少量の組織中のレチノイン酸(RA)レベルを正確に測定する方法は存在しません。このプロトコールでは、RAレポーター細胞株を使用して、E8.5胚およびニューロスフェアにおける相対的なRAレベルの容易で定量的な測定について説明します。
方法論記事
F9 RARE-lacZをセルベースレポーターアッセイを使用したE8.5胚および神経球培養における相対的なレチノイン酸レベルの定量的測定
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この記事について
サマリー
要約
レチノイン酸(RA)は、前後軸と背腹軸のパターン化、体節分化、神経新生、後脳と脊髄のパターン化、および複数の臓器系の発達を調整する重要な発生形態物質です。その化学的性質により、小さな両親媒性脂質であるため、RAの組織学的に直接検出および可視化することは技術的に不可能です。現在、RAの存在と局在を推定する方法は、RAの生物学的活性を検出するレポーターシステムを利用しています。トランスジェニックマウスと細胞株の両方を含む、ほとんどの確立されたレポーターシステムは、RAR-β遺伝子の上流にある非常に強力なRA応答要素(RARE)を利用して、β-ガラクトシダーゼやルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子のRA誘導性発現を促進します。トランスジェニックRARE-LacZマウスは、特に胚発生中のRAシグナル伝達の時空間変化を可視化するのに有用です。ただし、全体的なRAレベルを直接測定するものではありません。レポーターシステムとして、F9 RARE-LacZ細胞株は、RAの単純な検出から組織外植片のRAレベルの定量的測定まで、さまざまな方法で使用できます。ここでは、F9 RARE-LacZレポーター細胞株を用いた胚およびニューロスフェア培養で生成された相対RAレベルの定量的測定について説明します。
概要
レチノイン酸（RA）は、レチノールまたはビタミンAの代謝産物の誘導体であり、いくつかの細胞デヒドロゲナーゼ1の順次活性により製造されます。理由は、その両親媒性の化学的性質のため、それは容易に脂質膜を横断し、可溶性形態形成因子1として作用することができます。それは、核レチノイド受容体に対するリガンドとして作用し、遺伝子発現2-10を活性化することにより、多数の発達及び成体の細胞プロセスを調節する必須の分子です。 RAがなければ、これらのRA受容体（RAR類）プレッサーとしてのDNAと行動で結合するレアアイテム。 RAは、これらの受容体への結合は、標的遺伝子の発現1,5,6で得られた転写活性化因子に変換します。
RAシグナル伝達経路は十分に特徴付けされていますが、RAの小さいサイズ（〜300ダ）と両親媒性の性質は、直接組織学的可視化し、現在RAの測定11技術的に実現不可能になります。 dirのための唯一の方法RAレベルのECT測定は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）11を用いて組織サンプルからRAの単離を介してです。この方法は、典型的には、異なるサンプル12をプールすることによって容易に組織を大量に必要とします。したがって、この技術は、個々の胚またはサンプル/組織の少量でRAレベルの測定のためにあまり適していません。
RAの細胞機能を調査するために、いくつかの方法は、間接的に、RAの存在を推測するために開発されています。これらの方法は、β-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ11,13,14の発現を駆動RARE高応答RAR-βを含むレポーターシステムを利用します。 Rossant ら 13によって生成されたトランスジェニックRARE-LacZレポーターマウスは、 その場 11,13,15,16 に RAシグナル伝達の時空間領域を可視化するための理想的なシステムであるが、定量的な測定には不向きです。トンにF9 RARE-LacZの細胞株14、彼一方、組織外植片11,12,14,17,18におけるRAとRAレベルの定量的測定の検出に有用です。
F9奇形癌細胞は、内因性α-、β-、およびγ-レチノイン酸受容体19を発現し 、RA 19-21への曝露後壁側内胚葉への分化を開始します。 F9細胞は、長い間、それはRAレポーターアッセイのための理想的な細胞株として選ばれた理由であるRAによって誘発される細胞分化のモデルとして確立されています。 Wagnerらにより生成されたF9由来SIL-15 RAレポーター細胞ライン14は 、Eを含有しますヒトβ-レチノイン酸受容体（RAR-β）遺伝子の64-bpのレチノイン酸応答要素（RARE）の1コピーの下流coli'LacZ遺伝子 。安定したクローンを選択し、維持するために、構築物はまた、G418の存在下での選択マーカーとしてアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（NEO R）遺伝子が含まれています。この構築物の共同LacZ染色を介して可視化することができ、この応答はその後、比色法11,12,14,18を用いて定量することができるRAの存在下でβ-ガラクトシダーゼのnfers誘導発現。
