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方法論記事

T細胞への抗原提示細胞による抗原の提示を研究するための抗原駆動性大腸炎モデルの開発

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DOI:

10.3791/54421

⸱

2016年9月18日

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

この記事について

サマリー

この抗原駆動型大腸炎モデルでは、赤色蛍光タンパク質を発現するOT-II CD4+ T細胞を、単核食細胞(MP)で緑色蛍光タンパク質を発現するRAG-/-マウスに養子として導入しました。宿主は、シアン蛍光タンパク質(CFP)に融合したオボアルブミンタンパク質(OVA)を発現する大腸菌(E.coli)で挑戦されました。

要約

炎症性腸疾患(IBD)は、消化管(GIT)に影響を与える慢性炎症です。この疾患に関与する免疫学的メカニズムを研究する最良の方法の1つは、大腸炎のT細胞移植モデルです。このモデルでは、免疫不全マウス(RAG-/-レシピエント)を、健康な野生型宿主由来のナイーブCD4+ T細胞で再構成します。

このモデルは、腸の炎症が永続するが、定義された抗原に依存しない場合に、病気や慢性炎症につながる最も初期の免疫学的事象の調査を可能にします。疾患プロセスにおける抗原提示細胞(APC)の潜在的な役割を研究するには、定義された共生由来抗原が大腸炎につながる抗原駆動型疾患モデルを持つことが有用です。したがって、抗原駆動型大腸炎モデルが開発されました。このモデルでは、OVAタンパク質の特定のエピトープのみを認識できるOT-II CD4+ T細胞を、CFP-OVA発現大腸菌にチャレンジしたRAG-/-宿主に転写します。このモデルにより、固有層におけるAPCとT細胞との間の相互作用を調べることができます。

概要

腸は、外部環境にさらされる体の最大の表面です。常駐微生物の広大な配列は、腸内細菌叢（または微生物叢）を形成するために、ヒトの腸にコロニーを形成します。これは、最大100000000000000微生物細胞からなると推定され、生物学1-3で知られている最も人口密度の高い細菌の生息地の1を構成しています。 GITでは細菌は、彼らが生き残ると4を掛け腸のニッチを植民地化。リターンでは、微生物は、そのゲノム1でエンコードされていない追加の機能的特徴を持つホストを付与します。例えば、微生物は、上皮細胞の増殖を刺激し、ホストは自分で作り出すことができないビタミンを生成し、代謝を調節し、病原体4-6から保護します。この有益な関係を考えると、いくつかの著者は、人間が「超生物」または細菌とヒト遺伝子7,8のミックスである「holobionts」であることを示唆しています。 （人間の）ホスト上の微生物叢の有益な影響を考えると、腸管免疫系はルーメンでその存在を可能にするだけでなく、腔側9-11から侵入する病原体を殺すために共生微生物を容認する必要があります。腸管免疫系は無害と潜在的に有害な管腔の微生物を区別するためのメカニズムを開発しました。しかし、これらのメカニズムはまだよく12を理解されていません。腸の整合性を維持することは寛容と免疫の13の間のバランスを保つために厳密に調節免疫恒常性を必要とします。免疫恒常性のアンバランスは、炎症性腸疾患（IBD）3,14などの腸疾患の誘導に寄与する。

クローン病（CD）および潰瘍性大腸炎（UC）：IBDの2つの主要なタイプがあります。これらの疾患を有する患者は、通常、直腸出血、重度の下痢や腹痛15,16苦しみます。 IBDの一つの原因はまだです不明ですが、遺伝的要因の組み合わせ、環境の影響および調節不全免疫応答が疾患の発症15のための重要な事象であるかもしれません。

