動物の行動観察のための溶存酸素を操作するための単純なアプローチ

サマリー

この記事では、動物行動研究のための実験室の設定で溶存酸素条件を操作するためのシンプルで再現性のあるプロトコルについて説明します。このプロトコルは、溶存酸素濃度の変化に大型無脊椎動物、魚類、または両生類の生物応答を評価するために、両方の教育と研究室の設定で使用してもよいです。

要約

実験室環境中の溶存酸素（DO）を操作する能力は、生態系と生物行動の質問の数を調査する重要なアプリケーションを持っています。ここで説明するプロトコルは、低酸素と無酸素状態に起因する水​​生生物における行動反応を研究するために、DO操作するための、簡単な再現性、および制御方法を提供します。窒素は、一般的に実験室の設定で使用されていると、水の脱ガスを行いながら、生態（水生）アプリケーションのための明示的な方法は、文献中に存在せず、このプロトコルは、生物応答を観察するために水をdegasifyするためのプロトコルを記述する最初のものです。この技術およびプロトコルは、水生無脊椎動物のために直接適用するために開発されました。しかし、小魚、両生類、および他の水生脊椎動物を簡単に置き換えることができます。これは、2 mg / Lでから5分の動物観察期間までのための安定した11ミリグラム/ Lの範囲のDOレベルを簡単に操作することができます。5分間の観察期間を超えて水の温度が上昇し始め、10分にはDOでレベルが維持するにはあまりにも不安定になりました。プロトコルは、入門教育ラボや高レベルの研究用途への迅速な実装を可能にし、研究の生物へのスケーラブルな再現性、および信頼性があります。この技術の期待される結果は、生物の行動応答に溶存酸素の変化を関連付ける必要があります。

概要

溶存酸素（DO）、水生生態系内の生物学的および生態学的プロセスの数を媒介するのに重要な鍵と生理化学的パラメータです。急性および慢性の致死低酸素に対するエクスポージャーは、特定の水生昆虫の成長率を低下させ^、1さらさ昆虫の生存率を低下させます。このプロトコルは、動物の行動への影響を観察するために河川水にDOレベルを操作する制御方法を提供するために開発されました。すべての好気性水生生物の生存が住んでいて、再生するためには、酸素濃度に依存するため、DOの濃度の変化は、多くの場合、生物による行動の変化に反映されます。複数のモバイル水生無脊椎動物や魚は高いDO ^2,3でロケールを求めることにより、低酸素濃度（低酸素）に応答することが観察されています。あまり携帯水生生物については、DOの摂取量を増加させるための行動適応が唯一の現実的な選択肢かもしれません。 PLECの水生大型無脊椎動物順^{6 -} optera（カワゲラ）は、それらの外鰓⁴渡って、酸素の水の流れ、および取り込みを増加させるために「プッシュアップ」の動きを実行するために注目されています。これらの適応行動は、自然環境および実験室の実験で観察されています。

水中のDOの実験室での操作は、動物行動研究のための重要な機会を開きますが、方法論の展開で大きなギャップが存在します。例えば、ある研究では、窒素でガス処理以下の低酸素環境にオオクチバス（ オオクチバス ）の生理学的な応答時間を評価するために、大きな水槽を使用したが、わずかな詳細は方法論⁷について与えられています。ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）で実行別の研究では、水にガスを供給し、水⁸のDOを低減するために、窒素ガスと多孔質石を使用します。化学ベースのアプリケーションの場合は、溶剤の脱ガスのための方法は、特殊な利用します装置^9から11の溶剤から酸素を除去するが、動物の行動研究には適していません。これらの研究は、水から酸素を除去する方法を採用しているが、何の記述方法は、変更を行うために応答して、動物の行動の評価を可能にするであろうが同定されませんでした。

以下に説明するこの方法は、十分に窒素ガスを用いて水のDOの操作のためのプロトコルを説明するための試みです。さらに、この方法は、新入生レベルの生物学実験室で使用したカワゲラの振る舞い​​（腕立て伏せ）とDOとの関係を観察することに向けて開発されました。この方法の主な利点の1つは、それが簡単に一般的なガラス製品、ほとんどの二次および高等教育機関へのアクセスの材料と実験室内で実行することができるということです。プロトコルは、個人が研究や教育用途のために記載された目標を達成するための手順をスケーリングするためにできるように、また容易に適応可能です。

プロトコル

注：この実験は、脊椎動物を使用していなかったため、動物実験委員会のためのジュニアータカレッジの研究所による承認を必要としませんでした。しかし、脊椎動物で使用するために、この方法を適応個人のために、IACUCの承認が求められるべきです。