この非常に多目的レポーター細胞株は、広くそのような17蝸牛および胚の底板外植片14とレポーター細胞と組織サンプルとの共培養を介して内因性RA産生の検出に使用されてきました。また、このレポーターラインは、別々に、胚脊髄のプールされたセクションを培養し、F9 RARE-LacZ細胞18に、これらの培養物からの馴化培地を添加することにより、開発脊髄におけるRAレベルの定量のために使用されてきました。定量化は、標準的なELISAプレートリーダー11,12,18を使用して比色読み取りを介してLacZ染色後に行きました。最後に、このレポーター細胞株は、monitoriによってRA代謝酵素の存在の検出に使用されていますRAレベル12,18でngの変化。
ここでは、このレポーター細胞株の感受性もまた、個々の共培養E8.5胚から生成されたRAレベルの測定を可能にすることを報告しています。これは、異なる遺伝子型の個々の胚の間の比較を可能にします。具体的な例としては、Gpr161は、RAシグナル伝達経路22を介して部分的には神経胚形成を制御するオーファンGPCRである、と私たちは中の全体的なRAレベル上のGpr161（Gpr161のVL）における劣性突然変異の効果を調査するために、このレポーター細胞株を使用して報告します胚。これに加えて、汎用性と使いやすさ、このレポーター系の自由があっても成人脊髄幹細胞から得られたニューロスフェア培養物中で、別の組織サンプルにおいてRAのレベルを測定し、比較することができます。ここでは、F9 RARE-LacZのRA担当者との直接の共培養による胚および神経球培養における相対的なRAレベルの定量的な決意を記述するorter細胞株。
プロトコル
全ての動物作業は承認ラトガース-RWJMS IACUCの方法に従って行いました。
1.ソリューションとメディアの準備
- 。 表1のとおり株式及び緩衝液を調製表2の通り作業ソリューションを準備します。
2.文化とF9 RARE-LacZ細胞のメンテナンス
- 凍結細胞を解凍
- 表2に詳述されるようにF9 RARE-LacZの細胞培養培地を準備します。
- 室温で30分間0.2％ゼラチン10mLでコート10cmの培養皿（細胞培養処理された）（ 表2参照）。 10ミリリットルの蒸留水の2回のすすぎで過剰ゼラチンを洗い流します。すぐに乾燥からゼラチンを防止するために、フラスコにF9 RARE-LacZの細胞培養培地の9ミリリットルを追加します。
- 3分- 2 37℃の水浴中でF9 RARE-LacZ細胞14のバイアルを解凍します。 （1×10 6細胞/ ml程度）プレートセルコートディッシュCに培地の9ミリリットルをontaining。 37℃、5％CO 2で培養。翌日、培地を変更します。
- F9 RARE-LacZ細胞のメンテナンス
- 1：10の割合で3日間 - すべての2定期的な経過を維持します。
注：これは、それらの分化になりますように、細胞がコンフルエントに成長させてはいけません。 - 80から90パーセントの密集度で培養物を分割します。メディアを取り出して、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の10mlで細胞を洗浄。 PBSを削除し、トリプシンの1ミリリットルを追加し、5分間インキュベートします。培地、上下にピペットおよび分割細胞通過のための午前1時10分の9ミリリットルを追加します。
- 1：10の割合で3日間 - すべての2定期的な経過を維持します。
- F9 RARE-LacZ細胞を凍結
- ステップ2.2.2で詳述するように、90％コンフルエンス - 80でF9 RARE-LacZ細胞を含む10cmの皿をトリプシン処理。 5分間、200×gで15ミリリットルの遠心分離管とスピンに解離細胞を転送します。
- F9 RARE-LacZのFの10ミリリットルで上清と再懸濁細胞ペレットを削除します培地をreezing（ 表2参照）。小分けし、冷凍容器にラベルされたクライオバイアルおよび転送バイアルに1ミリリットル。翌日、液体窒素タンクに-80℃の冷凍庫O / Nと転送バイアルで容器を凍結置きます。
E8.5胚の3解剖
- 交尾ケージセットアップおよびプラグチェック
- セットアップ1交配対を含む交尾ケージを。次の日の朝は、膣のプラグインが存在するかを確認し、プラグが1日0.5 23として発見された日を指定します。日E8.5、収穫の胚で。
- 胚の解剖
- （ 表 2を参照）頚椎脱臼を通してダムを生け贄に捧げる、70％エタノールで腹部をスプレー。手術用はさみを使用して腹部の上に皮膚の上にカット横断を作成し、腹部を露出するように離れて2つのフラップ（前方および後方）を引き出します。同じようなカットを作ります腹膜上腹部を露出させます。
- 子宮を見つけ、はさみ23のペアを使用して卵管と子宮間膜から子宮をリリース。余分な脂肪と血を洗い流し、PBS 1×10ミリリットルとを6cmディッシュ（非細胞培養処理）で子宮を置きます。新鮮な10ミリリットル1×PBSを含む別に6cm皿に移します。
- 手術用はさみを使用してそれを切断して1胚を含む1子宮セパレート。子宮と脱落膜を取り外し、無の2ペアを使用して胚を含む卵黄嚢をリリース。 5鉗子23。
- 胚から卵黄嚢を分離し、遺伝子型決定のために使用されるゲノムDNA抽出のために1.5ミリリットルのマイクロチューブに卵黄嚢を転送します。トリプシンの10μLを含む1.5 mlのマイクロチューブに全胚を転送し、広口径の先端でP20ピペットを使用してください。チューブを氷上に置きます。
