濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

Summary

私たちは、腫瘍微小環境（TME）を模倣するために透過性の微多孔質膜インサートを適応させました。このモデルは混合細胞培養で構成されており、蛍光標識や細胞選別を使用せずに、高度に濃縮された個々の細胞集団の簡易な生成を可能にし、正常またはストレス条件下でTME内の細胞間コミュニケーションを研究することができます。

Abstract

癌細胞と周囲の非癌性間質との間の早期の異な相互作用を理解することは、間質の活性化と腫瘍の微小環境（TME）の設立をもたらす事象を解明する上で重要です。 インビトロおよびTMEのインビボモデルにおけるいくつかが開発されています。しかし、一般的にこれらのモデルは、容易にさらなる研究のために、非摂動条件の下で、個々の細胞集団の単離を許可していません。この問題を回避するために、我々は、拡張共同用挿入物の膜の両側に、別々に密接成長高度に濃縮された細胞集団の簡単な生成を可能にする、まだ透過性微多孔膜インサートからなる細胞成長用基板を用いたin vitro TMEモデルを採用しています-culture回。このモデルを使用することによって、我々は以下の正常な二倍体のヒト線維芽細胞から大きく富化癌関連線維芽細胞（CAF）の集団を生成することができます蛍光タグ及び/又は細胞選別を使用せずに高転移性ヒト乳癌細胞との共培養（120時間）。さらに、インサートの細孔サイズを調節することによって、我々は開発の根底にあるメカニズムの調査を可能にする2異細胞集団間の細胞間コミュニケーション（ 例えば 、ギャップ結合コミュニケーション、分泌因子）のモード、のために制御することができますギャップ結合透過性の役割を含むTME、。このモデルは、癌間質開始、TMEの初期進化、および治療薬に対する癌細胞の応答に対する間質の調節作用につながる初期のイベントの我々の理解を高める上で貴重なツ​​ールとして機能します。

Introduction

腫瘍微小環境（TME）が共存するとホスト間質と一緒に進化する癌細胞で構成される非常に複雑なシステムです。この間質成分は、典型的には、線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、様々な免疫成分、ならびに細胞外マトリックス¹で構成されています。重要な構成要素、この間質の、しばしば大部分は、活性化された線維芽細胞は、しばしば癌関連線維芽細胞または癌関連線維芽細胞^（CAF）2,3と呼ばれています。通常、非活性化線維芽細胞とは異なり、CAFSは、乳房、前立腺、肺、膵臓、皮膚、結腸、食道癌などの多種多様な、腫瘍の開始、進行、血管新生、浸潤、転移、および再発^4-11に寄与し、そして^5,6,12-17卵巣。しかし、がんの病因全体でCAFSの寄与の正確な性質は、定義が不十分のまま。さらに、臨床的証拠は、CAFSの予後値を実証してきました、高品位の悪性疾患、治療の失敗、および全体的な予後不良^10,18,19にその存在を関連付けます。

明らかに、CAF開発の開始イベントと同様に、TME内での役割を媒介する細胞間コミュニケーションの我々の理解を高め、患者の転帰を改善することができるエキサイティングな新しい治療標的と強化戦略を提供することができます。この目標に向かって、in vivoおよびin vitroモデルにおけるいくつかが開発されています。 in vivoでのアプローチで患者のTMEをより反映しているが、それらは腫瘍内との間の両方の巨大な複雑さと不均一性などの制限を、持っています。さらに、ヒト被験者からの腫瘍サンプルは、しばしば高度に発達したTMEを表し、TME開始イベントの理解を許可していません。実験動物研究は、しかし、ヒトへの動物のデータの一般化が原因でphysiの違いに注意して行う必要があります、いくつかの利点を提供しますこのような齧歯類（ 例えば、チオール化学^20、 ​​代謝率²¹ などのストレス^22、に対する耐性）などの人間と動物の間に学問。また、自然の中で遺伝的に不均質である人間集団とは異なり、実験動物は、一般的に均一になるまで飼育されています。また、一過性の生理的変動および細胞表現型の変化を調べるために、ならびにげっ歯類などの動物を使用して、特定の実験パラメータを制御することがしばしば困難です。したがって、 インビトロ 2-および3次元（2Dおよび3D）組織培養モデルで頻繁TME開発の基本的な理解を進めるために利用されます。 インビボでのシステムの複雑さの正確な描写の欠如にもかかわらず、これらのモデルは、非常に機械的調査を容易にする利点を提供する。 インビトロモデルは、TMEのより単純化着目し、費用対効果の分析のために、それによって統計学的に有意な可能データを、生成することができます動物で起こる全身ばらつきのない細胞。