IBDの動物モデルは、50年以上にわたって使用されてきました。過去数十年間、新しいIBDモデル系は、IBD 17,18の病因に関するさまざまな仮説をテストするために開発されてきました。慢性大腸炎の最もよく特徴付けられたモデルは、T細胞ホメオスタシス19,20の破壊を誘導し、T細胞移入モデルです。 16,21このモデルは、（ - / -およびSCIDマウスのようなRAGなど）TおよびB細胞を欠いている宿主に免疫したマウスからのナイーブT細胞を転送することを含みます。このモデルにおける疾患の発症は、下痢の存在を評価することによって、3-10週間モニター身体活動の減少、及び体重減少です。これには、消耗症候群16と呼ばれています。健康なマウスと比較して移植したホストの大腸組織は、シックですR、16短いと重いです。 T細胞移入モデルを使用して、T細胞集団は、IBD 22の病因に寄与することができる方法の異なる理解することが可能です。 T細胞移入モデルでは、抗原特異的様式で疾患プロセスにおけるAPCおよびT細胞の間の相互作用を分析しません。骨髄細胞およびリンパ系細胞間の相互作用は、腸の炎症23の発症の原因であることが示されています。 IBDの多くの側面が明らかにされてきたが、病気の開発につながる初期のイベントは、まだ明確に理解する必要があります。

微生物転写大腸炎の非存在下で24を確立できないことが示されています。最近、いくつかの説は、IBDは、共生細菌25に対する免疫応答の結果であることを示唆しています。著者らは、共生細菌は、遠位腸内の炎症を誘導するのに不可欠であることも提案しています26。生殖無料（GF）動物では腸管免疫系は、一般的に27,28を低下しているが、完全に有能な腸管免疫系29の開発における特定の病原体を含まない細菌の結果の混合物とこれらのマウスの植民地化。したがって、微生物叢は、いずれかの素因または腸の炎症30,31の開発から保護するメカニズムとして、IBDの病因における重要な要素であると思われます。現在の理論は、遺伝的素因の患者32に、IBDは、腸内毒素症と呼ばれる、微生物の不均衡の結果であることを示唆しているが、それは明らかではないが、まだ腸内毒素症は、原因や病気12の結果である場合。 IBDの発症における微生物の役割を考慮すると、 インビトロ実験において CD4 + T細胞は、腸内細菌33,34でパルスしたAPCにより活性化することができることを示しました。

また、より抗原ことが示されています例えば、Eなど、さまざまな共生細菌種、 大腸菌、バクテロイデス、ユーバクテリウムおよびプロテウスは 、CD4 + T細胞35を活性化することができます。これは、T細胞への細菌抗原の提示は、IBDの開発のために重要であることを示しています。疾患過程における微生物叢によって誘導される複数の抗原の複雑さを軽減するために、 大腸菌株は、OVA抗原を産生するように作成されています。転写性大腸炎は、RAGにOVA特異的T細胞を注射することによって誘導した- / - OVAを発現する大腸菌を保菌動物大腸菌 。

このモデルは、CX 3 CR1 +議員、結腸粘膜固有層（CLP）36の主要な細胞サブセットは、転送37を大腸炎の間にCD4 + T細胞と相互作用していることを示唆している最近の証拠に基づいています。国会議員は、その樹状突起36、38,39を使用して、細菌のような、粒子状抗原のための腸管腔をサンプリング。以前の研究国会議員はまた、腸管腔40,41に導入され、このようなOVAなどの可溶性抗原を、取ることができることを実証しました。 CLPにおけるCX 3 CR1 + MPの存在量を考えると、これらの細胞が管腔細菌をサンプリングし、CD4 T細胞と相互作用することが可能です。 E.が定着OVA特異的CD4 + T細胞を移植したマウスの共焦点イメージングコリ CFP-OVAは、CX 3 CR1 + MPSは抗原駆動型大腸炎の開発中OT-II CD4 + T細胞と接触していることを示しています。このモデルは、腸のAPCおよび唯一の腸管内腔における特定の抗原を発現する細菌に特異的なT細胞間の抗原提示プロセスの研究を可能にします。

