炎症効果の正確な評価は、炎症性腸疾患の治療のための潜在的な新薬の評価にとって最も重要です。デジタルホログラフィック顕微鏡は、マウスおよびヒトの結腸組織サンプルの炎症の評価を提供するだけでなく、in vitroでの上皮創傷治癒の自動マルチモーダル評価を提供します。
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方法論記事
デジタルホログラフィック顕微鏡とマルチモーダル定量位相イメージングは、正確に腸の炎症および上皮創傷治癒を評価します
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
炎症性腸疾患の発生率、 すなわち、クローン病および潰瘍性大腸炎は、大幅に過去10年間で増加しています。 IBDの病因は不明のままであり、現在の治療戦略は、免疫系の非特異的抑制に基づいています。具体的に有意にIBDの管理を改善することができ、腸の炎症および上皮創傷治癒を標的とする治療法の開発は、しかし、これは、炎症性の変化を正確に検出する必要があります。現在、潜在的な薬物候補は、通常、 インビボまたはインビトロでの細胞培養に基づく技術を用いて、動物モデルを用いて評価されます。組織学的検査は、通常、サンプルの特性を変えることができ、さらに、調査結果の解釈は研究者の専門知識によって変えることができ、目的の細胞または組織染色することが必要です。デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）は、光路長遅延の検出に基づいて、可能汚れのない定量的位相コントラストイメージング。この結果は、直接絶対生物物理学的パラメータと相関させることを可能にします。私たちは、屈折率測定に基づいて、DHMと組織密度の変化の測定は、大腸炎マウスとヒトの結腸組織標本の異なる層に、染色することなく、炎症性の変化を定量化する方法を示しています。さらに、当社は、創傷領域の簡単な自動化された決意と、そのような移行細胞の乾燥質量と層の厚さなどの形態学的パラメータの同時決意を通じてDHMを使用して可能in vitroでの上皮創傷治癒、の連続マルチモーダルラベルフリーの監視を実証します。結論として、DHMは貴重な、新規かつ定量的なツールの可能なパラメータの絶対値を持つ腸の炎症を評価するための、in vitroでの上皮創傷治癒の簡素化定量化を表し、したがって、翻訳診断uのための高い可能性を秘めていますSE。
概要
炎症性腸疾患（IBD）、 すなわち、潰瘍性大腸炎（UC）およびクローン病（CD）は、消化管1の特発性炎症性障害です。 IBDの根底にある病態生理および潜在的な新薬や新たな診断手法の評価の研究は、特に重要です。基礎研究およびIBD患者の臨床管理の両方で、腸粘膜が注目2,3の焦点となっています。粘膜は、共生細菌、上皮細胞および腸の免疫系の種々の細胞成分間の相互作用は、腸のホメオスタシス4,5を編成れる解剖学的境界を表します。しかし、IBD患者に、制御されていないと持続性の腸の炎症は最終的にそれ自体が局所の炎症6を悪化させる上皮バリア機能の崩壊に終わることができます潰瘍や狭窄などの検出可能な損傷を、粘膜につながります。
上皮は、創傷治癒、炎症ので下記上皮再生のために重要であるだけでなく、消化管手術7後の消化管潰瘍や縫合不全の治癒のためのコア要件です。上皮は治癒がアッセイ治癒インビトロ創傷でシミュレートし、腸の炎症8,9のマウスモデルにすることができます巻か。両方のin vitroおよびin vivoでのアプローチは実験的評価の精度を制限する欠点を持っている。in vitroアッセイを、古典的なスクラッチアッセイのように、蛍光発色団と長引く染色手順....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
全ての動物実験は、ドイツ動物保護法に基づく（Landesamtエリーゼナチュール、UMWELTウントVerbraucherschutz、LANUV、ドイツ）地域の倫理委員会によって承認されました。ミュンスター大学の地元の倫理委員会は、組織学的および顕微鏡分析のためのヒト組織の使用を承認しました。
1.動物と材料
- 地元の動物管理法律に従って女性または20〜25グラムの重量を量る必要DSS-感受性株の雄マウス、および家を使用してください。げっ歯類のための特別な餌を与え、水を自由に飲んでオートクレーブ処理。
- 5日間オートクレーブ水道水で：W / Vデキストラン硫酸ナトリウム（36,000-50,000ダDSS、分子量）の3％を投与することによって急性 DSS大腸炎を誘発します。
注：DSSの効力はメーカーやバッチに応じて非常に可変です。これはダのために、疾患活性の誘導のための最初のサプライヤが提供するDSSのテストILY体重は、信頼性および客観的な指標です。 - 結腸組織試料の組織学的評価のために、実験の終了時にCO 2通気（または国や機関のガイドラインで指定）によってマウスを安楽死させます。
2.実験セットアップDSS-大腸炎とのin vitro
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結果
デジタルホログラフィック顕微鏡用DHMイメージングのための典型的なセットアップ（DHM）
図 1Bに示すように、明視野イメージングおよび定量DHM位相コントラスト撮影を行うために、我々は、倒立顕微鏡を適用しました。 25前述したように、システムは、DHMモジュールを取り付けることによって修正されました。マッハツェンダー構成（ 図 1 A）におけるYAGレーザλ= 532nm）をディジタルホログラムを照明することにより、周波数倍増Ndを光で試料を作製しました。解剖組織をガラスキャリアスライド上にエクスビボで分析しました。 図 1.......
