Method Article

サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中 E。大腸菌蛍光プレッサーオペレータシステムの使用

DOI:

10.3791/54434

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August 21st, 2016

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1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、大腸菌の複製フォークを失速させ崩壊させるための、部位特異的で可逆的なin vivoタンパク質ブロックを利用するシステムについて説明します。複製ブロックの確立は蛍光顕微鏡法で評価し、中性-中性2次元アガロースゲル電気泳動を使用して複製中間体を可視化します。

Abstract

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密結合タンパク質と様々な病変を含むDNA上に存在する障害物は、深刻な細胞の複製機構の進行を阻害することができます。レプリソームの失速は、複製フォークの崩壊につながる、一部または全部のいずれか、染色体からの解離につながることができます。この崩壊からの回復は、細胞に対して正確に完全な染色体重複、その後分割の必要性です。崩壊が発生したときしたがって、細胞はDNAのフォークを復元し、レプリケーションが高い忠実度で完了することができるようにするために行われる多様な機構を進化させました。以前は、細菌におけるこれらの複製修復経路は、既知の部位に局在化されていないという欠点を有するUVダメージを用いて研究されています。この原稿は、foは複製の失速と崩壊を誘導することができる部位特異的なタンパク質のブロックを作成するために、蛍光プレッサーオペレータシステム（FROS）を利用するシステムを説明します大腸菌でRKS。複製の状態は、蛍光顕微鏡およびDNA複製中間体を用いて、単一の生細胞内で可視化することができる方法のプロトコルの詳細は、2次元のアガロースゲル電気泳動によって分析することができます。レプリソーム構成要素（ 例えば DnaBts）の温度感受性変異体は、複製フォークの同期崩壊を誘導するためにシステムに組み込むことができます。さらに、これらのプロセスに関与している組換えタンパク質およびヘリカーゼの役割は、このシステム内での遺伝子ノックアウトを用いて研究することができます。

Introduction

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DNA複製時には、レプリソームは、その進行を阻害し、DNA上の障害に直面しています。病変とのギャップだけでなく、異常な構造を含むDNA損傷は、1を進むからレプリソームを防ぐことができます。最近、DNAに結合したタンパク質は、フォークの進行2を複製する障害の最も一般的な供給源であることが見出されました。核ブロックでレプリソームの出会いを次のイベントの知識は以前から知られている場所で生きている細胞の染色体にそのようなブロックを誘導することができないことによって制限されてきた。 インビトロ分析は、速度論的挙動の理解を強化しましたそれは核閉塞3、ならびにレプリソーム自体4,5のメカニズムの詳細を満たしているアクティブレプリソームの。レプリケーションの修理の現在の理解は、一般的に、インビボ 6-8 にプラスミドDNAを用いて、損傷剤としてのUVで行われ、研究されていますアップ。それはin vivoで核ブロックに遭遇した後、DNAの修復に関与することができるタンパク質は、一般的に複製ブロックの明確な原因による修復経路内の分子イベントにばらつきがあるかどうか、これらの研究から理解されているがまだ残っています決断される。

ここでは、核のブロックは蛍光プレッサーオペレータシステム（FROS）を使用して、染....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. FROSでレプリケーションをブロック

  1. レプリケーションの閉塞を誘発します
    1. E.の新鮮な一晩培養物を希釈ODを600nmで =希薄複合培地中で0.01 のtetO配列とpKM1 18搬送coli株（0.1％トリプトン、0.05％酵母エキス、0.1％のNaClを、0.17のM KH 2 PO 4、0.72 K 2 HPO 4）、抗生物質は、必要に応じ選択のため。
      注：それは、このシステムと互換性がないような選択のためのテトラサイクリンを追加しないでください。必要なサンプル当たり10ミリリットルに相当する培養液量を確認します。例えば、 図1の実験計画のための培養容積60 mlです。
    2. OD 600 nmで = 0.05から0.1になるまで振とうしながら30℃で成長します。非誘導対照として働き、pKM1からのTetR-YFPの産生を誘導するために、残りの培養液に0.1％のアラビノースを追加するために10ミリリットルのサンプルを削除してください。非誘導および誘導の両方の成長を続けて文化。 1時間後、蛍光顕微鏡（セクション2を参照）を用いて誘導文化の各セル内の単一の焦点が存在するかどうかを確認。
    3. 誘導された細胞は（細胞の....

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Results

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FROSは、生きた細胞12,18で可視化することが複製中間体を可能に誘導、サイト固有の核ブロックです。細胞をサンプリングするための一般的な実験設計は、図1に示されている。遺伝的背景におけるサンプリングおよび変化のタイミングは、このようなブロックの修復を研究するための汎用性の高いシステムにします。概略的には、18以前に使用されてきたようなDNAB TSとdnaCの TSと温度感受性変異体は、本システムで利用することができる方法を示しています。

FROSの誘導はE.で行いました図1に示すように、 大腸菌株 非温度感受性株のために。核ブロックが確立されたことを確認するために、細胞を0.1％アラビノースにおける増殖の1時間後に、蛍光顕微鏡を用.......