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プロトコル

マウスは、ウルム大学（ウルム、ドイツ）の動物施設において、特定病原体フリー（SPF）条件下で飼育し、維持しました。全ての動物実験は、地元の動物の使用およびケア委員会と国立動物福祉法のガイドラインに従って行いました。

pCFP-OVAプラスミドの1建設

  1. テンプレートとして42プラスミドPCI-OVA（アンピシリン耐性）を使用して、プライマーOva_SpeI_fw（3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 '）とOva_ClaI_rev（3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5'）37を使用して、フルサイズのOVA遺伝子を増幅します。特定OVAプラスミドを生成するためにプライマー及びベクターのSpeIとClaI制限部位を使用して、市販のファージミッドベクターにPCR産物（ すなわち OVAコード配列）をクローニングします。
  2. プラスミドパッド1を使用して、強力な構成的プロモーターP ハイパーとともにCFPをコードする遺伝子を増幅 -cCFPテンプレートとプライマーCFP_SacII_fw（3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 '）として（クロラムフェニコール耐性）43とCFP_SpeI_rev（3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5'）37。
  3. プライマーとベクトル37のSpeIおよびSacI制限部位を使用して、特定のOVA-プラスミド（アンピシリン耐性）にCFPをコードする遺伝子をクローニングします。これは、OVA-コード配列からCFP-コーディングの間に6グリシン残基のスペーサーを導入しています。

大腸菌 pCFP-OVAの2建設

  1. 一晩ロータリーシェーカー上で37℃で好気的にルリア・ベルターニ（LB）培地100mlに大腸菌株DH10Bを成長させます。
  2. -80℃でグリセロールストックとストアを作成するために、グリセロール、200μlの細菌培養物の800μLを混ぜます。
  3. LB培地5ml中のグリセロールストックから大腸菌株DH10B50μlのを追加し、ロータリーシェーカーのオベに37℃で好気的にそれらを育てますrnight。
  4. 回転式振盪で37℃でLB培地250 mlのバッフル付き1Lの三角フラスコに培養物を移します。
  5. 600nmでの光学密度に細菌の成長（OD 600）を 0.5の後、30分間氷上で文化を冷やします。 4℃で10分間、5000×gで細菌を遠心。
  6. 氷冷10％グリセロールおよび遠心分離細菌の100mlで4℃で再懸濁菌で10分間、5000×gで氷冷滅菌H 2 Oおよび遠心細菌の100mlで再懸濁菌10分間5000×gで4℃で。二回この最後のステップを繰り返します。
  7. 最後の洗浄工程の後、10％グリセロール700μlの細菌を再懸濁します。 -80℃で液体窒素とストア内の50μlのアリコートを凍結します。
  8. 氷上で50μlのアリコートを解凍し、予め冷却エレクトロポレーションキュベット（2mmの電極間距離）に移します。
  9. 50μlのE.へのプラスミドDNA（100 ngの）の5μLを追加大腸菌 aliquoTS。 25μF、200オーム（Ω）および2.5 kVでの単一パルスでエレクトロポレーションを実行します。
  10. 1ml中に再懸濁細菌予め温めたSOC培地（5 G / Lの酵母抽出物、2つのG / Lトリプトン、10mMの塩化ナトリウム、2.5mMの塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム、10mMの硫酸マグネシウム）し、37℃でインキュベート好気的に1時間。
  11. プレートアンピシリンを100μg/ mlのを補充したLB寒天プレート上の細菌（LB寒天の100ミリリットルに100 mg / mlでアンピシリン株式の100μlを添加）、37℃で一晩好気的に培養します。
  12. アンピシリン100μg/ mlのを補充したLB寒天プレートでの単一コロニーと再ストリークそれらを選択してください。 37℃で好気的に一晩インキュベートします。
  13. 単一コロニーを選択し、プラスミド単離のためのアンピシリンを100μg/ mlを補充したLB培地10mlに一晩、それらを成長させます。 「市販のプラスミドミニプレップキットを使用し、30μlののdH 2 O（蒸留水）でプラスミドDNAを溶出メーカーによると; sのプロトコル。制限分析及びDNA配列決定37,42,43によってプラスミドを確認します。
  14. E.の陽性クローンの文化を設定します100mlのLB培地で大腸菌 pCFP-OVAは、アンピシリン100μg/ mlのを補充しました。ロータリーシェーカーで一晩に37℃で好気的に成長します。
  15. -80℃で純粋なグリセロールおよび店舗の200μlで細菌培養物の800μLを混ぜます。
  16. 室温（RT）で10分間5,000×gで一晩培養の残りを遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中でペレットを再懸濁します。スライドガラス上に懸濁液10μlを置き、カバースリップでそれをカバーしています。
  17. CFP-OVAの発現蛍光（450 nmでのCFP励起、480nmにおける発光）を確認するために、標準的な蛍光顕微鏡でサンプルを観察します。倍率400倍で始まる細菌を分析します。
  18. 遠心分離機10分間5,000×gで、室温で一晩培養からの細菌の1ミリリットル。 40μlの中にペレットを再懸濁PBSと10分間95℃で沸騰します。
  19. 10分間30,000×gでサンプルを遠心分離し、ウェスタンブロット分析37のために上清を使用します。 400：1に希釈したウサギ起こし抗OVAポリクローナル抗体を使用してください。