インビトロ系のいくつかの種類があります。 2つの最も一般的に使用TME in vitroモデルは、混合単層又はスフェロイド細胞培養物で構成されています。両方の培養方法は、細胞間の相互作用の基本的な研究（腫瘍細胞と、例えば、正常細胞）および種々のTME特定の細胞表現型の変化（正常線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の、例えば 、出現）の分析のために有利です。加えて、スフェロイドはTMEをより反映組織様構造を作成することができ、腫瘍異質²³を表すことができます。しかし、スフェロイドは、多くの場合、実験の結論^24を複雑^にする可能性が^ある層全体で幅広く変化する酸素張力勾配を作り出します。残念ながら、両方のモデルは非常に共同以下のさらなる特性評価および研究のために純粋な細胞集団を分離する能力が制限されています文化。これを行うには、蛍光タグ付きまたは特定メーカーで標識するために少なくとも1つの細胞型を必要とし、その後、細胞集団を分離するために仕分け広範な処理し、細胞に混合共培養を施すことになります。セルソーターではなく、純粋な細胞集団を単離することができるが、1は、細胞ストレスと潜在的な微生物汚染^25を危険を認識しなければなりません。

細胞間コミュニケーションの理解を容易にするため、多大な努力を開発し、簡単なアプローチを可能にしながら密接に、 生体内環境を模倣するインビトロシステムに最適化に向けて専念してきました。そのようなツールの一つは、透過性の微多孔性インサート、最初の1953年に^26を開発し、その後、多様なアプリケーションとの研究（ 例えば 、細胞極性^27、エンドサイトーシス^28、薬物輸送^29、組織モデリング³⁰に適合された膜基材、FERTですilization ^31、バイスタンダー効果^32,33、 など ）。このシステムは^、34,35、インビボマーカーの インビボ様の解剖学的および機能的分化、ならびに多くの発現を有する細胞の増殖を可能にするときに不浸透性のプラスチック容器で培養観察されません。また、非常に薄い多孔質膜（厚さ10μm）は、 生体内環境をシミュレートし、両方の頂端および側底細胞ドメインで独立した細胞機能を可能にする分子と平衡時間の急速な普及を可能にします。 TMEシステムなどの挿入物の有用性のさらなる利点は、膜の孔を通って細胞間コミュニケーションの様々なモードを維持しながら、同じ環境条件で膜の両側に成長させた2異型細胞集団の物理的な分離です。物理的に分離されているが、2つの細胞集団は、代謝的にデとして、分泌された要素を介して結合され、また、ギャップジャンクショ​​ンチャネルを介して、ここにスクライビング。さらに、in vivoでの部分的な酸素分圧（PO _2）で挿入を維持することによって、モデルは、他のシステムで観察された酸素と化学的勾配の合併症を減らすことができます。むしろ、それはTMEを制御する自然のメカニズムの理解を向上させます。注目すべきことに、2つの細胞集団を容易に共培養の長期間以下の蛍光タグ付けおよび/または細胞選別せずに、高純度で単離することができます。

ここでは、膜の孔を通って連続的な双方向通信ではまだヒト乳癌細胞透過性微孔質膜インサートの両側に、それぞれ、成長したヒト線維芽細胞からなるインビトロ TMEプロトコルを説明するが、。我々は、開発に異なる孔径を有する膜を使用することによって、細胞間コミュニケーションの特定のタイプの寄与（ 例えば 、ギャップ結合対因子を分泌した）ことを示していますTMEの調査することができます。