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ディスカッション
私たちは、DHMは、ex vivoでのマウス大腸炎モデルおよびヒトの結腸組織試料における組織学的損傷の正確な評価を提供することを実証している。また、我々は、DHMが連続的に同時に携帯の変化についてのマルチモーダル情報を提供しながら、上皮創傷治癒を監視することができます示します。 DHMでは、デジタルで撮影したホログラムの再構成が数値的に32に行われます。従って、明視野顕微鏡、ゼルニケ位相コントラストおよび微分干渉コントラスト顕微鏡法と比較して、DHMは、任意の後続の数値焦点補正（多焦点画像）27との定量的な位相差を提供します。定量位相イメージングは、光路長の変化の決意に基づいており、従って、使用測定器の高度に無関係です。これは、異なる機器で取得された測定データの比較が簡単になります。また、DHMはオブジェのための唯一の低光強度を必要としますCT照明。これは、未染色解剖組織の低侵襲性の分析を可能にし、生きた細胞の長期的タイムラプス観察の際に必要なサンプルの相互作用の量を最小限に抑えることができます。
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
原稿を校正してくださったFaekah Goharに感謝します。専門的な技術支援を提供してくださったSonja Dufentester氏とElke Weber氏に感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Azoxymethane (AOM) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Cell Culture Flask | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 658170 | |
| Costar Stripette | Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) | TdB 領事館,ウプサラ、スウェーデン | DB001 | |
| DMEM/Ham's F12 | PAA Laboratories - Pasching - オーストリア | E15-813 | |
| EGF | Sigma - Aldrich、Deisenhofen、ドイツ | SPR3196 | |
| エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) | Sigma - Aldrich、Deisenhofen、ドイツ | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences、Erembodegem、ベルギー | 352070 | |
| イソペンタン (2-メチルブタン) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| Mitomycin C | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | M4287 | |
| Microscope Slides | G. Menzel, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
| O.C.T.ティッシュテックコンパウンド | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Pen/Strep/Amphotericin B | Lonza, Verviers, Belgium | 1558 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| RPMI 1640 | Lonza, Verviers, Belgium | 3626 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 0411 | |
| /05/12211095標準食 | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Trypsin EDTA | Lonza, Verviers, Belgium | 7815 | |
| Vitro –Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high | ibidi GmbH, Munich, Germany | 81176 | |
| DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert | ibidi GmbH, ミュンヘン, ドイツ | 80050 | |
| Equipment | |||
| MICROM HM550 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA | 46320 | |
| デジタルホログラフィック顕微鏡 | |||
| コンポーネント | Model | Company | |
| 倒立顕微鏡 | iMIC | Till Photonics, Graefelfing, Germany | |
| Laser Compass 315M | Coherent GmbH, リューベック, ドイツ | ||
| 顕微鏡レンズ | Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 | Zeiss, Goettingen, Germany | |
| CCD camera | DMK 41BF02 | The Imaging Source, ブレーメン, ドイツ |
参考文献
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369 (9573), 1641-1657 (2007).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis i....
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