1.フィールドのサンプル採取

1. 1時間のトランジットでの最大推奨時間で輸送中の時間を最小限にするために迅速に決定し、評価収集する機能のための潜在的なフィールドサイトを、店舗、および輸送カワゲラ。
2. 少なくとも35カワゲラ^12を収集するために、標準的なキック-netの手順に従って、選択したフィールドサイトで十分な時間をキックネットサンプリングを行います。
3. ストリームから2センチメートルの最大径と河川水と岩の50 Lを収集します。
4. ストリームサイトの温度に設定し冷蔵庫に水槽を置きます。水族館にストリームサイトで収集した岩を配布し、水槽ごとの河川水4Lで埋めます。場所20-30水族館あたりカワゲラを収集し、各タンクに水族館バブラーに取り付けられたバブリングの石を配置し、継続的に水に室内空気を追加するバブラーをオンにします。
5. カワゲラは、48時間の期間のための水族館で新しい環境に調整することができます。

図1.溶存酸素操作のために設定します。（A）1）男性のホースバーブ2）ストッパーシールの場所に銅管用の継手はよく確保フラスコを密封するために検討しました。 （B）1）サイドアームフラスコに1.9水2）ガス管とそれぞれ窒素バブリングと室内空気のバブリングで使用するための空気バブラー（青）、3）窒素タンクのLとゲージ値4）2リットルのフラスコを充填した2 L真空管5水没）溶存酸素計で水0.4 Lで満たされた。 にはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。

2.実験のセットアップ

1. （ 図1Bの1）に示されているように作業台の上に、2 Lサイドアームフラスコのサイドアームに標準壁の真空管を接続します。
2. 12℃に設定し、冷蔵庫に集め河川水を保持する3 Lのプラスチック容器からの河川水の1.9リットルでフラスコを埋めます。
3. フラスコ内部のビューを不明瞭にすることなく、サイドアームフラスコの周りに氷浴を保持し、氷でトレイを満たすのに十分な大きさのトレイ上のフラスコやチューブを置きます。
4. 容器にガスを提供し、するには、1）銅管の通過を可能にするためにゴム栓二つ直径3mmの穴をドリル2） 図1Bの2 LサイドアームフラスコにDO計のプローブ（1） 。
5. ストッパーにDOプローブのワイヤーの着座を可能にするために、穴の一つにストッパーの端から横方向の切開を行います。
6. 3ミリメートルオスホースとカプラーを接続バーブ（ 図1A中1）直径2mmの銅管の一部に。このパイプは、ストッパーを介して到達しながら、フラスコの底から10cm以内に到達するのに十分な長さであることを確認してください。
7. ストッパーの底部からの長さまでのストッパーにおける第二の穴は、フラスコの底から10cm以内に到達するのに十分ですが、カプラーとのパイプを配置します。
8. パイプ上のカプラに3ミリメートルの直径0.75メートルの長さ、薄壁ポリエチレンガス管を接続します。
9. フラスコにDOプローブと銅管の両方をスライドさせ、ストッパー付きフラスコを密封します。
10. ストッパーとフラスコ、ならびにパイプとストッパ内のプローブ線との間にぴったりとフィットとの間のセキュアシールを確認してください。
11. 水道水0.4リットルで1リットルのフラスコを記入し、氷浴と真空フラスコとトレイに隣接して配置します。
12. 1Lのフラスコの水中に大きな真空フラスコからのポリエチレンチューブを浸します。確保しますそれは、実験を通して沈めたままになりますようにテープでチューブ。
13. 水族館室内空気バブラーに真空フラスコから3ミリメートルの直径のガスラインを接続します。水に室内空気と酸素を紹介する水族館バブラーに接続することによってバブルに2リットルのフラスコ内の水を開始します。
14. 5分間またはDOの平衡がDOにほとんど変化が発生していることなど、チャンバ内に確立されるまで、DO計で水のDO濃度と温度を監視します。

3.実験のセットアップの安定性試験

1. カワゲラの添加前にDOの安定性のための各セットアップをテストします。
2. カワゲラは腕立て伏せの助けとなる基板を有するように、2リットルのフラスコに3つまたは​​4つの岩を追加します。
3. バブラーからのガス管を切断し、窒素ガスラインに取り付けることにより、DOのトライアル操作を開始します。
4. 約40のために時間あたり20立方フィート（CFH）で窒素をバブリング開始1分秒。
5. DOは、標的濃度の0.5ミリグラム/ Lの範囲内まで低下した後、15 CFHに流れを減少し、濃度がターゲットに減少することを可能にします。
6. 目標濃度に達するとすぐに、窒素の流れを止めます。
7. DOは目標を下回った場合に目標濃度に濃度を返すために水槽室内空気バブラーを使用してください。
8. DOは、セットアップのテスト時に不安定である場合には、水温が安定して変化していない、水量は1.9 Lのままであると水が出て泡立てていない確認、およびすべての付属品にシールがしっかりと密封されたように見えます。
9. 3試験が行われており、実験者は、DOを制御する能力に自信を持っていたら、再び平衡状態にバブラーバブルにガスラインを取り付けます。
10. 水族館バブラーに直径3mmのガスラインを取り付けての濃度まで水に室内空気の追加を開始することにより、平衡にバブル水中の酸素が増加または3分間変更されません。
11. 平衡状態でたら、バブリングを停止し、フラスコを開封。

