Method Article

T細胞への抗原提示細胞による抗原の提示を研究するための抗原駆動性大腸炎モデルの開発

DOI:

10.3791/54421

⸱

September 18th, 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

In This Article

Summary

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この抗原駆動型大腸炎モデルでは、赤色蛍光タンパク質を発現するOT-II CD4+ T細胞を、単核食細胞(MP)で緑色蛍光タンパク質を発現するRAG-/-マウスに養子として導入しました。宿主は、シアン蛍光タンパク質(CFP)に融合したオボアルブミンタンパク質(OVA)を発現する大腸菌(E.coli)で挑戦されました。

Abstract

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炎症性腸疾患(IBD)は、消化管(GIT)に影響を与える慢性炎症です。この疾患に関与する免疫学的メカニズムを研究する最良の方法の1つは、大腸炎のT細胞移植モデルです。このモデルでは、免疫不全マウス(RAG-/-レシピエント)を、健康な野生型宿主由来のナイーブCD4+ T細胞で再構成します。

このモデルは、腸の炎症が永続するが、定義された抗原に依存しない場合に、病気や慢性炎症につながる最も初期の免疫学的事象の調査を可能にします。疾患プロセスにおける抗原提示細胞(APC)の潜在的な役割を研究するには、定義された共生由来抗原が大腸炎につながる抗原駆動型疾患モデルを持つことが有用です。したがって、抗原駆動型大腸炎モデルが開発されました。このモデルでは、OVAタンパク質の特定のエピトープのみを認識できるOT-II CD4+ T細胞を、CFP-OVA発現大腸菌にチャレンジしたRAG-/-宿主に転写します。このモデルにより、固有層におけるAPCとT細胞との間の相互作用を調べることができます。

Introduction

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腸は、外部環境にさらされる体の最大の表面です。常駐微生物の広大な配列は、腸内細菌叢（または微生物叢）を形成するために、ヒトの腸にコロニーを形成します。これは、最大100000000000000微生物細胞からなると推定され、生物学1-3で知られている最も人口密度の高い細菌の生息地の1を構成しています。 GITでは細菌は、彼らが生き残ると4を掛け腸のニッチを植民地化。リターンでは、微生物は、そのゲノム1でエンコードされていない追加の機能的特徴を持つホストを付与します。例えば、微生物は、上皮細胞の増殖を刺激し、ホストは自分で作り出すことができないビタミンを生成し、代謝を調節し、病原体4-6から保護します。この有益な関係を考えると、いくつかの著者は、人間が「超生物」または細菌とヒト遺伝子7,8のミックスである「holobionts」であることを示唆しています。 （人間の）ホスト上の微生物叢の有益な影響を考えると、腸管免疫系はルーメンでその存在を可能にするだけでなく、腔側9-11から侵入する病原体を殺すために共生微生物を容認する必要があります。腸管免疫系は無害と潜在的に有害な管腔の微生物を区別するためのメカニズムを開発しました。しかし、これらのメカニズムはまだよく12を理解されていません。腸の整合性を維持することは寛容と免疫の13の間のバランスを保つために厳密に調節免....

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Protocol

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マウスは、ウルム大学（ウルム、ドイツ）の動物施設において、特定病原体フリー（SPF）条件下で飼育し、維持しました。全ての動物実験は、地元の動物の使用およびケア委員会と国立動物福祉法のガイドラインに従って行いました。

pCFP-OVAプラスミドの1建設

  1. テンプレートとして42プラスミドPCI-OVA（アンピシリン耐性）を使用して、プライマーOva_SpeI_fw（3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 '）とOva_ClaI_rev（3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5'）37を使用して、フルサイズのOVA遺伝子を増幅します。特定OVAプラスミドを生成するためにプライマー及びベクターのSpeIとClaI制限部位を使用して、市販のファージミッドベクターにPCR産物（ すなわち OVAコード配列）をクローニングします。
  2. プラスミドパッド1を使用して、強力な構成的プロモーターP ハイパーとともにCFPをコードする遺伝子を増幅 -cCFPテンプレートとプライマーCFP_SacII_fw（3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 '）として....