OT-IIの3世代/レッドマウス

  1. OT-II /レッドマウス37を生成するために、赤色蛍光タンパク質を発現するメス/オスのマウスでオス/メスOT-IIマウス（両株市販）を渡ります。

4.脾臓細胞の単離

  1. 市販されている（誘導のために5％まで）任意のハロゲン化エーテルの吸入による麻酔後に頚椎脱臼によりOT-II /レッドマウスを安楽死させます。
  2. マウスの左優れた腹部をカットするはさみを使用してください。この腹部の下脾臓（暗赤色の色の楕円形）があります。それを削除するには、ハサミやピンセットを使用してください。
    1. OT-II /レッドマウスの脾臓を抽出し、100を介して渡します単一細胞懸濁液を得るために、1mlシリンジのプランジャーを用いて、50mlチューブに位置決めミクロンの細胞ストレーナー。 PBS 10mlで二回ストレーナーを洗浄し、1％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を補充しました。
  3. 室温で5分間、390×gで細胞懸濁液を遠心。赤血球を溶解するために予め温めた溶解緩衝液（144 mMのNH 4 Cl を 、17 mMトリス、pH値= 7.2）5mlでペレットを再懸濁。 37℃で10分間インキュベートします。
  4. PBS 25mlでサンプルを洗浄し、1％FBSを補充しました。室温で5分間、390×gで遠心分離します。 10mlのPBS、1％FBSを補充した中でペレットを再懸濁します。
  5. ノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞数を計測します。 0.4％トリパンブルー溶液10μlを用いて細胞懸濁液10μlを混ぜます。 1-2分間インキュベートします。
    1. 染色した細胞の10μlの血球計数器室を埋めます。 1室とdeterminの2乗4 1×1ミリメートルで、顕微鏡下で細胞を数えます平方あたりの細胞の平均数を電子。生存細胞は白、死細胞が青く表示されます表示されます。細胞の数を決定するために/希釈倍に細胞数を掛けmLです。 2-4象限がカウントされている場合は、象限の数で割ます。