4.カワゲラプッシュアップ実験

1. 実行するための試行回数を決定するために、観察者の数でカワゲラの合計数を割ります。
2. カワゲラ（腕立て伏せの回数）の行動反応を評価するために、2および10mg / Lの間で異なるDOレベルを決定します。
3. ゴム栓でフラスコを再シール、その後、裁判ごとに1フラスコを設定し、フラスコ（この設計内の4カワゲラ）へのオブザーバーがあるとしてカワゲラの同じ番号を追加し、バックフラスコにプローブとのパイプを配置します。
   注：それはカワゲラがサンプリングされた場所からのストリームのDO濃度だったので、最初は10ミリグラムの濃度をDO / Lは、最初の観測点として選ばれました。
4. 水は以下に2.10から2.11までステップバブリングすることによっての10mg / Lになったら、開始水温を記録可能フラスコ内の岩の基板に取り付けるためのカワゲラ。
5. カワゲラが示す上下身体の動きであるプッシュアップ動作の正確なカウントを保証するために、単一のカワゲラを見るためにだけ1オブザーバーを割り当てます。
6. 3分間の観察期間にわたって観察された腕立て伏せの回数をカウントし、記録します。
7. 次の実験DOレベルにDOを操作し、追加実験のレベルの3分の観察期間を繰り返します。
   注記：この実験計画の範囲内で、三つの異なるDOレベルを評価しました。

5.統計解析

1. 統計分析を実行するには、指定されたDOの裁判のためのグループ全体の4カワゲラ全体で腕立て伏せの平均数を使用します。
2. COVとして各実験試験の順序（レベルDO）と温度を使用して、腕立て伏せやDO濃度の数に分散分析（ANOVA）を実行するために無料のR統計計算ソフトウェア^12を使用してくださいariates。単一因子の離散レベルとしてDOを分析しました。
3. 正常¹³をチェックするために、残差にアンダーソン・ダーリングの正規性検定を使用してください。
4. DO濃度に対する腕立て伏せの平均数をプロットすることにより、データに線形回帰を実行します。

結果

説明セットアップの6件の試験は、カワゲラが水の中に別のDO濃度に応じて行う腕立て伏せの回数を定量化するために教育実験室の設定で24新入生学部学生によって行われました。 DOレベル内および各試行内で行わ腕立て伏せの平均数は、図2にDOレベルに対する腕立て伏せをプロットするためにプールした。ANOVAとしてだけでなく、DO濃度、試験の順序、温度を利用して、最初に行きましたすべての変数間の相互作用。結果は、唯一の濃度が大幅にカワゲラによって行わ腕立て伏せの回数の影響を受けないことを示唆している（R ² ADJを。= 0.322、P = 0.004）と無他の変数または相互作用は、腕立て伏せの有意な予測因子でした。この分析で使用されるすべてのデータはアンダーソン・ダーリン検定を使用して正規性が確認されました。

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ディスカッション

重要なステップ
この手順では、水生生物の行動研究を実行するために実験室の設定でDOを操作するための簡単​​かつ効率的な方法を提供します。私たちは、直接成果に関連し、この実験を行う際に注意すべきいくつかの重要なステップ/アイテムがあることが見つかりました。試験内では、水、上記ガスの分圧の変化、及びそれに続くDO変動を回避するためにチャンバ圧力を維持するために重要です。プロトコルの「実験の安定性をテストする」の項で説明する手順に従うことが重要です。ストッパーで水1Lフラスコに真空管の完全な水没を確保し、フラスコと栓のシールを点検（室内空気の逆流を防止するために）、およびガスラインを着座し、ワイヤシールをDOは、安定を維持するのを助けることができますチャンバ環境。さらに、チャンバ内の水の量を最大にすること内DOの安定性を向上させる必要があります我々は不規則で不安定なDO操作で、あまりにも少しボリューム結果を発見したとして裁判。

チャンバ内の水の温度を維持することは、内部DOレベルの良好な制御のために不可欠です。私たちは、個々のグループの実験内の冷水の温度を維持することができまし...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フィルターフラスコ 2 L	パイレックス	5340
ラバーストッパー サイズ 6	シグマ-アルドリッチ	Z164534
ナルゲン 180 透明プラスチックチューブ	サーモサイエンフィティック	8001-1216
ウィスパー 60 エアポンプ	テトラ
スタンダード フレキシブルエアラインチューブ	ペンプラックス	ST25
0.25 インチ 銅チューブ	ロウズホームインプルーブ	メント23050
オスホースバーブ	グレイン	ジャー5LWH1
コネクタ	グレイン	ジャー20YZ22
ヘビーデューティ溶存酸素計		Extech407510
ガス	マセソンTRIGAS
ラドナーAF150-580レギュレータ	ガス	RAD64003036

メス窒素エア