方法論記事

設計と低コストの使用、自動Morbidostat細菌の適応進化のための抗生物質選択下

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DOI：

10.3791/54426

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2016年9月27日

 ,  ,  , 
1Electrical Engineering, National Tsing Hua University

この記事について

サマリー

私たちは、薬物濃度を動的に調整することにより、抗生物質の薬剤耐性の特性評価を可能にする、低コストで設定可能なモルビドスタットについて説明します。このデバイスは、多重化されたマイクロ流体プラットフォームと統合できます。このアプローチは、実験室での抗生物質耐性研究のためにスケールアップすることができます。

要約

私たちは、抗生物質耐性の進化の経路を特徴付けるための低コスト、設定morbidostatについて説明します。 morbidostatは、継続的に細菌の増殖を監視し、動的にそれらが薬剤耐性を獲得するように進化として常に細菌に挑戦する薬物濃度を調整した細菌培養装置です。デバイスは、〜10ミリリットルの作業容量を備え、完全に自動化し、光学密度測定、中および薬物送達のためのマイクロポンプが装備されています。プラットフォームを検証するために、我々はMG 1655 大腸菌でトリメトプリム耐性の段階的買収を測定し、細胞の形態や抗生物質感受性を調査するために多重化されたマイクロ流体プラットフォームとデバイスを統合しました。アプローチは、抗生物質耐性の実験室での研究にスケールアップ、および代謝工学および他の細菌培養実験における歪みの改善のために進化を適応するために拡張することができます。

概要

最初の抗生物質ペニシリンの導入以来、微生物の抗生物質耐性は、世界的な健康問題1へと発展しています。抗生物質耐性の獲得が遡及的in vivoで研究することができるが、これらの実験の条件は、多くの場合、全体の進化2を通じて制御されていません。あるいは、適応実験室進化は抗生物質3から、環境ストレスまたは選択圧下微生物種の分子進化を明らかにすることができます。最近、抗生物質耐性の多くのよく制御された進化実験は、抗生物質耐性の出現を明らかにしています。たとえば、オースティンのグループが適切に設計されたマイクロ流体区画環境4の急速な出現を示しました。最近開発されたmorbidostatは、薬剤選択圧5,6の下で体系的突然変異を誘発します。 morbidostat、微生物セレク連続してほぼ一定の人口を維持するために抗生物質濃度を調整ションデバイスは、微生物学7,8で使用される変動試験から大きな進歩です。変動試験では、抗生物質を高濃度で注入し、生存変異体をスクリーニングし、計数します。その代わりに、morbidostat中の微生物は、常に挑戦し、複数の変異を獲得しています。

morbidostatはケモスタット、微生物集団9を希釈しながら継続的に栄養を供給することにより一定の人口を維持し、1950年にNovickとSzliardによって発明された培養装置と同様に動作します。導入以来、ケモスタットが進められ、改善されました。現在のマイクロ流体ケモスタットは、ナノリットルおよび単一セルの容量に達しています。しかしながら、これらのデバイスは、多くの変異事象10,11を有する大きな細胞集団を必要とする適応進化の実験には適していません。最近、ミニ〜10ミリリットルの作業容量でケモスタットもリットル規模のバイオリアクターおよびマイクロ流体ケモスタット12,13の間のギャップを埋めるために開発されてきました。

ここでは、抗生物質耐性の研究のための低コスト、自動化されたmorbidostatの設計および使用を提示します。提案されたモジュールは、最小限のハードウェア要件を有する微生物実験室でシェーカーインキュベーター内で使用することができます。オープンソースのファームウェアも簡単に、このような代謝工学3として適応進化の特定の用途に合わせて調整されます。最後に、morbidostatは、抗生物質感受性試験14用の多重マイクロ流体プラットフォームに統合されています。