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Discussion

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染色体の複製中、複製機構はその進行を妨げるさまざまな障害に遭遇します。単一起源の染色体全体が確実に複製されるようにするために、細菌はDNAを修復するための多数の経路を持ち、レプリソームをリロードすることができます20,21。病変、一本鎖切断、二本鎖切断、およびDNAにしっかりと結合したタンパク質は、それぞれ専用の経路を使用して対処できますが、これらの経路には大幅な重複がある可能性があります。生細胞におけるレプリソームに対する最も一般的な障害は、核タンパク質ブロック2です。しかし、レプリソームと核タンパク質遮断の衝突を研究する際の2つの長年の困難は、イベントを染色体上の既知の位置に局在化する方法と、詳細な分析を可能にするためにイベントを十分に頻繁に行う方法でした。大 腸菌 が停滞/崩壊した複製フォークにどのように対処するかについての知識の大部分は、DNA損傷剤としてのUVの使用から来ています。

ここで説明するFROSプロトコルは、レプリソームが複製中に染色体にしっかりと結合したタンパク質に遭遇したときに遭遇するものと同様.......

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Disclosures

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作業はオーストラリア研究評議会[DP11010246]の支援を受けました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
トリプトンSigma-Aldrich16922成長培地成分
塩化ナトリウムVWR27810.364成長培地成分
酵母エキスSigma-Aldrich92144成長培地成分
リン酸カリウム 一塩基性Sigma-AldrichP9791成長培地成分;カリウム緩衝液成分
リン酸カリウム二塩基性Sigma-AldrichP3786成長培地成分;カリウム緩衝成分
L-アラビノースSigma-AldrichA3256TetR-YFP産生の誘導用
アンヒドロテトラサイクリン塩酸塩Sigma-Aldrich37919複製ブローケージの解放
Axioskop 2 蛍光顕微鏡ツァイス452310細胞の可視化
eYFPフィルターセットChroma Technology41028YFP
CCDカメラの浜松オルカAG細胞の可視化
MetaMorph ソフトウェア(分子デバイス)SDR Scientific31282Version 7.8.0.0 この原稿の準備に使用
アガロースバイオラインBIO-41025アガロースプラグおよびゲル電気泳動用
オリジナルガラス撥水剤(Rain-X)AutobarnDIO1470アガロースプラグ製造用
TRISVWRVWRC103157P TE、TBE緩衝液
エチレンジアミン四酢酸Ajax FinechemAJA1800.5 M EDTA 二ナトリウム塩溶液を NaOH で pH 8.0 に調整
アジ化ナトリウムSigma-AldrichS2002静菌剤
塩酸Sigma-Aldrich258148TE緩衝液成分
デオキシコール酸ナトリウムSigma-AldrichD6750細胞溶解緩衝液成分
N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩(サルコシル)Sigma-AldrichL5125細胞溶解およびESP緩衝液成分
Rnase ASigma-AldrichR6513細胞溶解バッファーコンポーネント
リゾチームAmresco6300細胞溶解バッファーコンポーネント
Proteinase KAmrescoAM0706ESP バッファーコンポーネント
サブセルモデル 192 CellBioRad1704507電気泳動システム
UVトランスイルミネーター 2000BioRad1708110DNA
の可視化臭化エチジウムバイオラッド1610433DNAの可視化
ホウ酸VWRPROL20185.360TBE成分
Hybond-XL ナイロン memrbaneアマシャムRPN203Sゼータプローブ Memrbane (BioRad 1620159) 3MM
Whatman クロマトグラフィー 論文GE Healthcare Life Sciences3030690Southern blotting
HL-2000 HybrilinkerUVP95-0031-01/02DNAの架橋とサ
ケの精子からのハイブリダイゼーション デオキシリボ核酸Sigma-Aldrich31149ハイブリダイゼーション緩衝液成分
水酸化ナトリウムSigma-AldrichS5881変性緩衝液成分
クエン酸三ナトリウム二水和物VWRPROL27833.363転写バッファー
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)Amresco227洗浄緩衝液成分
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA7906ハイブリダイゼーション緩衝液成分
ランダムヘキサマープライマーバイオラインBIO-38028
クレノウフラグメントニューイングランドバイオラボM0212L
dNTP セットバイオラインBIO-39025
アデノシン 5'-三リン酸-32P-ATPPerkinElmerBLU502A
Storage 蛍光体スクリーンGE Healthcare Life SciencesGEHE28-9564-76BAS-IP MS 3543 E 多目的スタンダード 35 cm x 43 cm スクリーン
台風 FLA 7000GE Healthcare Life Sciences28-9558-09ブロットの可視化
ハイブリダイゼーションボトルUVP07-0194-0235 mm x 300 mm
可視化 。

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
  2. Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. ....

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