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方法論記事

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

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DOI：

10.3791/54467

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2016年9月30日

 , 
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology, 2Department of Biomolecular Sciences, Weizmann Institute of Science

この記事について

サマリー

RNA-タンパク質相互作用は、多くの細胞プロセスの中心にあります。ここでは、特定のRNAを単離し、それに関連する新規タンパク質を同定するin vivo法について説明します。これにより、細胞内でRNAがどのように制御されているかに新たな光が当てられる可能性があります。

要約

RNA結合タンパク質(RBP)は、RNAの代謝と調節のあらゆる側面で重要な役割を果たしています。それらの同定は、現代生物学における大きな課題です。特定の標的mRNAに関連するRBPを同定できるin vitroおよびin vivoの方法はごくわずかです。しかし、その主な制限は、非細胞環境下でのRBPの同定(in vitro)や、目的RNAの低効率単離(in vivo)です。RNA結合タンパク質精製および同定(RaPID)法は、酵母におけるこれらの制限を克服し、in vivoで結合するタンパク質の効率的な単離を可能にするために設計されました。これを達成するために、目的のRNAをMS2ループでタグ付けし、MS2結合タンパク質とストレプトアビジン結合タンパク質(SBP)の融合タンパク質と共発現させます。次に、細胞を架橋して溶解し、複合体をストレプトアビジンビーズを介して単離します。その後、タグ付きRNAと共精製するタンパク質は、質量分析によって決定できます。私たちは最近、このプロトコルを使用して、ER関連PMP1 mRNAに関連する新規タンパク質を同定しました。ここでは、RaPIDの詳細なプロトコルを提供し、その制限と利点のいくつかについて説明します。

概要

RNA結合タンパク質（RBPs）はSの約10％を占めセレビシエタンパク質1,2および哺乳動物タンパク質3-5の約15％。これらは、mRNAの転写後プロセシングおよび調節、翻訳、リボソーム生合成、tRNAのアミノアシル化と修正、クロマチンリモデリング、およびより多くのような多くの細胞プロセスに関与しています。 RBPsの重要なサブグループは、mRNA結合タンパク質（mRNPs）6,7です。 mRNAの成熟の過程において、異なるRBPsは、転写物と結合し、その核処理、核のうち輸出、細胞内局在、翻訳および劣化6-8を媒介します 。したがって、任意の時点で特定の転写産物に結合しているRBPsの別個のセットは、その処理し、最終的にその運命を決定します。

mRNAと関連RBPsの識別が大幅に転写後調節の基礎をなす過程の理解を向上させることができます。遺伝的多様顕微鏡、生化学およびバイオインフォマティクス方法は、（9-11に概説）mRNAの調節に関与するタンパク質を同定するために使用されてきました。しかしながら、これらの方法のほんの数は、特定の標的mRNAと関連するタンパク質の同定を可能にします。注目すべきは、酵母細胞における発現ライブラリーをスクリーニングするために餌として関心のmRNAを利用した酵母スリーハイブリッドシステム（Y3H）、です。陽性クローンは、通常の成長の選択またはレポーター発現12-14を通して観察されます。この方法の重要な利点は、細胞環境およびRNA-タンパク質相互作用の強さを測定する能力に走査することができる多数のタンパク質です。欠点は、融合タンパク質の餌または餌RNAのミスフォールディングに、部分的に、非特異的結合に起因する偽陽性の結果の比較的大きい数、により偽陰性の結果のために高い可能性を含みます。

