「ファゴソーム閉鎖アッセイ」全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて、三次元的にファゴソーム形成を可視化します

サマリー

全反射蛍光顕微鏡を用いて、生きたマクロファージにおける前例のない高分解能のファゴソーム形成とクロージャを3次元で可視化するための実験設定について説明します。これにより、食細胞カップの基部、伸びる偽足、および食細胞の正確な部位を監視できます。

要約

食作用は、微生物や細胞の破片を内在化して排除するために特殊な細胞が使用するメカニズムです。これは、粒子の周りの原形質膜の伸長の原動力であるアクチン細胞骨格の深い再配列に依存しています。さらに、大きな物質の効率的な飲み込みは、細胞内コンパートメントの局所的なエキソサイトーシスに依存しています。このプロセスは非常に動的であり、食作用カップの形成中に多数の分子プレーヤーが役割を果たすことが説明されています。しかし、これらすべての分子の時間と空間の正確な制御は、まだとらえどころのないままです。さらに、ファゴソームの閉鎖の最終ステップは、RNA干渉またはドミナントネガティブ変異体による阻害がしばしばファゴサイトークカップ形成の停止をもたらすため、観察が非常に困難でした。

私たちは、全反射蛍光顕微鏡法(TIRFM)と落射蛍光を組み合わせた専用の実験アプローチを設定し、カバースリップに緩く結合した粒子の周囲に成長するファゴソーム内の偽足の伸長とその先端を段階的に監視しています。この方法により、2つの異なる蛍光標識タンパク質について、生細胞内のファゴソームの閉鎖中の偽足の先端とそれらの融合を高解像度で観察することができます。

概要

食作用は、その後、摂取された物質の内在化および分解につながる、認識で始まり、受容体表面への材料の結合の主要な細胞機能です。このような金型細胞性粘菌とアメーバのような単細胞真核生物は、細菌に供給するための食作用を使用していますが、高等生物はプロの細胞と進化してきました。マクロファージや樹状細胞は様々な組織や臓器中の病原体に対する防御の最前線であり、抗原提示およびサイトカイン産生^1-4を通じて適応免疫系を活性化することが重要です。特定の状況下では食作用は、非専門の食細胞、 例えば、内皮細胞および上皮細胞によって行うことができます。このプロセスは、開発中と正常組織のターンオーバーおよびリモデリングのための成人期に恒常性を維持することが重要です。精巣または網膜におけるこのようなセルトリ細胞として最後に、専門的な食細胞色素上皮細胞は、非常に強力な食⁵です。

微生物や細胞破片の劣化が食細胞の表面上の貪食受容体のクラスタリングで開始を発生ファゴソームの形成。このようなFc受容体（FcRで）又は補体受容体（CRS）などのオプソニン受容体のクラスタリングを次の下流のシグナル伝達事象は十分に特徴づけられています。しかし、Toll様受容体（TLR）を含む非オプソニン受容体、レクチン、マンノース受容体およびスカベンジャー受容体多数のもあります。これらの受容体は、マンノースまたはフコース残基、ホスファチジルセリン、およびリ....

プロトコル

注：Lifeact-mCherryを使用したプラスミドは^、17の後に生成された博士ギョームMontagnac、キュリー研究所、パリ、一種の贈り物です。

1.細胞およびトランスフェクション

注：RAW264.7マクロファージをサブコンフルエント完全培地中（RPMI（ロズウェルパーク記念研究所）1640培地に増殖させ、10mMのHEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、50μMのβメルカプトエタノール、2mMのL-グルタミン及び10％FCS（ 100ミリメートルプレートにおけるウシ胎児血清））。これらは、エレクトロポレーションによって、蛍光標識されたタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされます。日常的に約5から6×10 ⁶個^の細胞をそれぞれトランスフェクションまたは同時トランスフェクション用プラスミド20μgのまたは10μgのトランスフェクトされます。エレクトロポレーションまたはリポフェクションに基づいて、トランスフェクションの他の手段は、代替的なアプローチとして使用できることに注意してください。

1. セルリフターで細胞をこすり落とし、数回ピペッティングにより培養液10mlに再懸濁します。
2. 遠心分離機細胞懸濁液を300×gで、スイング角度ローターで、室温で5分。
3. 完全培地の予熱10mlを37℃にてゲンタマイシン10μg/ mlのを補充しました。
4. 遠心分離後、上清....