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プロトコル

Morbidostatデバイスの1アセンブリおよび予備試験

  1. Morbidostatの組立
    1. 18 G注射針で培養バイアルのキャップ上の3つの穴をパンチ。 〜の長さは7センチポリエチレンチューブの3枚をカット。キャップにポリエチレン管のこれらの3枚を挿入します。
    2. ポリジメチルシロキサン（PDMS）の混合物のためのキャストとして機能するようにキャップの縁をラップするためにテープを使用してください。爪楊枝を使って手動で攪拌することにより、コンポーネントの5グラムと150ミリリットルのプラスチック容器中のPDMSのB成分の0.5グラムを混ぜます。 10ミリリットルの注射器に混合物をロードします。
      1. シリンジでキャップにPDMSの混合物を注ぎます。 70℃のオーブン中で8時間、PDMSを硬化させるために全体のキャップを焼きます。
    3. はんだごてを持つカーボン抵抗と24ゲージワイヤとLEDのカソードとLEDのアノードを半田付けします。 24 G線と680Ωカーボン抵抗を半田付けします。電気テープを使用して、ワイヤ接続を絶縁してください。
    4. そう24 G線と100kΩのカーボン抵抗と受光素子のエミッタと光検出器のコレクタlder。電気テープを使用して、ワイヤ接続を絶縁してください。
    5. 培養バイアルホルダーに発光ダイオードを配置します。 補足 図2に回路図に従うことで、それはLEDはIR（ 例えば、携帯電話のカメラ）を検出することができるデジタルカメラを使用して動作することを確認し、5Vの電源で発光ダイオードと電源を接続します。
    6. 文化バイアルホルダーに光検出器を配置します。 補足 図2の回路図に従うことにより、電子制御基板の両端の電圧を測定する光検出器抵抗器の両側にワイヤ5 V.接続の電力供給と光検出器と電源を接続します。
    7. 磁気攪拌手段としての冷却ファンのシャフトの磁石を接着。 alignmことに注意してください培養バイアルにファンのシャフトの耳鼻咽喉科、培養バイアルと磁石の間の間隔は、磁気攪拌装置の適切な機能のために非常に重要です。
    8. マイクロポンプ、培地ボトル、および廃液ボトル用のシリコンチューブの対応する片に培養バイアルのポリエチレンチューブの各部分を接続します。 1時間ポンプの電源をオンにし、ポンプ速度を決定するために、培養バイアルに培地ボトルから圧送される総体積を測定。典型的なポンピング速度は、希釈率D = 0.33時間-1培養バイアルの12ミリリットル作業容量のために対応〜4ミリリットル/ hrで、でなければならないことに注意してください。
    9. 中規模（34センチメートルのx 34センチメートルX 43.5センチメートル）シェーカーインキュベーターにアセンブリ全体を置きます。
  2. Morbidostatを事前テスト
    1. 磁気撹拌棒をテストするためのモーターを起動するために、5Vまで冷却ファンの電源電圧を設定します。攪拌動作が視覚的に検査することができることに注意してください。ドライブ電圧冷却ファンモータは正確にパルス幅変調（PWM）によって制御されていますよ。
    2. 野生型E.一連の準備典型的には、キャリブレーションのための0.07から0.3までの範囲の600nmでの光学密度を有する大腸菌サンプル 。テストEを置きます培養バイアル中の大腸菌サンプルとは、光検出器の電圧を記録します。
      1. 場所〜100プレートリーダーで同じサンプルμlの光学密度を記録。検量線をプロットするために、光学濃度データ対の光検出器電圧を使用してください。一般的に、光学濃度の1単位の変化は、ここで使用されるバイアス方式と光検出器で〜7.6 Vの変化に対応していることに注意してください。

