステップをスキップする修正されたシトシン塩基を染色の効率に影響を及ぼさないであろう。
5. マウスモノクローナル抗5hmC 5,000希釈液と1：湿潤チャンバー内で室温で1時間、ブロッキング溶液中で、ウサギポリクローナル抗5caC一次抗体を1000倍希釈液100μlで組織切片をインキュベートします。必要に応じて別の方法として、4℃で一晩のインキュベーションを行います。
   注：一次抗体なしで処理セクションは、染色手順のためのような適切な陰性対照を提供することができます。 5caC、5FCと5hmC ²⁰に富むポスト交尾マウス胚性脳切片を陽性対照として使用することができます12.5日。
6. コップで5分間、PBTで満たされたコプリンジャーに各3回セクションを洗浄することにより過剰な抗体を除去RTで林の瓶。
   注：洗浄溶液の体積を増加させるバックグラウンド染色を減少させることができます。
7. 過剰PBTを削除して、必要に応じて、PBTは、疎水性の障壁を弱めることができ、界面活性剤が含まれているとして、疎水性のバリアペンで再びセクションを取り囲みます。
8. ヤギ抗ウサギHRP結合抗体の400希釈および1：ブロッキング溶液中のロバ抗マウス555結合抗体の400倍希釈してください。
9. 湿潤チャンバー中、室温で1時間、 ステップ4.9からの二次抗体混合物100μl中の組織切片をインキュベートします。
10. 室温で5分間ずつPBT 3回満たしコプリンジャーに組織切片を洗浄してください。
11. 室温で2分間、チラミドシグナル増幅バッファ内のチラミドの200希釈：1100μlの組織切片を置きます。
12. すぐに、PBTで5分間スライドをそれぞれ3回洗浄することによって過剰チラミド溶液を除去。
13. 気をつけyが過剰PBTを削除し、 すぐに （材料リストを参照してください）封入剤のドロップを持つセクションをカバーしています。
14. 静かに組織切片上のカバースリップを置き、 すぐにマニキュアでカバーガラスをシール。
15. 顕微鏡検査の前に、いくつかの時間のために4℃で組織切片を保管してください。 （ - 40X倍率10）405、488および/または555 nmで蛍光顕微鏡下で調べます。

Results

脳組織切片における5hmCの分布を決定するために、我々は、具体的には、このマークが相互作用するが市販の抗5hmC抗体を用いて、有糸分裂後ニューロン、NeuNのためのマーカーで、このエピジェネティック修飾の同時検出を行っていない変更された他の形態でシトシン^20、25。成人の脳における5hmCと5caC分布の免疫組織化学的分析は、著名な5hmC染色がのNeuN陽性細胞との共局在のに対し、NeuNの陰性のグリア細胞は、ゲノム5hmC（ 図^1）20のより低いレベルを有することが明らかになりました。

我々は最近のTet-依存5MC酸化が神経幹細胞^（NSC）20の系統の仕様の間に動作可能であることを示しました。 NSCは、5FCと5caCに免疫化学的に検出不可能であるにもかかわらずニューロンのAに向けてのNSC分化の初期段階で顕著な免疫染色​​を示します NDグリア系統。これらの両方のマークは、一過性の早期のニューロンとグリア分化²⁰のマーカーの出現と同時に蓄積します。我々はグリア分化誘導の3日目にNSCの固定の文化にグリアマーカーGFAPと、このマークの共染色を行ったNSCを分化に5caCの分布を決定すること。 NSC又は成熟アストロサイトとは異なり（データは示さず）、我々は、これらの培養物においてGFAPを発現する細胞（ 図^2）20の比較的大きな割合で強い5caCシグナルを観察しました。

DAPI（青）で対比成人脳組織内のNeuN（赤）と5hmC（緑）の図1.共同免疫染色。個々のチャネルおよびマージされた図が示されています。スケールバーは25μmです。「ブランク>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

グリア分化の3日目でのNSCの培養におけるGFAPと5caCの図2.共免疫染色。個々のチャネルおよびマージされた図が示されています。スケールバーは20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