Protocol

培養培地および細胞の作製

1. イーグル最小必須12.5％（体積/体積）を添加した培地熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、2mMのL-アラニル-L-グルタミン、およびペニシリン100単位の500ミリリットルと1ml当たりストレプトマイシン100μgのを準備します。
   注：成長培地及び補充物（複数可）を容易に他の細胞株または細胞株の増殖要件に交換することができます。
2. 各インサート（6ウェルフォーマットの挿入）するための細胞培養培地の70μLを準備したイーグル最小必須培地、50％（体積/体積）の熱不活性化FBS、2mMのL-アラニル-L-グルタミン、及び100単位を補充ペニシリンおよび1mlあたりストレプトマイシン100μgの。
   注：培地をインサートの底部側（ すなわち、裏面）への細胞付着を促進するために、50％FBSが補充されます。増殖培地及び補充物（複数可）を容易に他の細胞株または細胞株の増殖要件に交換することができます。
3. インサートの底面上にめっきされる運命の細胞の細胞懸濁液を準備します。
   注記：ここでは、結果は、75cm ²の細胞培養フラスコ中で増殖させAG1522正常ヒト線維芽細胞を用いて得られた、これらの細胞は、従って、細胞懸濁液の調製の説明の焦点になります。
4. 細胞を収集するために、成長培地を除去し、5mlの1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞単層を2回洗浄します。
5. PBSを除去し、RT（室温）で2分間細胞上に室温（RT）に予め温め2.21 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）でトリプシン0.25％（体積/体積）を1ml広がります。
6. （ステップ1.1で調製した）完全増殖培地の9ミリリットルでトリプシン活性をクエンチし、静かにフラスコ10倍の表面上に細胞懸濁液をピペットで細胞を回収。
7. 血球計数器や電子カウンタを使用して細胞濃度を決定し、の提供します細胞懸濁液の体積をピペット電子滅菌15ミリリットルの遠心分離管への挿入あたり250,000細胞。
8. 遠心分離（800×gで、2分間）により細胞懸濁液をペレット化。 70μlのあたり250,000細胞の濃度を作成する（ステップ1.2で調製した）成長培地で細胞ペレットを中断します。
   注：透過性の微多孔膜インサートで細胞培養が2D基板に基づいているように、細胞を最初に取付けを容易にするために、50％（体積/体積）FBSを含む培地中に懸濁されるべきである以外は、細胞播種は、同様に行われます。

インサートの調製

注：滅菌条件下、細胞培養専用の層流生物学的安全キャビネット内の作業を確実にするために。

1. 膜の細孔0.4μmで、1μm以下の大きさ、または3ミクロン（孔径が細胞間コミュニケーションの異なるモードの役割を調査するために使用することができるように、実験的関心（複数可）によって決定される）を有するインサートを選択します。
   注：0.4ミクロンの細孔がSmalのです十分lはインサート膜の両側にセル間の機能的なギャップ結合の形成を制限し、分泌された因子による細胞間コミュニケーションを研究するために使用することができます。一方、1μmから3μmの細孔が機能的ギャップ結合の形成を可能にするのに十分な大きさとギャップジャンクショ​​ンおよび分泌因子の両方による細胞間コミュニケーションを研究するために使用することができます。
2. パッケージから個々のインサートを取り外し、等しいサイズのマルチウェル皿に置きます。
   注：挿入特定のアプリケーションのニーズに合わせて様々な膜表面積で利用可能である（ 例えば 、6ウェル、12ウェル、24ウェルインサート。）。ここでは、結果は、6ウェルインサートを使用して得られたため、モデル記述の焦点になります。
3. シャーレのふた付きインサートを含む、皿をカバーしています。両手でマルチウェル皿を持って、静かにインサート底部（ すなわち、下面は）今上を向いているような料理を反転させます。
4. 目を削除しますインサートの底面を露出させるマルチウェルディッシュのE底。一度に一つのインサートを使用した作業、鉗子の無菌のペアを使用し、静かに所定の位置にインサートを保持します。フリーハンドで、250,000細胞を含む、細胞懸濁液（ステップ1.3から1.8に調製した）の70μLを描画する広口の先端でピペットを使用しています。
5. 細胞をプレーするには、インサートの膜の中央に静かにピペットチップを置き、ゆっくりと膜の表面の周りにピペットチップを移動させながら、ゆっくりと細胞懸濁液の70μLをピペット。インサートの端にピペットチップ、細胞懸濁液を拡張しないように注意してください。
   注：インサートの端をタッチすると、添付ファイルの間に乾燥細胞に至る細胞懸濁液の毛管張力の損失につながる可能性があります。
6. 注意が行使されていない潜在的な微生物汚染を避けるためにさらさインサート上で直接動作するようにして、残りの挿入のために繰り返します。
7. ゆっくりマルチウェルを返しますインサートをカバーするために皿底。反転挿入物を有する皿を保ち、30〜45分間、37℃で5％（体積/体積）CO ₂の加湿空気雰囲気中でインキュベートします。
   注：挿入コンタクトウェルの底に細胞懸濁液場合は、慎重に皿の底を持ち上げ、それがわずかな角度を形成し、皿の表面との間に大きな分離を作成するように、皿上部の縁にそれを休ませ（細胞を播種する）インサートの底面。これは、代わりに、インサートのウェルの表面に付着する細胞を防ぐことができます。
8. 30-45分のインキュベーション時間の後、静かに挿入物を含む皿を削除し、層流生物学的安全キャビネットに入れてください。
9. 両手とタイトな皿のふたを維持したまま、静かに付着した細胞を含むインサートの底面側は今ダウン向くように皿を再度反転します。
10. ゆっくりと慎重にmigratiを回避するために、2ミリリットル（3μmの細孔の挿入のための1ミリリットルを追加します。インサートの底部が浸漬されるように、予め温めた完全培地の挿入孔を介して細胞）の上（、各ウェルにステップ1.1）を参照してください。
11. インサートを含むすべてのウェルで成長培地を添加した後、加湿インキュベーターに戻し皿を置きます。
12. インサートは48時間インキュベーターに邪魔されずに残ることを許可します。 48時間後、ウェルの底から培地2mlを吸引し、新鮮な増殖培地2mlを添加することによって細胞を養います。
13. 井戸の底に新鮮な培地を追加した後、シードすでにこれらのための底部側に成長している最初の細胞集団を（持っているインサートの上部側の第2の細胞集団の懸濁液（〜250,000細胞/ mlで）、の1ミリリットル実験では、AG1522（対照）細胞または癌（実験）細胞は、すでにAG1522細胞を持っているインサートの上にメッキCAFSなる運命に、インサートの底面に成長しています）。加湿インキュベーターに戻し皿を置きます。
    注：もし仕事インサートの底部に十分に付着しない細胞を用いる、これらの細胞は、代替的に、インサートの上面に成長させることができます。
14. ウェルのインサートとボトムの上から培地を吸引することにより、インサートの上部側の細胞の第二集団を播種後24時培地、72、および96時間を変更します。ゆっくりウェルの底に挿入し、2ミリリットルの上面に新鮮な培地の1ミリリットルを追加します。 2つの細胞集団は、120時間透過性微多孔インサート膜の両側に共培養したままにできるようにします。