前記CD4 + CD62 L + T細胞濃縮

  1. 負または正の選択の原理を用いた磁気分離キットを介してCD4 + CD62L + T細胞を脾臓細胞を豊か。ここでは、CD4 + T細胞を分離し、さらにCD4 + T細胞プール内のCD62L +集団を濃縮するための正の選択を使用するネガティブ選択を使用しています。
    注：ネガティブ選択手順は、（ここでは全CD4陰性細胞）を単離せずする細胞は、磁気ビーズに結合された特異的抗体で標識されます。カラムの洗浄工程の間、彼らはEASIできるように、CD4 + T細胞は、カラムを通過しますlyが収集しました。正の選択手順細胞では、磁性マイクロビーズに結合された適切な抗体で標識された単離することができました。カラムの洗浄​​工程の間に標識された細胞は、カラムに滞在し、それらは、磁界からカラムを除去し、緩衝液を用いて洗浄することによって回収することができます。
  2. 負の選択手順については、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）を補充した冷PBS40μlの10 7総脾臓細胞を再懸濁します。 （非CD4 + T細胞を特異的結合する抗体）10磁気分離キットに付属のビオチン標識抗体カクテルのμlを添加して、氷上で15分間インキュベートします。
    1. 冷PBSの30μlを添加し、0.5％BSAおよび抗ビオチンマイクロビーズを20μlを加えたもの。氷上で20分間インキュベート。
    2. 10mlのPBSを5分間390×gで0.5％BSAおよび遠心機を補充したサンプルに追加します。二回、この手順を繰り返します。 0.5％BSを補った冷PBS 1 mlに細胞を再懸濁A.
    3. 磁場中での負の選択手順のための特定の列を配置し、冷PBSの3ミリリットルで洗い流しカラムに0.5％BSAを添加。カラムに細胞懸濁液を添加し、冷PBS 3mlで3回洗浄し、0.5％BSAを補充しました。
    4. 5分間、390×gで流出物の遠心分離細胞。カラムを通過した流出物は、非標識CD4 + T細胞が含まれています。 0.5％BSAを補充した1mlのPBSでペレットを再懸濁し、細胞をカウントします。
    5. ノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞数を計測します。 0.4％トリパンブルー溶液10μlを用いて細胞懸濁液10μlを混ぜます。 1-2分間インキュベートします。
      1. 染色した細胞の10μlの血球計数器室を埋めます。 4 1×1ミリメートルで1室の2乗を顕微鏡下で細胞をカウントし、平方あたりの細胞の平均数を決定します。生存細胞は白、死細胞が青く表示されます表示されます。細胞/ mL乗算セルの数を決定するために、希釈倍リットル番号。 2-4象限がカウントされている場合は、象限の数で割ます。
  3. 正の選択手順については、10 7プリ富むCD4 + T細胞画分あたりのCD62Lマイクロビーズの10μlを添加します。氷上で15分間インキュベートします。
    1. 10mlのPBSを5分間390×gで0.5％BSAおよび遠心機を補充したサンプルに追加します。二回、この手順を繰り返します。冷PBS500μlの中に再懸濁し、0.5％のBSAを補充しました。
    2. 磁場中で負の選択手順のための特定の列を置き、カラムに0.5％BSAを補充した冷PBSを500μlですすいでください。カラムに細胞懸濁液を追加し、冷PBSを500μlで3回洗浄、0.5％BSAを添加。
    3. 磁場から列を削除し、適切な収集チューブの上に置きます。カラムに0.5％BSAを補充した1mlのPBSを加え、CD4 + CD62L + T細胞を洗い流しますsがしっかりと列にプランジャーを押すことによってカラムに保持しました。
      注：分離されたCD4 + CD62L + T細胞は、現在、in vivo実験などの下流のアプリケーションのための準備ができています。 CD4 + CD62L + T細胞単離キットの製造業者の指示に従って、マイクロビーズは毒性ではありません。小さいサイズ（50nm程度）のため、彼らは細胞を活性化しないと、彼らは、細胞表面エピトープを飽和しません。したがって、単離された細胞は、大腸炎37,44,45を誘導するために免疫不全マウスに導入することができます。
    4. ノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞数を計測します。 0.4％トリパンブルー溶液10μlを用いて細胞懸濁液10μlを混ぜます。 1-2分間インキュベートします。
      1. 染色した細胞の10μlの血球計数器室を埋めます。 4 1×1ミリメートルで1室の2乗を顕微鏡下で細胞をカウントし、平方あたりの細胞の平均数を決定します。生存細胞のappea白、死細胞が青く見えるrを。細胞の数を決定するために/希釈倍に細胞数を掛けmLです。 2場合 - 4象限がカウントされている、象限の数で割ます。