- すべての胚が解剖されるまで3.2.4 - を繰り返して3.2.3を繰り返します。
- 胚解離
- 酵素的解離を促進するために、37℃で5分間トリプシンで胚を含む1.5 mlチューブをインキュベートします。
- 粉薬が優しく胚の機械的解離のためのP20ピペッターを使用して、96ウェルプレート中にF9 RARE-LacZ細胞の1つのウェルの上に1解離した胚を含む全10μlの容量をめっき（F9 RARE-LacZ細胞をプレーティングするためのステップ5.1を参照してください。 96ウェルプレート中）。 37℃で培養O / N及び5％CO 2。
- 酵素的解離を促進するために、37℃で5分間トリプシンで胚を含む1.5 mlチューブをインキュベートします。
4.椎弓切除、大人腰椎脊髄の解剖と神経球文化
- 椎弓切除術
- 頸椎脱臼を通して大人（P60）マウスを生け贄に捧げます。
- 70％エタノールで背側をスプレーし、手術用はさみを使用して、横方向のカットを行います。背中や脊柱を露出するために離れて、両方のフラップ（前方および後方）を引き出します。
- 手術用はさみを使用して、背骨を覆う筋肉を切り落とします。肋骨の下、脊髄の腰部の位置を確認します。はさみを使用して、脊髄を露出させるために、この時点で背骨を切断するために、深いカットをします。
- なしで脊椎の腰部を引き上げます。 5鉗子は、脊髄の露出横断面は、実験者に向くように。細かいハサミの先端を使用して、露出端の3時と9時の位置で脊椎や筋肉を切り取ります。鉗子で切断された椎骨の背側フラップをつかみます。腰部脊髄の長さが露出するまで尾側にこれらのカットを続けます。
- 無使用して椎骨から脊髄をリリース。 5と同様に、平滑末端鉗子。 DMEM / F12培地3 mlを含む15mlチューブに脊髄を転送します。すべての腰椎脊髄が単離されているまで氷上で保管してください。
- 脊髄の解剖
- 6cmディッシュに脊髄と培地を注ぎ（非細胞培養処理します）。
- 実体顕微鏡下では、無の2対を用いて神経節や血管を把持することにより、脊髄セグメントの周りに後根神経節と血管を削除します。 5鉗子、ゆっくりと脊髄からそれらを引き離します。無媒体とを6cmディッシュに脊髄セグメントを移し、細かく手術用メスの刃を用いて組織をミンチ。
- ニューロスフェアの解離培地1mlを含有する15mlチューブに移し刻んだ組織（ 表2参照）。氷の上にチューブを入れて、手順4.2.1繰り返す - すべての脊髄が処理されるまで4.2.2を。
- 10分間37℃で解離培地中で細分化した組織を含むチューブをインキュベートし、混合した後、さらに10分間37℃でインキュベートする側のチューブをフリック。酵素消化した後、機械的解離のための直径を減少させるファイアーポリッシュピペットで粉砕します。
注意：実験を実行する前に直径を減少させるファイアーポリッシュピペットを準備します。ガラスパスツールを取りますピペットとは、きれいな綿との広い方の端を差し込みます。 、「レギュラー」「ファイン」、および「極細」：異なる直径を作成するために、アルコールランプ、火ポリッシュ炎でピペットの先端を使用。 "通常の"洗練されたピペットは、直径（〜1ミリメートル）を低下させることなく、エッジのラウンドに難ピペットの終わりを振り回します。 「細かい」（〜> 1ミリメートルと>直径5mm）と「極細」（〜0.5ミリメートル）洗練されたピペットを作成するために、わずかに長い期間のための火炎中でピペットの端を回転させます。 0.5ミリメートル未満の直径を持つピペットを使用しないでください。
- ニューロスフェアの文化
- 10分間、200×gで解離脊髄組織を含むチューブをスピンダウン。ニューロスフェア培養培地の1ミリリットルで上清と再懸細胞ペレットを取り外します（ 表2参照）。解離を促進するために、P200ピペット続いP1,000ピペットで粉砕します。
注：気泡を導入しないでください、これは、細胞生存率を減少させます。 - 血球計数器に移す解離した細胞を10μlおよび細胞数を得ます。神経球培養培地10mlでT25フラスコ中の1×10 5 / 10mlを密度でプレート細胞。ニューロスフェアは、24を表示されるまで7日間、37℃、5％CO 2でインキュベートします。
- 10分間、200×gで解離脊髄組織を含むチューブをスピンダウン。ニューロスフェア培養培地の1ミリリットルで上清と再懸細胞ペレットを取り外します（ 表2参照）。解離を促進するために、P200ピペット続いP1,000ピペットで粉砕します。
- ニューロスフェア解離
- ニューロスフェアの文化を収集し、15 mLのチューブに移します。 10分間、200×gでスピン。背後に1ミリリットルを残して上清の大部分を削除します。細胞ペレットを再懸濁し、単一細胞に、神経球を解離するP1,000ピペットで粉砕します。血球計数器に移す解離した細胞を10μlおよび細胞数を取得します。
- プレート1×10 5、96ウェルプレート（96ウェルプレートにF9 RARE-LacZのメッキについては、セクション5.1を参照）にF9 RARE-LacZのの1つのウェルにわたって神経球細胞を解離しました。プレートの複製として3ウェル。 37℃で培養O / N及び5％CO 2。
E8.5胚および脊髄神経球の5 RAアッセイ
- 96ウェルプレート中にF9 RARE-LacZのめっき