3.トリプシン処理によって挿入から細胞を採取

注：濃縮された細胞集団を得ることを容易にすることに加えて、インサートTMEモデルも同様の実験的処置を可能に（ 例えば 、化学物質、上または周囲の雰囲気下にある酸素条件への曝露、電離放射線治療などとのインキュベーション）として他のin vitro TME共培養モデル。また、透過性インサート共培養基質は、すでに標準の2D組織培養モデルのために開発された手順によって分析することができます。例えば、細胞は、（ インサイチュ免疫検出、ウェスタンブロッティングで、例えば ）をエンドポイントの解析に利用することができる高度に濃縮された集団を得るために、インサート膜の両側から採取することができ、またはその後の実験³⁶伝播します。

1. 細胞を収集するには、成長培地からの挿入を除去し、1mlのPBSを含む35ミリメートルの細胞培養皿に入れてください。 1ミリリットルのPBSでインサート1Xの底部と上部の側面を洗ってください。
2. PBSを削除し、0.25％2.21 mMのEDTAでトリプシン（体積/体積）の200μlを添加、室温に予め温めておきました。
   1. インサートの底面上で増殖させた細胞を収集した場合、35mmの皿にトリプシン溶液を配置し、穏やかに室温で2分間トリプシン溶液中にインサートの底部を配置します。
   2. 細胞を収集した場合インサートの上面上に成長させただ、35mmの皿にインサートを配置し、インサートの上部にトリプシン溶液を添加し、室温で2分間インキュベートします。
3. 完全増殖培地800μLを添加することによりトリプシン活性をクエンチします。
   1. インサートの底に増殖した細胞を収集した場合、35mmの皿に増殖培地を追加し、穏やかにインサートがわずかで開催された状態で、インサート10倍の表面上に細胞懸濁液の1ミリリットルをピペットで細胞を採取細胞懸濁液を皿に収集するような角度、。
   2. インサートの上面から細胞を採取する場合は、トップ側に成長培地を追加し、穏やかにインサート10倍の表面上に細胞懸濁液の1ミリリットルをピペット。