遺伝的アプローチに代わるものは親和性purifiですその関連タンパク質とRNAのカチオン。ポリAを含むmRNAは、オリゴdTカラムの使用によって分離することができ、およびそれらの関連タンパク質は、質量分析によって検出されます。 RNA-タンパク質相互作用は、短距離共有結合を作る架橋によってその細胞コンテキストに保存されています。オリゴdTカラムの使用は、任意のポリA-含むmRNA 3,5,15に関連付けられているプロテオーム全体のグローバルな視点をもたらします。しかし、これは、特定のmRNAに関連付けられているタンパク質のリストを提供していません。非常に少数の方法は、このような識別を達成するために利用可能です。 PAIRの方法は、標的mRNAの16,17に対する相補性を有する核酸のトランスフェクションを伴います。核酸はまた、相互作用部位に近接してRBPsに架橋可能ペプチドに付着されます。架橋後、RBP-ペプチド核酸を単離することができ、プロテオミクス分析に供​​しました。最近、アプタマーベースの方法論がありました正常哺乳動物細胞株18からの抽出物に適用されます。ストレプトアビジンへの改善された親和性を有するRNAアプタマーを開発し、（この場合はAUリッチエレメント（ARE））目的の配列に融合させました。アプタマーARE RNAをストレプトアビジンビーズに付着し、細胞溶解物と混合しました。 ARE配列に関連するタンパク質を精製し、質量分析（MS）により同定しました。この方法は、細胞の設定（ すなわち 、 インビトロ ）の外側に発生する関連付けを検出しているが、mRNAに関連するタンパク質の単離をゲノムにアプタマーを導入し、従って、可能なように、将来的に修飾される可能性が高いにある間細胞環境（ すなわち 、in vivoで ）。遺伝子操作は、十分に確立された酵母では、（教授ジェフGerstの研究室で開発された）迅速法は、in vivo団体19のビューを提供します。ラピッド（MS2コートタンパク質の特異的かつ強力な結合を兼ね備えMS2-MS2 RNA配列に、ストレプトアビジン結合ドメイン（SBP）のストレプトアビジン結合ビーズにCP）。これは、ストレプトアビジンビーズを介してMS2-タグ付けされたmRNAの効率的な精製を可能にします。また、MS2は、ループの12のコピーの発現は、RNAに同時に結合し、その分離の効率を高めるために6 MS2-のCPまで使用できます。このプロトコルは、従って、溶出された試料を質量分析によってプロテオミクス分析に供​​された後、新規のmRNA結合タンパク質の同定を可能にするために示唆されました。

我々は最近、酵母PMP1 mRNAを20に関連付けられた新規タンパク質を同定するための迅速を利用した。PMP1 mRNAが以前にER膜と関連することが示され、その3 '非翻訳領域（UTR）は、この関連21の主要な決定要因であることが判明しました。したがって、PMP1 3 'UTRに結合RBPsその局在に重要な役割を果たす可能性があります。 RAPIDは、液体クロマトグラフが続きますY字型質量分析/質量分析（LC-MS / MS）は、PMP1 20と相互作用する多数の新規タンパク質の同定をもたらしました。ここで、我々は急速な方法論、実行する必要がある重要なコントロール、および収量と特異性を向上させることができる技術的なヒントの詳細なプロトコルを提供します。

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プロトコル

注：12 MS2結合部位からなる配列を挿入（MS2はループ; MS2L）を希望のゲノム遺伝子座に、通常のオープンリーディングフレーム（ORF）および3 'UTRの間。この統合のための詳細なプロトコルは、他の場所22に設けられています。 PCR、ノーザン分析またはRT-PCR 20,23により適切な挿入および発現を確認してください。統合が3'UTRの合成に介入しなかったことを確認することが重要です。また、誘導性プロモーター（メチオニン枯渇）の発現下SBPに融合プラスミド発現MS2-CPはまた、細胞24に導入されるべきです。導入MS12ループを除く同一の株は、非特異的なシグナルを検出するための対照として使用されるべきです。