いくつかの組織で5MC酸化誘導体、5FCと5caCの報告低量は、標準的な免疫化学プロトコルのために重大な制限を提示するであろうが、ペルオキシダーゼ結合二次抗体の取り込みは、固定組織や細胞におけるこれらのシトシン修飾の検出を可能にした（ 図2） 。しかし、チラミド溶液と最適なインキュベーション時間は、信号強度とチラミドベースの信号増幅の期間の間に直線関係が詳細については、観察されたチラミドシグナル増幅キットの各個々のバッチについて実験的に最適化する必要がありアルメイダらを参照してください。2012年²⁶ 。さらに、信号/背景比が著しく過剰な抗体の効率的な除去を可能にするためにコプリンジャー中での洗浄を実施することによって向上させることができます。チラミド溶液とのインキュベーション後、直ちにDにPBT溶液中で洗浄することにより反応を停止することが重要ですecreaseバックグラウンド染色。セクションでは、手順の間の任意の時点で乾燥できるようにするために重要ではありません。

DNAの脱プリン化の効率は、37℃で脱プリン反応を行うことにより改善することができます。それは、二本鎖DNAと排他的に相互作用する4 N HClを使用しての代わりに2ながらNは、DAPIで共染色することを認めていないDNAの脱プリン化のために4 N HClを用いて5MCの修飾された形態の染色を強化します。

この技法は、検出可能な、それは5MCまたはその酸化誘導体の絶対的なレベルを評価するために使用することができないシトシン塩基の修飾された形態の強固な半定量的評価を提供することができません。したがって、我々は他の補完の使用をお勧めしますが、量的には^{16、19 -24に}近づきます。哺乳類のゲノム中の5MC酸化誘導体の発見以来、いくつかのアプローチは、それらの生物学的役割^{16、19-24を}研究するために開発されてきました。これらapproaが、CHESは5MC酸化誘導体の絶対レベルを決定する上で貴重なことができ、彼らは彼らの空間分布^20、26に関する情報を提供していません。我々は成功し、異なる細胞型で5MC酸化誘導体の空間分布及び局在をマッピングするために、ここで説明した方法を使用していました現像及び成人の脳²⁰の

その空間分布^20を明らか^にすることにより、この技術は、生物学的影響および5MCのこれらの修飾された誘導体は、細胞の分化、開発および疾患を含む検出することができ、様々な生物学的状況における5MCの酸化誘導体の運命を理解するために重要であることができます。また、ここで説明する方法は、tyramiと異なるインキュベーション時間で（染色の強度に比例する）、ペルオキシダーゼ反応の動態を評価することにより、異なる組織における5MCの酸化誘導体の半定量的な評価を与えることができますデ^26。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coplinジャー	コールパー	マーUY-48585-30	ガラスは
キシレン			クラスII安全キャビネットで使用
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	フィッシャーサイエンティフィ	12821680	pH 7.5、使用前にろ過
4%パラホルムアルデヒド(PFA)	シグマアルドリッチ	P6148	一度作られたら-20 °で保存することができます。数ヶ月間の分注中のC4
%ホルムアルデヒド (FAです)	シグマ アルドリッチ	F8775	一度作られたものは -20 度で保存できます。数ヶ月間の分注中のC
エタノール、無水変性、組織学的グレード	シグマ アルドリッチ	64-17-5	95、75、50% PBS
0.01% トゥイーン 20 PBS	シグマ アルドリッチ	P9416	PBT
0.5% トリトン X-100 PBS	シグマ アルドリッチ	X100	PBX
2 N HCl	シグマ アルドリッチ	71826	注意 非常に有毒
100 mM トリス-HCl	プロメガ	H5121	pH 8.5
に調整 疎水性バリアペン	Abcam	ab2601	免疫組織化学用
スライド水分チャンバー	科学機器研究所	197-BL
抗 5mC マウス抗体	Diagenode	C15200081	モノクローナル一次抗体
アンチ 5hmC 抗体	アクティブ モチーフ	39791	ウサギ ポリクローナル一次抗体
抗5caC抗体	Active Motif	61225	rabbit polyclonal 一次抗体
ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ二次抗体	Dako	K1497
555-congjuated ヤギ 抗マウス抗体	Molecular probes	A-11005	二次抗体
10% BSA	Sigma Aldrich	A9418	ブロッキング溶液
22 x 32 mm ガラスカバースリップ	BDH	406/0188/24
チラミドシグナル増幅システム	パーキン・エルマー	NEL741001KT	他のフルオロチョメ標識二次抗体は、オキシ-5mCの共検出に使用できます。
DAPIを使用した封入剤	Vector Labs	H-1200
無色マニキュア
チキン ポリクローナル抗GFAPポリクローナル抗体	Thermo Scientific	PA5-18598	1:400
抗NeuNマウスモノクローナル抗体	Merck milipore	MAB377B	1:400