- 収穫E8.5胚またはニューロスフェアの解離の前にある日、RTで30分間、ウェルあたり0.2％ゼラチン100μlでコート96ウェルプレート。ゼラチン出て吸引し、蒸留水200μlで二回すすいでください。
- ステップ2.2.2で詳述するようにトリプシン処理F9 RARE-LacZ細胞を10cm皿に維持しました。プレート1×10 5細胞/ウェルのF9-RARE LacZ細胞が、この時、G418を含まない培地を使用して。
- （ - ごみの大きさに応じて、20 12〜）、ニューロスフェア（3ウェル/遺伝子型）と同様に三連での標準曲線（27ウエル）のための胚の共培養のための十分な井戸を準備します。
- F9 RARE-LacZおよびE8.5胚または脊髄神経球の共培養
- F9の上のセクション3.2およびプレートに詳述するように収穫の胚セクション5.1から96ウェルプレート中のRARE-LacZを。同様に、ステップ4.4で詳述したように96ウェルプレート中のF9 RARE-LacZの上部にニューロスフェア、プレートを解離します。 37℃で培養O / N及び5％CO 2。
- 標準曲線を作成します
- アットの連続希釈によって、100 nMで、10 nMの、1 nMで、100ピコモル、10ピコモル、1ピコモル、100マッサ：、標準曲線を生成するには、次の濃度のオールトランスRA（AT-RA）溶液を調製するために、 F9 RARE-LacZの培地でRA株（ 表1参照）。
- セクション5.1からF9 RARE-LacZの細胞にこれらの異なるで-RA濃度の100μLを加えます。未処理のF9 RARE-LacZの細胞のような負の対照を含むウェルを割り当てます。各RA濃度及び陰性対照ウェルの三連を準備します。 37℃で培養O / N及び5％CO 2。
注：F9 RARE-LacZ細胞は、オールトランスRAの様々な濃度に用量依存的な直線的に応答します。
- RAアッセイ
- 標準曲線との共培養を含む96ウェルプレートのO / N培養後、培地を除去し、15分間2.5％グルタルアルデヒド（ 表2を参照されたい）、RT100μlを加えることによって、培養物を固定します。固定液を削除し、200μlの1×PBS、1回の洗浄あたり10分で二回洗浄します。
- PBSを取り外しおよびLacZ洗浄液200μlで3回洗浄し、洗浄あたり10分（ 表2参照）。 3回目の洗浄の際に、ホイルに包まれた15mlチューブ中のX-gal染色溶液を調製する（ 表2参照）。必要とされているどのくらいの染色液を計算し、適切な量（200μL/ウェル）を準備します。
注：X-gal染色溶液は感光性です。調製後15分以内に染色液を使用します。 - 96ウェルプレートを保持するのに十分な大きさのプラスチック容器に蒸留水で湿らせたペーパータオルを置くことによって加湿チャンバーを準備します。 Xの200μLを加えます96ウェルプレートのウェルあたり-Gal染色液と加湿チャンバー内でプレートを配置します。
- 青色の沈殿物の開発を可能にするために、37℃で96ウェルプレートを含む加湿チャンバーをインキュベートします。 （ - 16〜12時間）E8.5胚のために、プレートO / Nインキュベートします。 8時間 - ニューロスフェア培養のために、4静置します。
- OD 610とイメージングでの吸光度を読みます
- 発色反応後、LacZ染色溶液を除去し、200μlの1×PBSと交換してください。 RAに対するレポーター応答を定量するために、標準的なELISAプレートリーダーを用いて610 nmの吸光度を測定します。カメラを搭載した標準的な実体顕微鏡を用いた画像個々のウェル。
F9 RARE-LacZ細胞の6サブクローニング
- RAにF9 RARE-LacZのrResponseをチェック
- いずれの実験を開始する前に、RAにF9 RARE-LacZ細胞の応答をテストします。プレートF9 RARE-LacZのC96ウェルプレート中のellsは（セクション5.1を参照）、および1 nMの全トランスレチノイン酸（ステップ5.3を参照）を追加します。 37°CO / Nの加湿チャンバー内でインキュベートします。
- 顕微鏡を使用して青色の沈殿物の開発を可視化します。発色がウェルの細胞全体が均一でない場合（左図1Bを参照）、以下に詳述サブクローニングを行います。
- F9 RARE-LacZ細胞のサブクローニング
- ステップ2.2.2で詳述するように10cmの皿で培養F9 RARE-LacZ細胞を分割します。代わりに、1：10の比率で、各コロニーは単一F9 RARE-LacZの細胞から生じるように分離されたコロニーの増殖を可能にするために、10cmの皿に1×10 5細胞/ 10ミリリットルの低播種密度をめっき。
- 2日後、30分間ウェル当たり0.2％ゼラチン500μlのとコート24ウェルプレートを。ゼラチン溶液を除去し、蒸留水500μlのウェルを2回すすぎます。 F9 RARE-LacZの細胞培養培地500μlに水を交換してください。
- 1つのウェルに滅菌P10ピペットチップおよび転送を使用してコロニーを選択してください。 24個々のコロニーを得るために、この24回を行います。 4日- 3、37℃、5％CO 2で培養。
- 2つの24ウェルプレートに個々のコロニーを分割します。文化の中で2日後、1 24ウェルプレートや文化O / Nの各ウェルにRAの1nMのを追加します。高い反応性をテストするためにセクション5.4で説明するようにLacZ染色を実行します。強力かつ均一な反応者を決定することは、十分に顕微鏡下で各色反応を可視化します。