1.迅速な精製

  1. MS2タグmRNAの20を発現する （目的の遺伝子の発現レベルに応じて酵母細胞の250-1,000 mlで使用）、酵母細胞を500mlの成長と適切な増殖培地（ 例えば 、合成デキストロース（SD）選択培地）中で30°Cの時に1.0 - MS2-CP-GFP-SBP融合タンパク質24は 600 0.8 ODまで。
  2. RTで4分間、3000×gで遠心分離細胞と上清を捨てます。
  3. MS2の発現を誘導するために30°Cの時60分- 1×リン酸洗浄細胞は、生理食塩水（PBS）、（ステップ1.2）以前のように遠心分離、メチオニンなしのSD等量の（ステップ1.1）で再懸濁し、45インキュベートをバッファリング-CP-GFP-SBP融合タンパク質。
    注：長い誘導時間は、GFPの凝集を引き起こす可能性があります。
  4. 細胞の脇に10ミリリットルを設定し、単純な「ホットフェノール」の方法25を使用して、このサンプルからRNAを抽出します。注意：フェノールは非常に有毒であり、その安全上の指示に従って処理してください。
    注：このRNAが単離されたRNA（ 図1A）の品質のために良いの参照です。
  5. 500ミリリットルの細胞については、最終的なCに1.35ミリリットル37％ホルムアルデヒドを追加RNA-タンパク質複合体を架橋するために、0.1％のoncentration。 10分間30°Cのインキュベーションを続けます。注意：ホルムアルデヒドは非常に有毒であり、その安全上の指示に従って処理してください。
  6. 0.125 Mの最終濃度を2.5 26.5 mlのMグリシンを追加し、架橋を停止する3分間インキュベートします。上のこの段階から、RNA分解を最小限に抑えるために氷の上にすべてをかけます。
  7. 4°Cので4分間、3000×gで遠心分離細胞と45ミリリットルの冷1×PBSで洗浄します。
  8. 最初の細胞培養の100ミリリットル当たり1ミリリットル急速な溶解緩衝液中で細胞を再懸濁し。
  9. スクリューキャップマイクロチューブに500μlのアリコートに分割し、各アリコート（約フル0.2ミリリットルのPCRチューブ）に冷却されたガラスビーズの〜400ミリグラムを追加します。
  10. ビーズにおける溶解細胞を3分間ビーター。直ちに氷上に溶解液を入れました。
    注：RNA分解の主な原因である細胞溶解リリース細胞のRNaseを、。迅速な溶解緩衝液は、RNアーゼINHIを高濃度に含んでいますこのような非特異的RNase阻害剤ヘパリンと特異的阻害剤としてbitors、。素早く作業と冷たいすべてを維持することも推奨されます。
  11. 新しいチューブにライセートを転送します。ピアースホット針（0.8ミリメートル×40 mm）の各マイクロチューブの底に小さな穴と、15 mlチューブの上にマイクロチューブを配置します。マイクロチューブや15ミリリットルチューブ間のアダプタとして5ミリリットル注射器のヘッドを使用してください。 4 O℃で1分間、3,000×gでチューブアセンブリを遠心
  12. 細胞の破片をクリアするには、4 O℃で10分間万×gで新しい1.5 mlチューブと遠心分離機にフロースルー15mlチューブからの転送。
  13. それぞれのプールシングル15ミリリットルチューブにすべての1.5ミリリットルチューブからの上清、および脇RNAとタンパク質を単離するための溶解液の1/50と1/100量を設定し、。
    注：これらは、その後の分析のための「入力」のサンプル（ 図1）として機能します。
  14. 私の500ミリリットル当たりアビジン300μgのを追加します。nitial酵母培養し、一定の圧延（10回転）の下で4°Cの時に（これは10分に短縮することができます）30分間インキュベートします。
    注：ストレプトアビジンビーズへの結合からアビジンブロックビオチンおよびビオチン化タンパク質。
  15. 細胞溶解物とのインキュベーション前に、ストレプトアビジンビーズを事前に洗います。
    1. 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにストレプトアビジンビーズスラリーの約300μLを移し、上部の上清を除去します。これは、ビーズを250μlになります。迅速な溶解用緩衝液1mlで2回ビーズを洗浄してください。各ステップの間に4 O Cで2分間、660×gでストレプトアビジンビーズを遠心します。
    2. 迅速な溶解緩衝液0.5mlを、10 mg / mlでBSAおよび10mg / mlの酵母tRNAの10μlを0.5mlで1時間インキュベートすることによってビーズを遮断します。必要に応じて、ビーズを回転させながら4°Cのでブロッキング溶液中でO / Nままにすることができます。
    3. 急速な溶解緩衝液1mlで二回洗浄します。
      注：磁気ビーズは、時間とbackgrを減少させるためにも使用することができますound。これらは、しかしながら、セファロースビーズより低い容量を有します。
  16. （ステップ1.14から）アビジン含有溶解液に予め洗浄したストレプトアビジンビーズの250μlを添加して、一定の回転（10回転）と4℃で1時間インキュベートします。
    注：このインキュベーション時間は、十分な結合時間を提供し、RNA分解の可能性を最小限に抑えるとの間の妥協です。
  17. ストレプトアビジンビーズを消去し、新しい15mlチューブに上清を移す4 O℃で2分間、660×gで遠心分離します。それぞれ、脇RNAとタンパク質を単離するための溶解液の1/50と1/100量を設定します。
    注：これらは、「未結合」のサンプルになります。
  18. 急速な溶解緩衝液1mlでビーズを洗浄し、軽く振って、新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移し、ステップ1.17のように遠心分離。この手順を3回繰り返します。
  19. 4℃で5分間、1迅速な洗浄緩衝液のmlであり、この時間回転（10回転）でビーズを洗浄します。二回、この手順を繰り返します。
  20. 上記のように1×PBSと遠心1mlでビーズを洗浄します。
  21. 1×PBS120μlの再びビーズを洗浄します。遠心分離は、上記のように、そして「ウォッシュ」サンプルとしてRNAとタンパク質抽出のための全体上清を取ります。
    注：この最後の洗浄サンプルは、洗浄のストリンジェンシーを示しますし、溶出サンプルと同じボリュームである必要があります。これは、その後のアッセイの処理およびロードを簡素化します。
  22. カラムからRNAおよびRNA結合タンパク質を溶出するために、1×PBSで6 mMのビオチンの120μlを添加し、一定の回転（10回転）で4℃で45分間インキュベートします。
  23. 遠心分離機は、ビーズのように、上記と新しい1.5 mlチューブに溶出された物質を移します。再び溶出された試料をスピンし、ビーズのないキャリーオーバーを確保しないように新しい1.5 mlチューブに上相を転送します。
  24. RNAまたはタンパク質抽出のためのサンプルを取ります。
    注：撮影したボリュームは、目的のRNAまたはタンパク質の以下のアッセイおよび発現レベルに依存すべき。ガイドラインとしては、ノーザン分析26のために、新しいタンパク質を発見するために29ウエスタンブロット23,27またはRT-PCR 28のために、20％を取り、質量分析のために、サンプルの80％を取る、全体のサンプルを取ります。