2. Morbidostatを実行します

  1. 毎日の実験を開始する前の準備
    1. セクションのようなデバイスを形成するための注入口用の内径1/32インチ、外径3/32インチと3超耐薬品性のタイゴンチューブで培養バイアルを準備1.1と補足図1インチ
    2. M9最少培地（0.2％グルコース）およびトリメトプリム（TMP）は、薬物含有培地を準備します。培地、培地ボトル、薬の媒体ボトル、廃液ボトル、および121℃のオートクレーブ中で培養バイアルを滅菌します。
      注：TMPは、後の表1に濃度を達成するために使用される媒体を含むTMP薬物がオートクレーブ処理されていないストック溶液です。
  2. Morbidostatを実行します
    1. 実験の初日に、凍結された野生型の1ミリリットルE.を解凍室温で5分間コリ MG1655細胞及びM9の成長培地の〜12ミリリットルを含む培養バイアルに細胞120μlのを転送します。最初の日の後、凍結したE.の1ミリリットルを解凍大腸菌 5分と転送含む新しい培養バイアルに細胞を120μlのために前日からの細胞〜M9の増殖培地12ミリリットル。
    2. シェーカーインキュベーターをオンにして、テンペを設定無振とうしながら30℃までrature。
    3. マイクロポンプ、磁気攪拌装置、および光学密度測定をオンにしてmorbidostat操作を開始します。
      注：動作中、フィードバック閾値アルゴリズムは、薬剤注入を制御するために使用されます。測定された光学濃度が予め設定された閾値を超えた場合に、薬剤注入ポンプがオンになると培地ポンプはオフになります。それ以外の場合は、薬剤注入ポンプがオフのままと培地ポンプがオンになっています。
    4. 微生物の増殖があることを確認する時間までの時間からの電圧を監視します。
      注：ため凍結融解サイクルの、E。大腸菌細胞は、毎日の成長時〜4時間の遅延を示します。
    5. 〜23時間後、その供給電圧をオフにすることで、マイクロポンプを停止し、培養バイアルを取り出します。培養バイアルに15％グリセロールを添加し、貯蔵のために-80℃で試料を凍結します。
    6. 繰り返しは、2.2.5に2.2.1を繰り返します。
96ウェル形式でル "> 3。抗生物質感受性測定

注：抗生物質耐性のレベルを決定するために、96ウェル形式でプレートリーダーで成長速度測定を行います。

  1. 5分間、室温で毎日凍結サンプルを解凍し、〜15ミリリットルM9培地を含む培養バイアルにセルの15μLを移します。彼らは〜0.1に到達した600nmでの光学密度まで増殖することを可能にします。 1 mlのボトルに15 mlで分割し、 表1に示すように、所望の薬物濃度を得るために、この段階でTMPの薬剤を加えます。
  2. ステップ3.1からのサンプルの200μLを取り、プレートリーダーで各ウェルに配置し、それらを12時間5のために成長することができます。波長600nmにおける光学密度を測定中に自動的に記録されます。
    注：各データ点は、三連の測定値を記録し、データの整合性を確保するために平均化されます。時間に対する光学濃度のデータはbはできEは、成長速度を得るために使用されます。
  3. IC 50を得るために、薬物濃度に対する成長速度データをプロットします。 IC 50は、成長率が最大増殖速度5の五十パーセントされる薬剤濃度として定義されることに留意されたいです。