抗原駆動性大腸炎の6誘導

  1. - / -マウスCX 3 CR1 GFP / + X RAGの腹腔内に3×10 5 OT-II /レッドCD4 + CD62L + T細胞を注入します。抗原特異的な大腸炎の誘導のために、Eを投与します大腸菌 pCFP-OVA切歯の背後に強制飼養または経口点滴注入によって動物あたり100μlのPBS中1×10 8コロニー形成単位（CFU）の用量で、一日おきに。
  2. 移植されたマウスとその臨床状態（便中の血液の存在、便の硬さとマウスの活動）の体重を毎週二回監視します。

病理組織学的検査のための7組織サンプル

  1. 目から組織サンプルを取りますマウスの電子大腸、中性緩衝ホルマリン（10％）に修正し、以前に36,46を説明したようにパラフィンに埋め込 ​​むことができます。
  2. セクションミクロトーム上のパラフィンサンプル、スライド上にマウントし、H＆E染色47,48を行います。
  3. 以前47,48公開されている大腸の組織像を分類：ノーマル（スコア0）;穏やかな大腸炎（スコア1）、中等度の大腸炎（スコア2）および重度の大腸炎（スコア3）。

結腸固有層細胞の8の単離

  1. 市販されている（誘導のために5％まで）任意のハロゲン化エーテルの吸入による麻酔後に頚椎脱臼により移植したマウスを安楽死させます。
  2. 腹を上に向けて動物を下に置きます。尿道口に前方の皮膚をつかむためにピンセットを使用します。胸に脚の付け根から腹側正中線に沿って皮膚をカットするはさみを使用してください。裏側の皮膚を引きます。
  3. 透明腹膜筋肉壁を通してカットし、体腔を開きます。盲腸49に肛門から行くコロンを特定します。 2四肢を切断して、任意の脂肪から組織を解放します。
  4. 解剖ハサミを使用して縦方向にコロンを開きます。 PBSの25ミリリットルを含むペトリ皿に破片や粘液を除去するために、1％FBSを補充した結腸組織を振るためにピンセットを使用してください。 8ミリメートル片 - 5にコロンをカット。
  5. 洗浄緩衝液の20ミリリットルを含む50 mlチューブに大腸セグメントを配置します。洗浄緩衝液は、500ミリリットルのDPBS、10mMのHEPESおよび5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）が含まれています。
  6. 最大速度で30秒間チューブをボルテックス。
  7. 200rpmで10分間振とうしながら37℃の水浴中で結腸セグメントを有するチューブをインキュベートします。
  8. インキュベーション後、最大速度で30秒間チューブをボルテックス。
  9. 上清を捨て、洗浄緩衝液の20ミリリットルを含む新しい50ミリリットルチューブに組織サンプルを配置します。繰り返しは6-9 3回ステップ
  10. 秒を破棄upernatantsとPBSの25ミリリットルを含むペトリ皿に組織サンプルを配置します。残留上皮細胞を除去するために、穏やかに数秒間ペトリ皿で​​組織サンプルを振るためにピンセットを使用してください。この手順を3回繰り返します。
  11. 2×2ミリメートル2個に結腸組織をカットし、ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）クロストリジウムヒストリチカムからの0.5mg / mlのコラゲナーゼタイプVIIIおよびDNアーゼIの10 U / mlの培地10ml中でインキュベートすることにより、それらを消化。
  12. 最大速度で30秒間チューブをボルテックス。
  13. 200rpmで35分間振盪しながら37℃の水浴中で大腸の断片をインキュベートし、最大速度で30秒ごとに5分間チューブをボルテックス。
  14. インキュベーションの終了時に最大速度で30秒間チューブをボルテックス。
  15. 新しい50ミリリットルチューブ上に配置さ70μmのセルストレーナーに通して消化された断片を収集します。
  16. 5分間400グラムでDPBSと遠心分離機の20ミリリットルを追加することにより、サンプルを洗ってください。その後、再懸濁トンDPBSの1ミリリットルで彼の細胞。
  17. ノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞数を計測します。 0.4％トリパンブルー溶液10μlを用いて細胞懸濁液10μlを混ぜます。 1-2分間インキュベートします。
    1. 染色した細胞の10μlの血球計数器室を埋めます。 4 1×1ミリメートルで1室の2乗を顕微鏡下で細胞をカウントし、平方あたりの細胞の平均数を決定します。生存細胞は白、死細胞が青く表示されます表示されます。細胞の数を決定するために/希釈倍に細胞数を掛けmLです。 2-4象限がカウントされている場合は、象限の数で割ます。

