濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

Summary

私たちは、腫瘍微小環境（TME）を模倣するために透過性の微多孔質膜インサートを適応させました。このモデルは混合細胞培養で構成されており、蛍光標識や細胞選別を使用せずに、高度に濃縮された個々の細胞集団の簡易な生成を可能にし、正常またはストレス条件下でTME内の細胞間コミュニケーションを研究することができます。

Abstract

癌細胞と周囲の非癌性間質との間の早期の異な相互作用を理解することは、間質の活性化と腫瘍の微小環境（TME）の設立をもたらす事象を解明する上で重要です。 インビトロおよびTMEのインビボモデルにおけるいくつかが開発されています。しかし、一般的にこれらのモデルは、容易にさらなる研究のために、非摂動条件の下で、個々の細胞集団の単離を許可していません。この問題を回避するために、我々は、拡張共同用挿入物の膜の両側に、別々に密接成長高度に濃縮された細胞集団の簡単な生成を可能にする、まだ透過性微多孔膜インサートからなる細胞成長用基板を用いたin vitro TMEモデルを採用しています-culture回。このモデルを使用することによって、我々は以下の正常な二倍体のヒト線維芽細胞から大きく富化癌関連線維芽細胞（CAF）の集団を生成することができます蛍光タグ及び/又は細胞選別を使用せずに高転移性ヒト乳癌細胞との共培養（120時間）。さらに、インサートの細孔サイズを調節することによって、我々は開発の根底にあるメカニズムの調査を可能にする2異細胞集団間の細胞間コミュニケーション（ 例えば 、ギャップ結合コミュニケーション、分泌因子）のモード、のために制御することができますギャップ結合透過性の役割を含むTME、。このモデルは、癌間質開始、TMEの初期進化、および治療薬に対する癌細胞の応答に対する間質の調節作用につながる初期のイベントの我々の理解を高める上で貴重なツ​​ールとして機能します。

Introduction

腫瘍微小環境（TME）が共存するとホスト間質と一緒に進化する癌細胞で構成される非常に複雑なシステムです。この間質成分は、典型的には、線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、様々な免疫成分、ならびに細胞外マトリックス¹で構成されています。重要な構成要素、この間質の、しばしば大部分は、活性化された線維芽細胞は、しばしば癌関連線維芽細胞または癌関連線維芽細胞^（CAF）2,3と呼ばれています。通常、非活性化線維芽細胞とは異なり、CAFSは、乳房、前立腺、肺、膵臓、皮膚、結腸、食道癌などの多種多様な、腫瘍の開始、進行、血管新生、浸潤、転移、および再発^4-11に寄与し、そして^5,6,12-17卵巣。しかし、がんの病因全体でCAFSの寄与の正確な性質は、定義が不十分のまま。さらに、臨床的証拠は、CAFSの予後値を実証してきました、高品位の悪性疾患、治療の失敗、および全体的な予後不良^10,18,19にその存在を関連付けます。

明らかに、CAF開発の開始イベントと同様に、TME内での役割を媒介する細胞間コミュニケーションの我々の理解を高め、患者の転帰を改善することができるエキサイティングな新しい治療標的と強化戦略を提供することができます。この目標に向かって、in vivoおよびin vitroモデルにおけるいくつかが開....

Protocol

培養培地および細胞の作製

1. イーグル最小必須12.5％（体積/体積）を添加した培地熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、2mMのL-アラニル-L-グルタミン、およびペニシリン100単位の500ミリリットルと1ml当たりストレプトマイシン100μgのを準備します。
   注：成長培地及び補充物（複数可）を容易に他の細胞株または細胞株の増殖要件に交換することができます。
2. 各インサート（6ウェルフォーマットの挿入）するための細胞培養培地の70μLを準備したイーグル最小必須培地、50％（体積/体積）の熱不活性化FBS、2mMのL-アラニル-L-グルタミン、及び100単位を補充ペニシリンおよび1mlあたりストレプトマイシン100μgの。
   注：培地をインサートの底部側（ すなわち、裏面）への細胞付着を促進するために、50％FBSが補充されます。増殖培地及び補充物（複数可）を容易に他の細胞株または細胞株の増殖要件に交換することができます。
3. インサートの底面上にめっきされる運命の細胞の細胞懸濁液を準備します。
   注記：ここでは、結果は、75cm ²の細胞培養フラスコ中で増殖させAG1522正常ヒト線維芽細胞を用いて得られた、これらの細胞は、従って、細胞懸濁液の調製の説明の焦点になります。
4. 細胞を収集するために、成長培地を除去し、5mlの1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞単層を2回洗浄します。
5. ....

