空気圧液滴操作プラットフォームのマルチ塩基多型の視覚比色検出

サマリー

この作品は、空気圧、液滴操作プラットフォーム上で多塩基多型を検出するためのシンプルで視覚的な方法を提示します。提案手法では、多塩基多型の液滴操作および検出を含む全体の実験は、高度な機器の助けを借りずに、23℃付近で行うことができます。

要約

多塩基多型（MNP）を検出するための簡単かつ視覚的方法は、開放面に空気圧液滴操作プラットフォーム上で行いました。比色DNA検出へのこのアプローチは、金ナノ粒子プローブ（AuNPプローブ）のハイブリダイゼーションを媒介成長に基づいていました。 AuNPの成長の大きさおよび構成は、プローブとハイブリダイズしたDNAサンプルの数によって支配されます。ナノ粒子の特定のサイズ - 及び形状に依存する光学特性に基づいて、プローブへの試料DNA断片におけるミスマッチの数を判別することが可能です。試験は、それぞれの試薬およびDNAサンプルを含む液滴を介して行われ、柔軟なPDMSベースの超疎水性膜の制御された空気圧式吸引搬送空気圧プラットフォーム上で混合しました。液滴が無い側effを持つ生体適合性の高い提案されている空気圧プラットフォーム上でオープン表面上で同時にかつ正確に配信することができます液滴内部のDNAサンプルの電気ショック療法。 2つの推奨方法を組み合わせ、多塩基多型は、空気圧、液滴操作プラットフォーム上で視覚で検出することができます。追加の機器が必要とされません。最終的な結果にプラットフォーム上での液滴をインストールからの手順は、既存の方法よりもはるかに少ない、5分未満を取ります。また、この複合MNP検出アプローチは、マクロシステムのものよりも著しく小さい各操作にのみ10μlのサンプル容量を必要とします。

概要

DNA配列中の単一塩基対の差である一塩基多型（SNP）は、最も一般的な遺伝子変異の一つです。現在の研究では、SNPは、疾患のリスク、薬効及び遺伝子機能に影響を与えることにより、個人の副作用と関連していることを報告する^。1,2最近の研究はまた、二または多点変異（多塩基多型）は、特定の疾患と個体を引き起こすことを明らかにしました病気の影響の違い^。3,4塩基多型の検出は、疾患をプレスクリーニングで、したがって不可欠です。配列特異的オリゴヌクレオチドの迅速な検出のための簡単で効率的な方法が非常に過去20年間に開発された。DNAの突然変異を同定するために^1,5の現在のアプローチは、典型的には^6,7、 などのプローブ固定化、蛍光標識、ゲル電気泳動などの手順を含みますしかし、これらの方法は、一般的に長い分析プロセス、expenを必要としますSIVE機器、よく訓練された技術者、およびサンプルおよび試薬の大幅な消費。

体積に対する表面積の比率が大きいとユニークな物理化学的特性を持つナノ粒子は、特定のバイオマーカーのための高感度かつ安価な検出プラットフォームとして理想的な材料です。金ナノ粒子（AuNP）が広くオリゴヌクレオチドプローブを用いて変更されるので、それらの優れた能力のDNA検出のために使用される^。8-10 SNP検出技法もAuNPを用いて開発された^....

プロトコル

MNPを検出するために、1の方法

注：このセクションでは、金ナノ粒子のハイブリダイゼーション媒介成長に基づいて、MNPを検出するための手順を説明します。

1. プローブDNA濃度100μMで（5'-チオールGAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 '）溶液を調製します。
2. プローブDNA修飾されたAuNP（AuNPプローブ）粒子を準備します^。21
   注：ここで使用されるボリュームは、プローブDNA修飾されたAuNP（AuNPプローブ）粒子の要件に依存します。多数の実験を実施する上で、したがって依存しています。私たちは通常、スペアとして過剰AuNPプローブ粒子を準備します。このような工程で使用されるボリュームは調整可能で柔軟性のあります。
   1. 濃度1 OD / mlの金ナノ粒子の溶液にプローブDNA（ステップ1.1で調製した100μMの、）（13ナノメートル、17 nM）を追加します。
   2. ドデシル硫酸ナトリウムの最終濃度をもたらす（NAC ₁₂ H ₂₅ SO _{4、SDS）、}およびリン酸緩衝液（PBS）、0.01％および0.01 M、respectivelY。
   3. SDSを維持しながら、20分後、0.01％の塩化ナトリウム（2 M）及びPBS（0.01 M）の溶液を0.05 Mに塩化ナトリウム（NaCl）の濃度をもたらし、20分間....