FCM分析のための9.外染色

  1. 遠心分離機390×gでCLP細胞を5分。 FACS A 1mlに細胞を再懸濁（PBS、1％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを補充しました）
    注：アジ化ナトリウムは、非常に有毒です。これは、低血圧、低体温、頭痛の痙攣や死を引き起こす可能性があります。 0（アジ化ナトリウムの希釈溶液1.0％へ0.1）は、通常、ユーザーに特別な危険性を提示していないが、彼らは目や皮膚刺激物です。実験室のコートと使い捨てニトリル手袋の二重のペアを身に着けている間そのため、唯一の化学フードにアジ化ナトリウムを使用します。
  2. FACS Aに希釈のFcγRIII/ II CD16 / CD32に対するモノクローナル抗体（mAb）2.4G2（0.5〜1μgのモノクローナル抗体/ 10 6細胞）を用いて室温で15分間、細胞をインキュベート
  3. 390×gで細胞と遠心5分にFACS Aの200μLを加えます。二回、この手順を繰り返します。 4℃で20分間関連mAbの0.5 ngの/ 10 6細胞で細胞をインキュベートします。 FACS Aに抗体を希釈
  4. 390×gで細胞と遠心5分にFACS Aの200μLを加えます。二回、この手順を繰り返します。 FACS Aの100μlのサンプルを再懸濁し
  5. - / - 37フローサイトメーターでOT-II /レッドCD4 T細胞で再構成したマウスCX 3 CR1 GFP / + X RAGからT細胞を分析します。
  6. は、市販のソフトウェアを使用してデータを分析します。

10.共焦点顕微鏡分析

  1. OT-II /レッドCD4 + CD62L + T細胞で再構成したりしませCX 3 CR1 GFP / +マウスの結腸を分析し、Eの1×10 8 CFUで一日おきに経口供給大腸菌株DH10B pCFP-OVA。
  2. ハサミやピンセットを用いて、マウスからコロンを削除します。解剖ハサミを使用して縦方向にそれを開きます。
  3. はさみを使用して、結腸サンプル5-8ミリの部分をカットし、ガラススライド上に置き、カバースリップでカバーしています。
  4. 40 / 1.30倍の倍率で共焦点顕微鏡による大腸サンプルを分析します。
  5. 509 nmで488 nmでの励起および発光を有するフィルタセットを使用して、緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識したCX 3 CR1 + MPを検出します。
  6. 58で554 nmでの励起および発光を有するフィルタセットを使用して、赤色タンパク質を発現するCD4 + T細胞を検出します6ナノメートル。
  7. 480 nmで450 nmでの励起および発光に設定されたフィルタを使用して大腸菌 pCFP-OVAを検出します。
  8. 関心領域を定義し、以前の共局在の分析を実行するために50に説明したように散布図を生成します。 Mandersとピアソンの係数に応じてオーバーラップ係数：2つの異なる式を使用してください。

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結果

抗原駆動型大腸炎モデルEを確立するために、 大腸菌株 CFPの遺伝子は、ニワトリオボアルブミンタンパク質のコード配列に融合され、融合構築物は、強力な構成的プロモーターP ハイパー （ 図1A）の制御下で発現されるプラスミドを含むように構成されています。蛍光顕微鏡は、組換えE.ことを示しています大腸菌 pCFP-OVAではなく、親のE.大腸菌 DH10Bは、CFP（ 図1B）を発現します 。 E.を生産する CFP-OVA- 大腸菌 インビトロで OT-II細胞を活性化し、 大腸菌とは対照的に、IFN-γ産生を誘導することができますCFPを発現している大腸菌株のみ（ 図2）。