結果

本稿に記載された実験システムを図1に概略的に示されている。蛍光タグに融合した目的のタンパク質を発現するトランスフェクトRAW264.7マクロファージは、非共有結合的に固定したIgGオプソニン化ヒツジ赤血球（SRBC）と接触するように配置されていますカバースリップ上。マクロファージはそれを巻き込むためにカバースリップからSRBCを切り離すことができます。使用TIRF顕微鏡はTIRF領域からの信号の同時取得が3μm以上のZシフト後落射蛍光モードで偽足との信号の先端に対応することができます。

図2で説明したように、原形質膜100nm以下の領域からクリーンなTIRF信号を確実に全反射蛍光の臨界角を決定することが必須である。 図3は acquisitiの発展を表します「プロトコル・エディタ」と呼ばれるモジュールを介してパラメータにライブ集録ソフトウェアに含まれ.......

ディスカッション

ここで説明する実験プロトコルは、リアルタイムで生細胞で、高分解能で、ファゴソームの形成、特にその閉鎖に従う前例のない方法を提案しています。いくつかの技術的側面について議論する必要があります。まず、アッセイは温度に非常に敏感です。食作用の効率を損なう可能性のある温度変化を避けるために、加熱チャンバーが37°Cであること、およびすべての培地、デバイス、またはセルがチャンバー内に保持されていることを確認することが非常に重要です。微妙な温度変化でファゴソームの形成を防ぐのに十分であることに気づきました。第二に、ここで説明するプロトコルにより、実験全体で使用されるTIRF角度を正確に決定できます。これは、TIRF実験を行う際に大きな利点となり、原形質膜付近での事象について自信を持って結論付けることができると考えています。第三に、一過性にトランスフェクトされた細胞を扱う場合、目的のタンパク質の発現レベルが中程度の細胞を選択することが重要です。ゲノム編集技術の革命により、天然レベルでタンパク質を発現する細胞を扱うことが可能になります。したがって、定量的蛍光顕微鏡法は、生細胞の主要な機能のダイナミクスを探索することが可能になります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗羊赤血球IgG	MP生物医学	55806
ウシ血清アルブミン熱ショック画分、pH 7、≥98%	シグマ	A7906
セルリフター	コーニング	3008
キュベット 4 mm	セルプロジェクト	EP104
DPBS、カルシウムなし、マグネシウムなし	サーモフィッシャーサイエンティフィッシュ	14190-094	室温
エレクトロバッファーキット	セルプロジェクト	EB110
100 mm TC処理 細胞培養ディッシュ	コーニング	353003
遺伝子X細胞パルサー	Biorad	165-2661
ゲンタマイシン溶液	Sigma	G1397
ガラス底皿 35 mm コーティングされていない 1.5	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C Case
iMIC	TLL Photonics		油浸対物レンズ (N 100X, NA1.49)、CO2 付き加熱チャンバー、カメラ単一光子検出 EMCCD (ElectronMultiplying Charge Coupled Device)と1.5倍レンズ
Poly-L-Lysine Solution 0.1%	Sigma	P8920-100ml	Dilution at 0.01% in water
RPMI 1640 ミディアム グルタマックス サプリメント	ライフテクノロジー	61870-010
RPMI 1640 ミディアム、フェノールレッドなし (10 x 500 ml)	ライフテクノロジー	11835-105	37°Cで温かく;使用前のCウォーターバス
羊の赤血球(SRBC)	Eurobio	DSGMTN00-0Q	Alsever緩衝液に4°Cで保存されています。C使用前