フローサイトメトリーによる細胞の純度の4キャラクタリゼーション

注：Tの純度を維持するために、透過性の微多孔膜インサートの能力を特徴づけるために彼は最大120時間、2つの細胞集団（ すなわち、頂部および底部）は、セクション1-3は、緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いて、実行されたインサートの上面にめっきされるMDA-MB-231細胞を-タグ、および非GFPタグAG1522細胞は、0.4μm-の下側に1μm-、または3ミクロンの細孔インサートをメッキされます。

1. インサートの底面から細胞を（セクション3に記載された手順）を収集した後、遠心分離（500mL G、30秒）によって細胞懸濁液をペレット。
2. 上清を除去し、1％（体積/体積）FBSを補充したハンクス平衡塩溶液（HBSS）400μlの中で細胞ペレットを中断。
3. GFP光子放射^37を検出するため^の GFP及び530/30のバンドパスフィルタを励起するために488nmのレーザーを備えたフローサイトメーター上でフローサイトメトリー分析を行います。
4. セル識別のために、前方に調整するAG1522コントロール細胞集団を使用して、フローサイトメーター上で側方散乱電圧。調整しますGFPチャネルの電圧はGFPシグナルのためのより低い検出閾値のような細胞の自家蛍光値を設定します。
5. コントロール細胞を使用してしきい値をゲーティング決定します。制御対GFP陽性細胞の存在に基づいて、各細胞集団の純度を評価します。
   注：純粋な集団が検出されていないGPF陽性細胞の反射であろう。

その場の免疫蛍光でによって細胞の5キャラクタリゼーション

1. インサートからの細胞のトリプシン処理に続いて（セクション3を参照）、細胞を収集し、プレートを250μlの増殖培地中で5×10 ⁴個^の細胞を（ステップ1.1参照）滅菌ガラスカバースリップ上に、との加湿空気雰囲気中で1時間付着させ37℃インキュベーターで5％（体積/体積）CO _2。
2. インキュベーションの終わりに、静かにカバースリップを含む皿を削除し、層流生物学的安全キャビネットに入れてください。
3. 予め温めた完全培地の2ミリリットルを注意深く加える（ステップを参照してください1.1）各皿に、カバースリップが浸漬されるようになっています。
4. カバースリップを含むすべての皿に成長培地を添加した後、48時間、インキュベーター中、37℃で5％（体積/体積）のCO ₂の加湿空気雰囲気に皿を返します。
5. 48時間のインキュベーション後、PBSでサンプル3回洗浄し、室温で10分間、PBS中の4％（重量/容量）のホルムアルデヒドで固定します。
6. トリス緩衝生理食塩水（TBS：50mMのトリス-Cl、pHが7.5、150 mMのNaCl）で5回すすぎ、その後で5分間0.25％（体積/体積）トリトンX-100、0.1％（重量/容量）サポニンで透過性RT。
7. ブロッキング（TBS中の2％との非特異的結合部位をブロックする（体積/体積）の正常ヤギ血清（NGS）、1％（wt / vol）のウシ血清アルブミン（BSA）、0.1％（体積/体積）トリトンX-100 RTで1時間溶液）。
8. 4℃で一晩ブロッキング溶液中で：一次抗体（千抗カベオリン1（CAV1）、1）とインキュベートします。
9. 0.2％NGS（体積/体積）と結合していない一次抗体（3回、5分/洗浄）を洗い流し、1％（重量/体積）BSA、0.1％（VOL / vol）のTBS中のトリトンX-100（洗浄溶液）。
10. （セクション5.4を参照）をブロッキング溶液中で室温で1時間二次抗体でインキュベートします。
11. （ステップ5.6参照）を洗浄溶液で未結合二次抗体（3回、5分/洗浄）を洗い流します。
12. マウントは4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含有する抗フェードマウンティング培地でスライドにカバースリップ、およびマニキュアで密封します。
13. 蛍光励起用の外部光源を備えた倒立顕微鏡の63X油倍率の対物レンズを用いて細胞を観察し、そしてその後の分析のために取り付けられたデジタルカメラを使用して画像を取り込みます。