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Results

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抗原駆動型大腸炎モデルEを確立するために、 大腸菌株 CFPの遺伝子は、ニワトリオボアルブミンタンパク質のコード配列に融合され、融合構築物は、強力な構成的プロモーターP ハイパー （ 図1A）の制御下で発現されるプラスミドを含むように構成されています。蛍光顕微鏡は、組換えE.ことを示しています大腸菌 pCFP-OVAではなく、親のE.大腸菌 DH10Bは、CFP（ 図1B）を発現します 。 E.を生産する CFP-OVA- 大腸菌 インビトロで OT-II細胞を活性化し、 大腸菌とは対照的に、IFN-γ産生を誘導することができますCFPを発現している大腸菌株のみ（ 図2）。

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Discussion

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他のすべてのモデルと同様に、上記の抗原駆動型大腸炎モデルは、技術を実行研究者が知っておく必要がありますいくつかの問題を提示することができます。 OT-IIホストで/レッド+ CD4 + T CD62L +細胞を注入すると、研究者は腹腔内に注射針を挿入することは非常に穏やかで注意しなければなりません。これを怠ると、死亡につながる可能性がマウスの腸、または任意の病気を誘発しない細胞の皮下投与が裂ける可能性があります。

一般的に、マウスは、細胞移入後の最初の週の間に体重が増加します。研究者は、各重みの時点で同時にマウスを計量し、手順全体を通して同じ計量バランスを使用する必要があります。時には、実験マウスは、実験の開始時に、その重量は18グラムは、以下の場合は特に、消耗症候群の兆候を発症しません。しかしながら、これらの動物はmightはまだ巨視的評価の下で重要な腸の炎症を開発しています。

遺伝的に改変された細菌で作業する場合、汚染が発生する可能性があります。これらの問題.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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JHNは、スイス国立財団（SNSF 310030_146290）の支援を受けています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LBブロス、ミラー(ルリア-ベルターニ)Difco244620
ロータリーシェイクReiss Laborbedarf e. K.モデル 3020 GFL
2 mm ギャップ クーベット Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
グリセロールSigma-AldrichG5516-100ML
遺伝子パルサー Xcell システム BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
アンピシリンSigma-AldrichA9393-5G
SOC ミディアムSigma-AldrichS1797-100ML
高純度プラスミド分離キットRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH &Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
氷酢酸Sigma-Aldrich537020 
ゲルチャンバー PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
Loading DyeThermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder サーモフィッシャーSM0312
臭化エチジウム溶液Roth GmbH&Co. KG2218.3
写真記録システム Decon Science Tech GmbHDeVision G 
DNAシーケンシング MWG-Biotech GmbH
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)BiochromL182-50
蛍光顕微鏡 ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
ニトロセルロース膜 Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
エレクトロブロッター Biometra GmbH846-015-600
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
抗オボアルブミン抗体 Abcamab181688
抗ウサギIgG HRPシグマ アルドリッチA0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratePierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell StrainersFischer Scientific 08-771-2
塩化アンモニウムSigma-Aldrich254134-5G
トリスベースSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ T アイソレーションキット ミルテニーバイオテック130-093-227 
MACS LSカラム Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS カラム Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS セパレーターMiltenyi Biotec130-042-302
MiniMACS セパレーターMiltenyi Biotec130-042-102
MACS マルチスタンドMiltenyi Biotec130-042-303
給餌針 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
ホルマリン溶液、中性緩衝、10%Sigma-AldrichHT501128
パラフィンSigma-Aldrich1496904
HematoxylinSigma-AldrichH9627
EosinY Sigma-Aldrich230251 
ジチオスレイトールSigma-AldrichD9779 
コラゲナーゼ VIII 型Sigma-AldrichC-2139
ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 培地AppliChemA2044, 9050
アジ化ナトリウムSigma-Aldrich438456
マウス BD Fc BlockBD Pharmingen553141
FITC 標識モノクローナル抗体 Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
APC標識モノクローナル抗体結合CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACSキャリバー BD Biosciences
FCS Express V3 ソフトウェアDeNovo
Meta 走査型共焦点顕微鏡 ツァイスLSM 710 
Zeiss WorkstationZeissLSM 7
Zeiss ZEMソフトウェア Zeissv4.2.0.121
Maxisorpイムノプレート NUNC, Roskilde442404
Streptavidin 結合アルカリホスファターゼJackson Immuno Research016-050-084
アルカリホスファターゼ基質 4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物Sigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECANマイクロプレート-ELISAリーダーTecan
EasyWinソフトウェアTecan
DNase I 組換え4536282001
Carl

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (200....

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