- 強力なサブクローンの応答が決定されると、他の24ウェルプレートから対応する文化を展開します。また、10cmの皿にその植民地を拡大2.3節で詳述されるように、いくつかのバイアルを下に凍結し、他のすべてのコロニーを捨てます。
注：のみ元のコロニーの約4分の1は、高い反応性をもたらします。一般的に、サブクローニングの最初のラウンドは、均一なLacZ染色およびサブクローニングのその後のラウンドにはなりませんに行われる必要があります均一な強いレスポンダを達成。
結果
F9 RARE-LacZレポーターは、ゼラチンでコーティングされた表面上に成長させた接着性胚性癌細胞株です。レポーター構築物は、細胞がβ-ガラクトシダーゼ。11,12,14,18の比例誘導とRAに定量的に対応できるようになります。これらの細胞は、上皮形態（ 図1A）を表示します 。 1：10の割合で3日間 - その高い倍加率のために、これらの細胞は、すべての2を分割することをお勧めします。このレポーター細胞株との作業中に、私たちも培地へG418を添加して、RAに対するこれらの細胞の応答は、数回の継代（ 左側の 図1B）後に弱く、これはレポーターの能力に影響を与えることができることを観察しましたこの細胞株。応答性のこの損失は、後の継代における導入遺伝子の部分的な喪失に起因し得ます。このように、定期的なサブクローニングは、RA（ 図に強力かつ均一な応答者を確保する必要があります1B、右）。
この細胞株の様々な用途は、以前12,14-18を公表してきたが、ここで報告異なる遺伝子型を有する個体E8.5胚からの内因性RAのレベルを測定するために、この細胞株の使用です。 22シグナル伝達の減少胚性RAにおけるGpr161 VL / VL変異をもたらします。 F9 RARE-LacZ細胞との解離胚の共培養によって示されるように、これらのGpr161 VL / VL胚は野生型同腹仔（ 図2A）と比較して、内因性RAが減少しています。なぜならまた、ここで報告このレポーター細胞株の多様性、成人Gpr161 重量/ wtマウス（ 図2B）から得られたニューロスフェア培養により産RAレベルを検出するために、これらの細胞の新規な使用です。このレポーター細胞株は、内因性RAを生成成人脊髄性幹細胞からのニューロスフェア培養物を示すことができました。偉大な差分染色強度のレンスは、E8.5胚に比べて脊髄の神経球に大きいレポーター細胞応答を示しています。これは、原因ニューロスフェア培養物はE8.5胚よりも均質であり、したがって、より多くのRA産生細胞が含まれているという事実である可能性がありE8.5胚に比べて時間をかけて、神経球によって生成されたはるかに大きいRAレベルにすることができます。
レポーター細胞の用量依存性の線形応答で-RAその結果、異なる濃度の添加。この反応は、610 nmの吸光度を読み取ることによって比色測定することができます。生成された標準曲線は、その後、野生型ニューロスフェア培養物（ 図3A）またはE8.5胚（ 図3B）のようなサンプル中のRAのレベルを定量化するために使用することができます。
図1. メイントenanceとF9 RARE-LacZ細胞のサブクローニング。 （A）F9 RARE-LacZ細胞の位相差画像を示しています。これらの細胞は、約10時間の倍加時間を持っているし、3日ごとに渡されなければなりません。 - 1：10の割合で（およそ70〜80％コンフルエンス）（B）とその後のLacZ-RAで1 nMで添加した培養液の定期的なテストを染色は文化がRA（右）に強く、均一な応答者のまま確保するために行わなければなりません。貧困層や不均一な応答者（左）の場合には、サブクローニングを実行する必要があります。スケールは100μmのバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
共培養したサンプル（解離E8.5胚/ニューロスフェア）とF9 RARE-LacZの細胞の 図2 のLacZ染色。（A）E8.5マウス胚様々な遺伝子型のsが解離し、F9 RARE-LacZ細胞の上にプレーティングしました。 LacZのは24時間後に染色して共培養したサンプルによって産生される内在性RAにF9 RARE-LacZの細胞の応答の可視化を可能にします。レポーター細胞の減少反応により可視化減少内因性RAにおけるGpr161 VL変異の結果（B）は、左。成体の脊髄の神経幹細胞から培養された神経球の位相差画像を示しています。右。大人Gpr161 重量/重量脊髄由来神経球を分離し、F9 RARE-LacZ細胞の上にプレーティングしました。 LacZの染色後、青色の沈殿物の存在は、これらの神経球中の内因性RAの存在を示します。ニューロスフェアとE8.5胚の共培養の間の染色強度の差は、E8.5胚よりニューロスフェア中にRAの存在のより高いレベルを示しています。スケールは100μmのバー。ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3 標準曲線とRAレベルの比色定量。F9 RARE-LacZのレポーター細胞株の反応は、標準的なELISAプレートリーダーを用いて610 nmで比色測定することができる。（A）の相対的なRAレベルを定量するために使用される代表的な標準曲線を野生型ニューロスフェア培養秒。 （B）共培養E8.5胚からの相対的なRAレベルの定量。 N = 3。 * P <0.05、スチューデントのt検定。エラーバーはSEM。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| サントCKのバッファ/ソリューション | コンポーネント | 保管条件 |