ウエスタンブロットによって細胞の6キャラクタリゼーション

注：ウェスタンブロット手順は、他の場所³⁸に記載されています。簡単な概要をここで説明されています。

1. トリプシン処理によってインサートからの細胞の分離に続いて、（セクション3参照）遠心分離（500mL G、30秒）によって細胞懸濁液をペレット。
2. 上清を除去し、100μlのPBSで細胞ペレットの2倍を一時停止します。
3. 修正された放射性免疫アッセイ50μlの上清および溶解細胞を除去（RIPA）緩衝液（トリスpH7.5の50mMの、NaClを150mMの、NP40 1％（体積/体積）、デオキシコール酸ナトリウム一水和物（DOC）、0.5％（体積/体積）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.1％（体積/体積））、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含みます。
4. 4℃で15分間19000グラムで氷と遠心機で20分間インキュベートします。
5. RIPA緩衝液中の界面活性剤と互換性のタンパク質の光学密度アッセイを使用して、上清中のタンパク質の濃度を決定します。
6. 0.2μmのニトロセルロース膜上にエレクトロドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によってタンパク質を分離します。
7. 0.1％（体積/体積）のTween-20（TBST）および4％（重量/容量）を含むTBS中で膜をインキュベート60分ミルク（ブロッキング溶液）を脱脂し、（4℃で一晩、一次抗体と反応する抗CAV1、1：1,000）。
8. RT（5分/洗浄）でTBSTで膜3回洗浄します。
9. 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）（5000 1）と結合した抗マウス二次抗体を含むブロッキング溶液中で30分間、膜をインキュベートします。
10. RT（5分/洗浄）でTBSTで膜3回洗浄します。
11. ウェスタンブロッティング検出システムを用いて化学発光により反応生成物を可視化します。

フローサイトメトリーによる細胞間コミュニケーションの7キャラクタリゼーション

注：透過性微多孔膜の適応性を特徴付けるためには、細胞間コミュニケーション（ 例えば、分泌因子、ギャップ結合）の異なるモードを調べるために挿入されます。セクション1から2.12までは非蛍光0.4μm-、1μm-の底面にめっきさAG1522細胞、または3μmの孔インサートを用いて行きました。

1. 1.1節で説明した培地を用いて90％の密集度に35mm皿で培養非標識AG1522細胞。
2. Rinse細胞をHBSS 1mlで1倍。
3. カルセインAMの30μMを含むHBSSで細胞をインキュベートすることによりCalcein AMでロードセル。
4. 37℃で5％（体積/体積）CO ₂の加湿空気雰囲気中で15分間インキュベートします。
5. 洗浄細胞をHBSS 1mlで2倍。
6. 室温で2分間、2.21 mMのEDTAと0.25％（体積/体積）トリプシン200μlの溶液を添加することによりトリプシン処理細胞。
7. 12.5％（体積/体積）FBSを含む完全培地800μlのを追加することにより、トリプシン活性をクエンチしました。
8. ピペッティングを繰り返すことにより、懸濁液中に細胞を持参してください。
9. 血球計数器や電子カウンタを使用して細胞濃度を決定し、既に底部側に成長しているAG1522細胞を持っているインサートの上面にカルセインAMを負荷した250,000細胞をプレート。
10. 37℃、5％CO ₂の加湿空気雰囲気中でインサートをインキュベート 6時間。
11. 記載されているように6時間後、インサートの底面から細胞を集めますセクション3インチ
12. 遠心分離（500mL G、30秒）によって細胞懸濁液をペレット。
13. 上清を除去し、1％（体積/体積）FBSを補充したHBSS400μlの中で細胞ペレットを中断。
14. メーカーのプロトコルごとに、（496 nmおよび516 nmで、それぞれ）レーザーを備えたフローサイトメーター上の細胞を分析し、エキサイティングでカルセインの放出を検出することが可能にフィルタをかけます。
15. セル識別のために、フローサイトメーター上で前方および側方散乱電圧を調整するように未染色AG1522対照細胞集団を使用します。カルセイン信号のためのより低い検出閾値のような細胞の自家蛍光値を設定するには、カルセインチャネルの電圧を調整します。
16. カルセインロードされたコントロール細胞を使用して、スレッショルド上限値を決定します。対照に対するカルセイン陽性細胞の存在に基づいて、各セルの挿入のための通信を評価します。