2. RNA抽出

  1. 2倍架橋反転バッファーを等量加え、65℃で45分間インキュベートします。 RNA抽出のために直接進みます。
    注：架橋反転バッファが大幅にRNA抽出20を向上させるエチレンジアミン四酢酸（EDTA）が含まれています。
  2. 「入力」と「未結合」のサンプル（1.13と1.17ステップ）からRNAを抽出するためにクロロホルム法26：標準のフェノールを使用してください。
    注：これらのサンプルは、アッセイを利用し、その後の逆転写酵素（RT）を阻害することができるRNase阻害剤ヘパリンを多量に含む（ 例えば 、RT-PCR）、したがって、LiClを沈殿30は、それを取り除くことが推奨されます。 「WASH」と「溶出」サンプル（1.21と1.24ステップ）は、RNAの低量が含まれており、次のような工程を経て沈殿させます。
  3. 「洗浄」と「溶出」サンプルに8Mグアニジン塩酸（のGuHCl）と100％の2倍容量のエタノールを等量加えます。少なくとも2時間、-80℃でインキュベートします。
    注：グアニジンを効率的にタンパク質を変性し、それによって試料中のRNaseおよびプロテアーゼを阻害します。
  4. 30分20,000×gで、4℃で遠心分離し、上清を捨てます。 20,000×gで再び冷たい80％エタノールおよび遠心分離機で15分間、4°Cをペレットを洗浄。
  5. RNaseを含まない水400μlの中でRNAペレットを溶解し、残ったのGuHClまたは他の汚染物質を除去するために再び沈殿します。 3 M酢酸ナトリウム、pH 5.2および100％エタノール800μlの40μlのを追加し、少なくとも1時間、-20℃でインキュベートします。
  6. 遠心分離し、ステップ2.4のように洗浄し、10μlのチップですべてのエタノールを除去。 RNAペルを再懸濁し10μlのRNaseフリー水でら。 RNAペレットは通常表示されないように細心の注意を払ってください。
    注：23（ 図1）で説明したように試料をノーザン分析のために使用することができます。