| 10％デオキシコール酸ナトリウム一水和物（C 24 H 39 NaOが4・H 2 O） | 100ミリリットルのdH 2 Oで10ミリリットル | 4ºC |
| 1 M塩化マグネシウム（MgCl 2） | RT | |
| 100Xフェロシアン化カリウム（K 4 [Fe（CN）6]を・3H 6 O） | 10ミリリットルのdH 2 O中2.12グラム | 暗所でRT |
| 100倍のフェリシアン化カリウム（K 3 [Fe（CN）6]を） | 10ミリリットルのdH 2 O中1.64グラム | 暗所でRT |
| 20 mg / mlでのX-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド） | 20mg / mlストック溶液を作るために、5 mlのジメチルホルムアミドを加えます | -20ºC |
| 10 mMの（3 mg / mlで）すべて-TRANSレチノイン酸 | 16.67ミリリットルの無水エタノール中に50mgを溶解します。 1ミリリットルのアリコートを準備します。 | 1.5ミリリットルアンバー微量遠心チューブで暗所で-80ºC、 |
| パパイン | 7ミリリットルHBSSで1バイアルを溶解 | 4ºC |
表1バッファとソリューションの組成物。
| ワーキングバッファ/ソリューション | コンポーネント | 保管条件 |
| F9 RARE-LacZの細胞培養培地 | 50 mlのウシ胎児血清（FBS）（最終濃度10％） | フィルター滅菌します。 |
| 5ミリリットル100×ペニシリンストレプトマイシン（最終濃度1X） | 4ºCで保管してください。 | |
| 4mlの50 mg / mlでG418（最終濃度0.4 mg / mlで） | ||
| 500 mlのDMEM / F-12（L-グルタミンおよびHEPESを含みます） | ||
| 0.2％ゼラチン | 25 mlの2.0％ゼラチン | 4ºCで保管してください。 |
| 80mlを蒸留水 | ||
| よく混ぜます | ||
| 70％エタノール | 30 mlの95％エタノール | スプレーボトルに入れます。 |
| 70mlを蒸留水 | RTで保存 | |
| 神経球分離培地 | 1ミリリットル20Uパパイン | 新鮮なたびを準備 |
| 100μlの13 mg / mlでトリプシン | ||
| 100μlの7 mg / mlでヒアルロン酸 | ||
| 28μlの10 mg / mlでのDNaseI | ||
| 50μlの4mgの/ mlのキヌレン酸 | ||
| ニューロスフェア培養培地 | DMEM / F-12（L-グルタミンおよびHEPESを含みます） | 新鮮なたびを準備 |
| 2％のB-27サプリメント | ||
| 20ng / mlの線維芽細胞増殖因子（FGF） | ||
| 20ng上皮成長因子（EGF） | ||
| 2.5％グルタルアルデヒド | 250μlの50％グルタルアルデヒド | 新鮮なたびを準備 |
| 4750μlの1×PBS | ||
| LacZを洗浄溶液 | 0.5 10mlの％のデオキシコール酸（最終濃度0.1％） | 4ºCで保管してください。 |
| 1.0ミリリットル100％NP-40（最終濃度0.2％） | ||
| 50ミリリットル10X PBS | ||
| 500ミリリットルの蒸留水 | ||
| X-gal染色溶液 | 1xのフェロシアン化カリウム | 新鮮なたびを準備 |
| 1xのフェリシアン化カリウム | ||
| 1mg / mlのX-galを | ||
| LacZの洗浄液を使用して、適切なボリュームに | ||
| F9 RARE-LacZを凍結培地 | F9 RARE-LacZの培地+ 5％DMSO | 新鮮なたびを準備 |
表2ワーキングバッファーおよびソリューションの組成物。
ディスカッション
F9 RARE-LacZの細胞ライン14は、組織外植片12,14,17,18によって生成されるRAの検出のために使用することができる強力なシステムです。これは、RA 12,14,18と、未処理の細胞で検出された非特異的な応答なしで、100 fMのような低いRAの濃度に敏感です。さらに、レポーター細胞は、このようにLacZ反応が定量化RAレベル12,14,18の大きさを決定するために使用することができるように、濃度の特定の範囲内に直線的にオールトランスRAに応答します。ここに提示され、迅速かつ簡単にRAのレポーターアッセイは、胚培養成体神経幹細胞の可視化（ 図 2）との相対的な定量測定（ 図3）のためのF9 RARE-LacZのレポーター細胞株を利用します。 図2に示すように、このレポーターシステムは、個々のサンプル間の内因性RAレベルの比較を可能にする。RAを検出することができるように十分に敏感です培養したニューロスフェア（ 図2B）によって生成され、個々のE8.5胚（ 図2A）と同様にRAによって生成されます。 RAの濃度を変化させることに、この細胞株の用量依存的応答は、サンプル（ 図3B）との間の相対的なRAレベルのサンプル中のRAレベル（ 図3A）の定量、ならびに比較を可能にします。また、F9 RAREレポーター細胞株は、インキュベーションの時間をかけて組織サンプルにより生成されるRAの全体的な量を測定することに留意することが重要です。これは、RA合成と異化の正味残高に相当します。