Results

ここでは、in vivoでの腫瘍微小環境（ 図1）を模倣するインビトロ異細胞共培養システムを開発するために透過性の微多孔膜インサートを適応しました。このシステムは、（私達の使用中の120時間まで、）長時間のインサートの多孔質膜の両側に成長させることには、2つの異なる細胞集団を可能にします。 0.4〜1-または3 M-細孔インサートの上側にGFPタグ付きMDA-MB-231細胞をプレーティングし、それらの中で成長させることによって決定される重要なシステムでは、細胞集団の純度を維持することができますAG1522細胞が120時間、インサートの底面側に成長しているとの共培養。この時間の後、細胞を、インサートの下側​​から回収し、細胞集団の純度の損失を示すであろう任意のGFP陽性のMDA-MB-231細胞の存在を同定するためにフローサイトメトリーによって分析しました。分析は、99.9％と99.8％のPUを明らかにしましたそれぞれ0.4及び1μmの細孔挿入、から集団の再;細孔が膜を横切って移行するGFP陽性MDA-...

Discussion

ここで説明するプロトコルは、透過性の微多孔膜インサートが異細胞の共培養物から高度に濃縮された個々の細胞集団を生成するために利用する、単純なインビトロ手順の適合（ 図1）です。重要なことは、このモデルは細胞間コミュニケーションの様々なモードを調査するのに適しています。重要なステップは、上面側の第2の細胞集団を播種し、50％FBSを補充した培地中でインサートの下側​​の第1の細胞集団を播種し、特定の実験的な関心（複数可）に適切な細孔サイズのインサートを選択することを含みます挿入、および時間の適切な期間のための2つの異なる細胞集団の共培養。我々は、主要な開発に対処しており、従って、分子表現型を理解するための大きな機会を提供し、および潜在変化が早いTME進化中に発生する、このシステムは、インビボでの種々の特性を模倣することが可能であることを示し多くの確立されたTME のin vitroモデルのisadvantage（ 図2）。

モデルは、簡単に、癌間質...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Cell Culture
AG01522 (すなわち, AG1522) ヒト二倍体線維芽細胞	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 乳房腺癌細胞株	PerkinElmer	119261	親株: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP 乳房腺癌細胞株	Cell Biolabs	AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
ウシ胎児血清 (FBS)、認定	Sigma	F6178-500mL
Corning グルタグロサプリメント (200 mM L-アラニル-L-グルタミン)	Corning Cellgro	25-015-Cl
ペニシリンストレプトマイシン溶液、100x	Corning Cellgro	30-002-Cl
トランズウェルインサート (すなわち、透過性微多孔質メンブレンインサート) (0.4 μm pore)	Costar	3450
トランズウェルインサート (すなわち、透過性微多孔質膜インサート) (1 μm pore)	Greiner bio-one	657610
トランズウェルインサート (すなわち、透過性微多孔質膜インサート) (3 μ	Costar	3452
6-well Culture	Plate Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 細胞培養フラスコ	CellStar	658 170
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS), 1x	Corning Cellgro	21-040-CV	カルシウム & マグネシウムなし
0.25% (vol/vol) トリプシン, 2.21 mM EDTA, 1x	Corning Cellgro	25-053-CL
15 ml 遠心分離チューブ	CellTreat	229411
35 mm x 10 mm Cell Culture Dish	Greiner bio-one	627 160
Name	企業名	カタログ番号	コメント
>免疫蛍光顕微鏡用
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ 免疫蛍光 - 1:5,000
ヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 488 コンジュゲート	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ 免疫蛍光 - 1:2,000
ウシ血清アルブミン - フラクション V	Rockland	BSA-50	免疫グロブリンおよびプロテアーゼフリー
16% (wt/vol) ホルムアルデヒド溶液	ThermoFisher Scientific	28908	4% に希釈 1x PBS
プレミアムカバーガラス (22 mm x 22 mm No.1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
SlowFade Gold 退色防止試薬と DAPI	Invitrogen	S36938
名前	会社	カタログ番号	コメント
フローサイトメトリー分析用
Calcein、AM	分子プローブC3100MP
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)	Gibco	14025-076
名前	会社	カタログ番号<	strong>コメント
ウェスタンブロット分析用
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot - 1:1,000
Tween-20	BioRad	170-6531
ニトロセルロースメンブレン (0.2 μm)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay	BioRad	500-0116
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	BioRad	161-0302
デオキシコール酸ナトリウム一水和物 (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
30% アクリルアミド/Bis 溶液、37.5:1	BioRad	161-0158