結果

この研究では、3つのDNAサンプルは、AuNPプローブのDNAハイブリダイゼーションにより媒介される増殖を介して、検出の簡単かつ新規な方法を用いて試験しました。プローブDNAと3種類のDNAサンプルの配列は、具体的には、cDNAは議定書のステップ1に記載されている、TMDNA（3塩基対ミスマッチDNA）、およびSixMDNA（6塩基対ミスマッチDNA）を（完全に相補的DNAをプローブします）。ここで試験されたDNA試料のプローブのミスマッチは、DNA試料の中央セグメントの両方である。 図6は、多様な濃度のDNAサンプルの成長AuNP溶液の色を示します 。完全にマッチしたDNA（cDNA）を、溶液の色相は、DNA濃度の増加に伴って透明に次にインジゴにピンクから変化し。 TMDNAのために、ソリューションの色が濃い紫色にピンクから行くし、その後インディゴし、SixMDNAのため、色はDNA濃度の増加に伴って濃いピンクにピンクから行きます。独立したD NAサンプルはAuNPの様々な成長の大きさとソリ.......

ディスカッション

このプロトコルでは、MNPを検出するための単純な比色法は、マイクロ遠心管中で0.11から0.50μMの範囲の濃度で実施することができます。さらに、提案されたMNPの検出方法は、DNAのスクリーニングおよび他の生物医学的用途のための高い可能性を有する空気圧液滴操作プラットフォーム上で実施されます。実際には、サンプルのDNA濃度を検出可能な範囲は、オペレーティングプラットフォームの混合効率に依存します。合体した液滴が完全に混合されることを保証するために、このプロトコルで重要なステップは、合体した液滴の大きさに依存する空気吸引（圧力および周波数）の制御です。完全に相補的サンプルDNAとのミスマッチのサンプルDNAとのハイブリダイゼーションの親和性の相違は、長いDNA配列断片について肉眼で区別することは困難です。この検出技術の限界は、従って、試料DNAの断片長です。長いDNとサンプルについて配列サイズまたは成長AuNPの立体配座は、種々のミスマッチを含有する多様なDNAサンプルと同様です。プローブのDNAサンプルの不一致は、このプロトコルで中間セグメントに表示されます。同一の長さとサンプルDNAのホモマーのミスマッチにより、ミスマッチの位置はま.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PDMS	ダウ コーニング	SYLGARD 184
卓上彫刻機	ローランド DG	EGX-400
レーザー切断機	ユニバーサル レーザー システムズ インク	VLS 3.50
酸素プラズマ処理システム	Femto Science Inc. Korea	CUTE-MPR
電磁弁			自家真空
ポンプ	ULVAC KIKO, Inc.	DA-30D
13-nm AuNP溶液	TAN Bead Inc., Taiwan	NG-13
DNA (with 5'-end labeled thiol)	MDBio, Inc., Taiwan
phosphate buffered saline (PBS)	UniRegion バイオテクノロジー、。台湾	PBS001-1L
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	JTベー	カー4095-04
ヒドロキシルアミン溶液(NH2OH)	Sigma-Aldrich	467804
クロロアウリン酸(HAuCl4)	Sigma-AldrichG4022
塩化ナトリウム(NaCl)
ボルテックスミキサー	デジシステム・ラボラトリー・インスツルメンツ株式会社	VM-2000
遠心分離機	Hermle Labortechnik GmbH。	Z 216 MK

シリーズ