Results

ここでは、in vivoでの腫瘍微小環境（ 図1）を模倣するインビトロ異細胞共培養システムを開発するために透過性の微多孔膜インサートを適応しました。このシステムは、（私達の使用中の120時間まで、）長時間のインサートの多孔質膜の両側に成長させることには、2つの異なる細胞集団を可能にします。 0.4〜1-または3 M-細孔インサートの上側にGFPタグ付きMDA-MB-231細胞をプレーティングし、それらの中で成長させることによって決定される重要なシステムでは、細胞集団の純度を維持することができますAG1522細胞が120時間、インサートの底面側に成長しているとの共培養。この時間の後、細胞を、インサートの下側​​から回収し、細胞集団の純度の損失を示すであろう任意のGFP陽性のMDA-MB-231細胞の存在を同定するためにフローサイトメトリーによって分析しました。分析は、99.9％と99.8％のPUを明らかにしましたそれぞれ0.4及び1μmの細孔挿入、から集団の再;細孔が膜を横切って移行するGFP陽性MDA-.......

Discussion

ここで説明するプロトコルは、透過性の微多孔膜インサートが異細胞の共培養物から高度に濃縮された個々の細胞集団を生成するために利用する、単純なインビトロ手順の適合（ 図1）です。重要なことは、このモデルは細胞間コミュニケーションの様々なモードを調査するのに適しています。重要なステップは、上面側の第2の細胞集団を播種し、50％FBSを補充した培地中でインサートの下側​​の第1の細胞集団を播種し、特定の実験的な関心（複数可）に適切な細孔サイズのインサートを選択することを含みます挿入、および時間の適切な期間のための2つの異なる細胞集団の共培養。我々は、主要な開発に対処しており、従って、分子表現型を理解するための大きな機会を提供し、および潜在変化が早いTME進化中に発生する、このシステムは、インビボでの種々の特性を模倣することが可能であることを示し多くの確立されたTME のin vitroモデルのisadvantage（ 図2）。

モデルは、簡単に、癌間質.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Cell Culture
AG01522 (すなわち, AG1522) ヒト二倍体線維芽細胞	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 乳房腺癌細胞株	PerkinElmer	119261	親株: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP 乳房腺癌細胞株	Cell Biolabs	AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
ウシ胎児血清 (FBS)、認定	Sigma	F6178-500mL
Corning グルタグロサプリメント (200 mM L-アラニル-L-グルタミン)	Corning Cellgro	25-015-Cl
ペニシリンストレプトマイシン溶液、100x	Corning Cellgro	30-002-Cl
トランズウェルインサート (すなわち、透過性微多孔質メンブレンインサート) (0.4 μm pore)	Costar	3450
トランズウェルインサート (すなわち、透過性微多孔質膜インサート) (1 μm pore)	Greiner bio-one	657610
トランズウェルインサート (すなわち、透過性微多孔質膜インサート) (3 μ	Costar	3452
6-well Culture	Plate Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 細胞培養フラスコ	CellStar	658 170
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS), 1x	Corning Cellgro	21-040-CV	カルシウム & マグネシウムなし
0.25% (vol/vol) トリプシン, 2.21 mM EDTA, 1x	Corning Cellgro	25-053-CL
15 ml 遠心分離チューブ	CellTreat	229411
35 mm x 10 mm Cell Culture Dish	Greiner bio-one	627 160
Name	企業名	カタログ番号	コメント
>免疫蛍光顕微鏡用
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ 免疫蛍光 - 1:5,000
ヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 488 コンジュゲート	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ 免疫蛍光 - 1:2,000
ウシ血清アルブミン - フラクション V	Rockland	BSA-50	免疫グロブリンおよびプロテアーゼフリー
16% (wt/vol) ホルムアルデヒド溶液	ThermoFisher Scientific	28908	4% に希釈 1x PBS
プレミアムカバーガラス (22 mm x 22 mm No.1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
SlowFade Gold 退色防止試薬と DAPI	Invitrogen	S36938
名前	会社	カタログ番号	コメント
フローサイトメトリー分析用
Calcein、AM	分子プローブC3100MP
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)	Gibco	14025-076
名前	会社	カタログ番号<	strong>コメント
ウェスタンブロット分析用
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot - 1:1,000
Tween-20	BioRad	170-6531
ニトロセルロースメンブレン (0.2 μm)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay	BioRad	500-0116
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	BioRad	161-0302
デオキシコール酸ナトリウム一水和物 (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
30% アクリルアミド/Bis 溶液、37.5:1	BioRad	161-0158