F9 RARE-LacZの細胞レポーターシステムは、高感度かつ汎用性であるが、我々は、このシステムの信頼性を確保するために組み込まれているいくつかの重要なトラブルシューティングの手順があります。 図1に示すように、まず、彼らにGをさせることなく、定期的な継代によって、これらの細胞の健康を維持することが重要ですコンフルエントに行。第二に、我々が観察した後に継代培養物は常にG418での選択下で維持されている場合でも、一貫性のないRAレスポンスをもたらす傾向があります。これを解決するには、20継代後の培養物を破棄して新しいバイアルを解凍することをお勧めします。また、定期的なチェックは、レポーター細胞がまだメディアでのRAの存在に強い応答者であることを保証するために実行する必要があります。第三に、初期の通路が強いレスポンダが（ 図1B、RIGHトン）が得られるまで、必要があるかもしれRA（ 左図1B）、1またはサブクローニングのいくつかのラウンドに乏しいまたは不均一な応答が表示されます。共培養の前に最後には、そのような胚およびニューロスフェアのような組織試料は、単一の細胞に解離することをお勧めします。私たちは、より一貫性の比色測定中の試料の結果の解離を観察しています。解離した細胞はユニであるように、これは、培養ウェルにおけるRAのより均一な分布に起因する可能性がありますレポーター細胞を使用してフォームの連絡先。
いくつかの変更は、元のプロトコル14に行われました。まず、F9 RARE-LacZ細胞のRA応答は、直接細胞を固定し、610 nmでの吸光度を測定する代わりに、細胞を収集し、β-ガラクトシダーゼ活性の14のための溶解物を分析することによって定量しました。別の修飾は、RA応答の定量化の前にF9 RARE-LacZの解離したサンプルの直接の共培養です。以前の方法は、個別のサンプルを培養し、これらの培養物からF9 RARE-LacZを16,18にのみメディアを追加することを報告しました。
それは、強力なシステムであるにもかかわらず、F9 RARE-LacZレポーターアッセイは、いくつかの制限があります。このレポーター細胞株の1つの制限は、それは、オールトランスRAの存在に強く応答するが、それはまた、9-シス-RA及び13-シスRAを含む他のレチノイン酸異性体に応答することです。しかしながら、それらは、オールトランスRAのコンパに敏感100倍です他の異性体18に赤。このシステムの別の制限は、線形用量依存性応答はわずか10 -7に10 -13 Mの間に入ることであるMで-RA 14,18;したがって、これらの範囲外RAレベルを比較する場合、測定値が直線範囲内に入るまで、サンプルの連続希釈を行う必要があるかもしれません。これは主に比色アッセイであるので、最後に、発色のエンドポイントは、サンプルと実験の間で変化します。これにより、標準曲線が常にレポーター細胞応答の定量化のためにそれを使用するためにすべての単一の実験のために並列に播種することが重要です。
結論として、我々はニューロスフェアで、以前に報告されていない、E8.5胚において定量的にRAのレベルを測定し、F9キーRARE-LacZのRAレポーター細胞株の使用を報告しています。このレポーターシステムの汎用性は、実質的に任意の細胞または組織型、およびmにおけるRAレベルの定量化を可能にすることができますAY将来的に多様なアプリケーションの開発につながります。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
F9 RARE-LacZ細胞と技術サポートを提供してくださったMichael Wagner博士(SUNYダウンステートメディカルセンター)とBen Thiede博士(バージニア大学のJeff Corwin研究室)に感謝いたします。本研究は、ニュージャージー州脊髄研究委員会(NJCSCR)(助成金番号:10-3092-SCR-E-0)およびニュージャージー州脳損傷研究委員会(NJCBIR)(助成金番号:CBIR13FEL006)の資金提供を受けています。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| C3H/HeSn-Gpr161vl/J マウス | 株 Jackson Laboratory | 000316 | |
| Michael Wagner 博士 (SUNY Downstate Medical Center) および Ben Thiede 博士 (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) | |||
| DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES) | ThermoFisher Scientific | 11330-057 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 26140-079 | -20 °Cで保管。Cを10mlのアリコートに含ませて、凍結融解を繰り返さないようにします。37°Cで暖かい。培地調製用C |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15140-122 | -20°Cで保管してください。Cを10mlのアリコートに含ませて、凍結融解を繰り返さないようにします。感光性 |
| G418 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10131-027 | 4°Cで保管。C;感光性 |
| 2% ゼラチン | Sigma Aldrich | G1393 | 4 °C で保存。C |
| B-27 supplement (2 % stock solution) | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | -20 °C;凍結融解の繰り返しを避けるために、1mlアリコートにCを入れます。培地調製のために室温で温める |
| マウス上皮成長因子(EGF) | PeproTech | 315-09 | 100 μ1xPBS中の0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)中のg/mlストック溶液;1x PBSで希釈して作業濃度を調製します。-20°Cで保管します。C |
| マウス線維芽細胞成長因子 (FGF) - 基本的な | PeproTech | 450-33 | 100 μ1x PBS中の0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)中のg/mlストック溶液。1x PBSで希釈して作業濃度を調製します。-20°Cで保管します。C |
| 50% グルタルアルデヒド | アムレスコ | M155 | 4°Cで保存;C |
| デオキシコール酸ナトリウム一水和物 (C24H39NaO4 & middot;H2O) | Sigma Aldrich | D5670 | RT |
| X-gal (5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-&β;-d-ガラクトピラノシド) | Promega | V3941 | 在庫は-20°C;C |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | Sigma Aldrich | 41639 | RT |
| オールトランスレチノイン酸(at-RA) | Sigma Aldrich | R-2625 | 1mlアリコートの在庫を-80°Cで保管します。C;光に非常に敏感 |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12605-010 | RT |
| 0.25% トリプシン-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200-056 | TrypLE Expressの代替品; アリコートして-20°Cで保管;C |
| ハンク平衡塩溶液 (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | 4°C;C |
| 10x リン酸緩衝液 (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | 4 °C;C |
| Papain | Worthington | LK003176 | 4 °C. |
| トリプシン | ワージントン | LS003703-20°Cで1mlのアリコートで保存します。 | |
| ヒアルロン酸 | カルビオケム | 385908 | ストア 200 μ-20°Cのlアリコート |
| DNaseI | ワージントン | LS002139 | 200の店舗μ-20°Cのlアリコート。C |
| キヌレン酸 | Sigma Aldrich | K3375 | 200 の店 μ-20°Cのlアリコート。C |
| 95% エタノール | |||
| Mr. Frosty 冷凍容器 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 5100-0001 | |
| 10 cm 培養皿 (非細胞培養処理済み) | |||
| 10 cm 培養皿 (細胞培養処理済み) | |||
| 6 cm 培養皿 (非細胞培養処理済み) | |||
| 96 ウェル細胞培養プレート | |||
| 1.5 mlマイクロ遠心チューブ | |||
| 1.5 ml琥珀色マイクロ遠心チューブ | |||
| 1.5 mlクライオバイアル37 | |||
| °Cウォーターバス | |||
| 手術用ハサミ細かい | |||
| 手術用ハサミ | |||
| 5号鉗子 | |||
| 鈍い鉗子 | |||
| の刃 | |||
| ツールピペット綿 | |||
| アルコールランプ | |||
| ELISA プレートリーダー | |||
| 実体顕微鏡 |
参考文献
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