4.単一細胞形態とマイクロ流体デバイスにおける抗生物質感受性測定

  1. 他の場所で15説明したように、PDMSから多層ソフトリソグラフィーを介してマイクロ流体デバイスの製造を行います。
    1. 制御フロー層用のフォトレジスト金型を作るために、フォトリソグラフィを使用してください。制御層のために、ベアシリコンウェーハ上に金型を製造するためにネガ型フォトレジスト（〜15μmの高さ）と、ポジ型フォトレジスト（〜8μmの高さ）を使用することに注意してください。
    2. それぞれ、制御層と流動層のために1：1と20：5の架橋比を有するPDMSの混合物を準備します。任意の気泡を除去するために真空下でデシケーター中に混合物を入れて、1時間。
    3. （TMCS）蒸気をトリメチルクロロシランするために、シリコンウエハ上に制御層レジストの金型を公開します。 PDMS混合物を鋳造することにより~6ミリメートルの厚さの制御層を作る（架橋比5：1）制御層フォトレジスト型のシリコンウェハ上に。オーブン中で1時間、80℃で40分間、制御層を焼きます。
    4. （：1、スピン速度60秒間3,000rpmで架橋比20で）流れ層のフォトレジストモールド上のPDMS混合物をスピンコートすることにより流動層を作ります。オーブン中で1時間、80℃で30分間流動層を焼きます。
    5. 希望のチップサイズに制御層（一般的に3センチメートル×2センチ）を切断し、手動制御層を剥離するカミソリの刃を使用してください。流動層の上に制御層を配置し、実体顕微鏡下でそれらを揃えます。オーブンで一晩中80℃で整列アセンブリを治します。その後、残余のTMCSを溶解するために5時間プラスチック容器に脱イオン水250ml中にアセンブリを浸漬。
    6. その後、20gの針を用いて入口穴パンチブランクPDMS層でコーティングされたガラススライドに全体のエラストマーを結合：で40秒間空気プラズマ処理によって（PDMS比5架橋30秒間、1の回転速度を2,000rpmで） 1.2トルの空気圧。
    7. PDMSからの細胞毒性効果を減少させるために80℃で36時間、大規模なベーキングを行います。この焼成工程は、細菌細胞への毒性を最小限にするために重要であることに注意してください。
  2. チップ生育実験について
    1. マイクロ流体デバイスにロードする前に、1時間1時間とM9培地を脱イオン水で洗い流します。
    2. 5分間、室温で毎日凍結サンプルを解凍し、新鮮なM9培地で新しい試験管に接種します。 37℃で一晩振とう培養器内のサンプルを配置します。
    3. M9培地で微生物サンプル10倍に希釈し、5 psiで微生物サンプル容器を加圧することにより、マイクロ流体デバイスにロードします。そして、TMP薬をロード5 psiで薬剤培地容器を加圧することにより、チップへの媒体。 15分間のマイクロ流体チップ上の2つのチャンバ間のマイクロメカニカルバルブを作動させることにより、微生物と薬物との間の混合を実行します。
    4. 倒立顕微鏡に搭載された顕微鏡インキュベーター内でマイクロ流体チップを置きます。成長チャンバー内の倒立顕微鏡に搭載されたCCDカメラで8時間毎に時間の細胞画像を取得します。
    5. 細胞画像データ18上の閾値アルゴリズムを介して細胞数を計算するために、カスタムプログラムのスクリプトを使用します。セル番号データが3マイクロ流体チャンバーの上に一般的に平均化されることに注意してください。

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結果

上記のmorbidostatは、図1に図式化されている。実験的進化、抗生物質感受性試験および細胞形態のチェックなどの一般的なmorbidostat操作を、Eに検証されましたトリメトプリム（TMP）にさらさコリ MG1655文化、一般的に使用される抗生物質5,6。 TMPは、薬物耐性に非常に特徴的な段階的な増加を誘導し、そして突然変異はジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子の周囲にクラスタ化されます。したがって、TMPはmorbidostat動作を検証するための非常に効果的な標準薬です。毎日、微生物が予め設定された光学密度の閾値より上に成長し、 図2aに示すように、薬物注射をトリガすることが期待されます。薬物注射は、成長を阻害し、その結果、光学密度を減少させることが期待されます。いくつかの試験の実行は、最適な薬物濃度を決定するために必要とされ得ます。経験則として、我々はincreas薬剤媒体が成長を抑制しないことを発見した後に5倍の薬剤媒体の濃度を電...

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ディスカッション

低コストの構成要素からの低フットプリントmorbidostat装置が示されています。デバイスが登録された薬剤耐性レベルの増加は、以前の報告5のものと一致しています。薬剤耐性の進化の研究のために設計され、デバイスは、他の多くの実験に潜在的に適用可能です。まず、薬剤誘発性の変異の包括的なデータベースは、臨床的に関連する抗生物質の大規模なセットのために確立することができます。例えば、複数の薬剤耐性の進化の経路は、単に実験に用いた薬物の数を増加させることによって調べることができます。ここで報告されたモジュールの主な利点は、異なる実験条件の下で大規模な、平行実験を可能にする、柔軟な構成可能です。