3.タンパク質ウエスタンブロットまたは質量分析のための準備

  1. タンパク質試料に4倍のLaemmliサンプルバッファー（LSB）の1/3量を加え、RNAとタンパク質の架橋を逆に65℃で45分間インキュベートします。
    注：サンプルは-20℃で保存することができます。
  2. SDSポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）31上のタンパク質を実行します。分析すべきタンパク質のサイズに応じてゲルの割合を調整します。
    注：10％アクリルアミドゲルは、分離の広い範囲を提供し、第一近似として良いです。
  3. 分離効率（ 図 1C）の制御のための標準的なイムノブロット分析27のように膜にタンパク質を移します。クマシーブルーRのいずれかで染色質量分析の前に、250または銀染色。
    注：それはより敏感で、より良い検出（ 図1B）ことができますので、シルバーステインは好ましい選択です。染色は手動で調製した溶液または市販のキットのいずれかで行うことができます。最終的な染料溶液中のゲルのインキュベーション時間は、実験的に決定されるべきです。長いインキュベーションは、低濃度タンパク質を明らかにすることができるが、このようなMS2-CP-SBP-GFPのような高度に発現されたタンパク質は、上で染色すると、その周辺でタンパク質を取り巻く隠すことが発生する可能性があります。さらに、高いバックグラウンドが発生することがあります。慎重に反応を追跡し、適切な時に停止液を追加します。
  4. ゲルからバンドを切り取り、1.5 mlチューブに移します。 -20℃で保存サンプルは、またはLC-MS / MS分析32に続いてタンパク質抽出及びトリプシン消化のために送信します。
  5. ゲル分離工程を除外するための代替プロテオミクスアプローチとして、そうでステップ1.24から溶出された材料を消化LC-MS / MS分析33にトリプシンと対象を使用してリューション。
    注：SDS-PAGE分離を省略すると、プロトコルが単純化され、歩留まりを向上させます。ただし、サンプルは、洗剤NP-40、質量分析を阻害するの痕跡が含まれている可能性があります。この問題を克服するために、次の手順を実行します。
    1. 15分- 10のためにSDS-PAGE 31上のタンパク質を実行します。
    2. レーンの全体部分を切り取り（ すなわち 、タンパク質が入っています）。
      注：タンパク質試料が少量のタンパク質のシグナルを不明瞭にすることができるMS2-CP-SBPの有意な量のタンパク質が含まれる場合があります。

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結果

RAPIDは、その関連タンパク質との特異的標的RNAの単離を可能にします。その成功のために重要なことにより、タンパク質の十分な量を得る、可能な限り無傷のRNAを保っています。 RNAの単離効率と品質を決定するために、ノーザン分析は（ 図1A）が行われます。ノーザン分析は、直接迅速の効率と品質を報告するという利点を有します。したがって、完全長および分解生成物の相対量は、単一の実行で決定することができます。リボソームRNA（rRNAの）は、エチジウムブロマイド染色で容易に検出され、溶出試料中のrRNAの欠如は、精製のストリンジェンシーを示しています。精製のストリンジェンシーおよび特異性はさらに、溶出サンプル中のタグの付いていないmRNAのシグナルの欠如（ACT1下のパネル）によって実証されています。 ACT1のサイズではないFPR1レーンで見かけた信号は、前から残っていますMS2Lプローブとviousハイブリダイゼーション。ノーザン分析は、入力RNAが熱フェノールプロトコル（C / O ACT1プローブパネル）により精製したRNAと比較して...