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ディスカッション

他のすべてのモデルと同様に、上記の抗原駆動型大腸炎モデルは、技術を実行研究者が知っておく必要がありますいくつかの問題を提示することができます。 OT-IIホストで/レッド+ CD4 + T CD62L +細胞を注入すると、研究者は腹腔内に注射針を挿入することは非常に穏やかで注意しなければなりません。これを怠ると、死亡につながる可能性がマウスの腸、または任意の病気を誘発しない細胞の皮下投与が裂ける可能性があります。

一般的に、マウスは、細胞移入後の最初の週の間に体重が増加します。研究者は、各重みの時点で同時にマウスを計量し、手順全体を通して同じ計量バランスを使用する必要があります。時には、実験マウスは、実験の開始時に、その重量は18グラムは、以下の場合は特に、消耗症候群の兆候を発症しません。しかしながら、これらの動物はmightはまだ巨視的評価の下で重要な腸の炎症を開発しています。

遺伝的に改変された細菌で作業する場合、汚染が発生する可能性があります。これらの問題...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

JHNは、スイス国立財団（SNSF 310030_146290）の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
LBブロス、ミラー(ルリア-ベルターニ)Difco244620
ロータリーシェイクReiss Laborbedarf e. K.モデル 3020 GFL
2 mm ギャップ クーベット Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
グリセロールSigma-AldrichG5516-100ML
遺伝子パルサー Xcell システム BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
アンピシリンSigma-AldrichA9393-5G
SOC ミディアムSigma-AldrichS1797-100ML
高純度プラスミド分離キットRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH &Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
氷酢酸Sigma-Aldrich537020 
ゲルチャンバー PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
Loading DyeThermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder サーモフィッシャーSM0312
臭化エチジウム溶液Roth GmbH&Co. KG2218.3
写真記録システム Decon Science Tech GmbHDeVision G 
DNAシーケンシング MWG-Biotech GmbH
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)BiochromL182-50
蛍光顕微鏡 ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
ニトロセルロース膜 Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
エレクトロブロッター Biometra GmbH846-015-600
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
抗オボアルブミン抗体 Abcamab181688
抗ウサギIgG HRPシグマ アルドリッチA0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratePierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell StrainersFischer Scientific 08-771-2
塩化アンモニウムSigma-Aldrich254134-5G
トリスベースSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ T アイソレーションキット ミルテニーバイオテック130-093-227 
MACS LSカラム Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS カラム Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS セパレーターMiltenyi Biotec130-042-302
MiniMACS セパレーターMiltenyi Biotec130-042-102
MACS マルチスタンドMiltenyi Biotec130-042-303
給餌針 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
ホルマリン溶液、中性緩衝、10%Sigma-AldrichHT501128
パラフィンSigma-Aldrich1496904
HematoxylinSigma-AldrichH9627
EosinY Sigma-Aldrich230251 
ジチオスレイトールSigma-AldrichD9779 
コラゲナーゼ VIII 型Sigma-AldrichC-2139
ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 培地AppliChemA2044, 9050
アジ化ナトリウムSigma-Aldrich438456
マウス BD Fc BlockBD Pharmingen553141
FITC 標識モノクローナル抗体 Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
APC標識モノクローナル抗体結合CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACSキャリバー BD Biosciences
FCS Express V3 ソフトウェアDeNovo
Meta 走査型共焦点顕微鏡 ツァイスLSM 710 
Zeiss WorkstationZeissLSM 7
Zeiss ZEMソフトウェア Zeissv4.2.0.121
Maxisorpイムノプレート NUNC, Roskilde442404
Streptavidin 結合アルカリホスファターゼJackson Immuno Research016-050-084
アルカリホスファターゼ基質 4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物Sigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECANマイクロプレート-ELISAリーダーTecan
EasyWinソフトウェアTecan
DNase I 組換え4536282001
Carl

参考文献

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