概念は、マイクロ流体の測定で実証されたが、調査力は、流体技術23を用いてマイクロ流体工学を組み合わせることによって改善することができます。あたりのコスト測定（規模の経済）が劇的に低下し、試薬の消費量と低減労力によって低減されます。ここでは、単一細胞形態のデータは、マイクロ流体プラットホームから抽出することができます。最近では、単一細胞のマイクロ流体形態のテ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者は、理論解析と数値シミュレーションにおける有益な議論と助けを提供してくださったSze-Bi Hsu教授とZhenzhen氏に感謝します。Y. T. Y.は、科学技術省からの助成金番号MOST 103-2220-E-007-026およびMOST 104-2220-E-007-011、および国立清華大学からの助成金番号103N2042E1からの資金援助に感謝したいと思います。 104N2042E1、および 105N518CE1。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
環境シェーカーインキュベーターBioSanES-20
Arduino LeonardoボードArduinoLeonardo
680オームカーボン抵抗LED用Digikeyバイアス抵抗器
100kオームカーボン抵抗フォトトランジスタ用Digikey
940nm発光ダイオード明るいLEDエレクトロニクスBIR-BM13E4G-2光密度測定
940nm フォトトランジスタコーデンシ ST-2L2B光学密度測定
ダーリントンペアIC 東芝マウザーULN2803APGこのICはマイクロポンプと磁気攪拌ユニットを駆動
DCブラシレスファンADDAAD0405LX-G70仕様:5 V電源電圧と80  mA;www.jameco.com
圧電マイクロポンプCurieJetPS15I-FT-5L圧力> 3 kPa;流量 >5 ml/min
Tygon 3350 TuningSaint GobainABW00001ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' 
マグネティックスターバーCOWIEテーパードシェイプ 薄暗い: 10 mm x 4 mm
ガラスシンチレーション 20 ml バイアルDGSパイレックスガラス 28 mm (直径) x 61 mm (高さ)
培養バイアルホルダーポリホルムアルデヒドからカスタムメイド 
ガラスバイアルを密封するために使用されるシリコーンダウコーニングシルガルド184
ディアムボトルVWR66022-065
Difco M9最小限の塩5xBDミディアム
カダミノ酸BDミディアム
グルコースグマ
寒天培地用オキソイド天プレート用
Luria Bertani medium
倒立顕微鏡Leica MicrosystemsLeica DMI-LEDマイクロ流体測定に使用 40倍対物レンズを使用 NA = 0.55
顕微鏡インキュベーターライブセル機器CU-109マイクロ流体測定に使用
ソレノイダルバルブPneumadyneS10MM-31-12-3ノーマルオープン 1.3ワット 12 Vdc
USBインターフェースカードホビーエンジニアリングUSBIO24-R デジタルI/Oモジュール マイクロ流体測定用
エアコンプレッサーロッカーサイエンティフィックロッカー 440マイクロ流体用圧力源; 最大圧力 80 psi
オス ルアーロック継手 1/8 インチ バーブValuePlastics.comMTLL230-1流体制御に使用
1/8 インチ バーブ 10-32 ねじポートValuePlastics.com B-1流体制御に使用
ルアーロック継手 10-32 ねじポートにValuePlastics.comKFTL-1流体制御用
NPNダーリントントランジスタ 500mA, 40 V (2N6427)DigiKey.com2N6427GOS-NDマイクロ流体制御用
10kΩ 炭素皮膜抵抗器 0.25WDigiKey.comP10KBACT-ND流体制御用
タンタルコンデンサ 10 μF、25 V、10%DigiKey.com478-1841-NDマイクロ流体制御に使用
Andor CCD カメラAndorZyla 4.2 Plus SCMOSマイクロ流体オンチップイメージングに使用
ELISA プレートリーダー
2 成分シリコン モメンティブRTV 615流体チップ製造
SU-8 フォトレジストMicrchemSU8 2015マイクロ流体チップ製造用
AZ4620 クラリアントAZ 4620流体チップ製造用
プラズマクリーナーハリック プラズマPDC 32G流体チップ製造用
20 ゲージ シリンジ ニードルBDマイクロ流体チップ製造に使用
LabcyclerSensoquestLabcycler PCR
DNAポリメラーゼToyoboKDO PlusPCR増幅
TrimethoprimSigma
プレートリーダーBiotekSynergy H1 hybrid 抗生物質レジスタン測定
器 器 バイアス抵抗器 します ミシ寒 マイクロに マイクロ メス マイクロ マイクロ マイクロ用 マイクロ マイクロ

参考文献

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