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ディスカッション

様々な方法は、関連するタンパク質11,34 35を識別するために、特定のmRNAの単離を使用します。これらの方法は、RNA-タンパク質相互作用を調べるために、in vitroおよびin vivo戦略に適用する。 インビトロ方法は、外因RBPsを捕捉し、RNP複合体36,37を単離するために細胞溶解物を用いてRNAを転写インキュベートします。このタイプの効果的なアプローチは、調節性RNAモチーフ18を結合する新規タンパク質の同定を可能にする、最近発表されました。協会は細胞環境の外部で発生するため、これらの方法の欠点は、非特異的RBPsの結合である。彼らの自然な設定で、RNA-タンパク質関連のより良いビューを提供することができる一方で、タンパク質が架橋されているインビボ方法、。さらに、架橋は、単離の間、より高いストリンジェンシー、したがって、より高い特異性を可能にします。 PAIRアプローチ17は、アンチセンスのトランスフェク...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

我々は、迅速なプロトコルを設定し、必要なプラスミドを提供することで、それらの有益な助言のための教授ジェフGerstとボリスSlobodinに感謝します。また、LC-MS / MS分析と彼女の助けをSmolerプロテオミクスセンターからこのプロトコルと博士タマルジブを確立する上で彼女の助けのために博士Avigail ATIR-ランデに感謝します。我々はYEF3抗体について教授TG Kinzy（ラトガーズ）をお願いいたします。この作品は、国間科学財団からの助成金2011013によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
トリスシグT1503
SDSバイオラボ1981232300
DTTsigmaD9779
酸性フェノール (pH 4.3)σP4682
酸性フェノール:クロロホルム (5:1, pH 4.3)σP1944
クロロホルムバイオラボ3080521
ホルムアルデヒドフルタロム5551820
グリシンシグマG7126
NP-40バイオケム492016
ヘパリンシグマH3393
ニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)シグマP7626
ペプチンシグマL2884
プロチニンシグマA1153
大豆トリプシン阻害剤ΣT9003
プスタチンΣP5318
DNase IプロメガM610A
リボヌクレアーゼ インヒビタータカラ2313A
ガラスビーズザルトリウスBBI-85417010.4-0.6mm 径 
Mini BeadBeaterBioSpecMini BeadBeater 16
グアニジニウムSigmaG4505
AvidinSigmaA9275
ストレプトアビジン ビーズGE Healthcare 17-5113-01
ウシ血清アルブミン(BSA)ΣA7906
酵母tRNAΣR8508
ビオチンΣB4501
酵母エキスBacto288620
ペプトンBacto211677
GlucoseΣG8270
1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)
0.2 M NaOH
4x Laemmli Sample Buffer (LSB)0.2 M Tris-Hcl pH 6.8、8% SDS、0.4 M DTT、40% グリセロール、0.04% ブロモフェノールブルー。
ホットフェノール溶解バッファー10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS 
3 M 酢酸ナトリウム pH 5.2
100% および 70% エタノール (EtOH)
RNase フリー水
RaPID 溶解バッファー20 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、1.8 mM MgCl<サブ>2、0.5% NP-40、5 mg/ml ヘパリン、1 mM ジチオスレイトール (DTT)、1 mM フェニルメチルスルホニル フッ化物 (PMSF)、10 & micro;g / mlロイペプチン、10 µg/ml アプロチニン、10 µg/ml大豆トリプシン阻害剤、10 µg/ml ペプスタチン、20 U/ml DNase I、100 U/ml リボヌクレアーゼ 阻害 剤。
2x 架橋反転バッファー100 mM Tris pH 7.4、10 mM EDTA、20 mM DTT、2 % SDS。
RaPID 洗浄バッファー20 mM Tris-HCl pH 7.5,  300 mM NaCl, 0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus KitBio-Rad 161-0449ポリアクリルアミドゲルSD選択培地中のタンパク質検出用
 1.7 g/l 酵母窒素塩基 (アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない)、5 g/l 硫酸アンモニウム、2% グルコース、350 mg/l トレオニン、40 mg/l メチオニン、40 mg/l アデニン、50 mg/l リジン、50 mg/l トリプトファン、20 mg/l ヒスチジン、80 mg/l ロイシン、30 mg/l チロシン、40 mg/l アルギニン
抗 eEF3 (EF3A、YEF3)Kinzy TGからのギフトです。(UMDNJロバートウッドジョンソン医科大学)1:5,000
抗GFP抗体Santa Cruzsc-83341:3,000
抗ウサギIgG-HRP標識SIGMAA91691:10,000
マ カルフェロイアペ

参考文献

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