「ファゴソーム閉鎖アッセイ」全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて、三次元的にファゴソーム形成を可視化します

食作用は、その後、摂取された物質の内在化および分解につながる、認識で始まり、受容体表面への材料の結合の主要な細胞機能です。このような金型細胞性粘菌とアメーバのような単細胞真核生物は、細菌に供給するための食作用を使用していますが、高等生物はプロの細胞と進化してきました。マクロファージや樹状細胞は様々な組織や臓器中の病原体に対する防御の最前線であり、抗原提示およびサイトカイン産生^1-4を通じて適応免疫系を活性化することが重要です。特定の状況下では食作用は、非専門の食細胞、 例えば、内皮細胞および上皮細胞によって行うことができます。このプロセスは、開発中と正常組織のターンオーバーおよびリモデリングのための成人期に恒常性を維持することが重要です。精巣または網膜におけるこのようなセルトリ細胞として最後に、専門的な食細胞色素上皮細胞は、非常に強力な食⁵です。

微生物や細胞破片の劣化が食細胞の表面上の貪食受容体のクラスタリングで開始を発生ファゴソームの形成。このようなFc受容体（FcRで）又は補体受容体（CRS）などのオプソニン受容体のクラスタリングを次の下流のシグナル伝達事象は十分に特徴づけられています。しかし、Toll様受容体（TLR）を含む非オプソニン受容体、レクチン、マンノース受容体およびスカベンジャー受容体多数のもあります。これらの受容体は、マンノースまたはフコース残基、ホスファチジルセリン、およびリポ多糖^1,6-9などの粒子表面上の決定基を認識する。

病原体や細胞破片認識はに結合し、その後激しいと過渡アクチンの再構築につながる食細胞受容体のいくつかのタイプのクラスタリングを伴います。細胞内compartmenのパラレル、焦点エキソサイトーシスでtsが膜張力の解放に貢献し、大きな粒子の効率的な食作用のために重要です。アクチン重合および膜変形につながるシグナル伝達事象は、単一の貪食受容体をトリガーした実験モデルで解剖しました。 FcR媒介性の食作用の間に、低分子量GTPアーゼ（RAC、Cdc42の）によって調節される強いアクチン重合があります。その下流のエフェクターの中でも、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（WASP）は、アクチンフィラメント^1,2,4,10を核とアクチン関連タンパク質複合体2/3（ARP2 / 3）の活性化をもたらします。ホスファチジルイノシトール4、5-ビスリ ​​ン酸（PI（4,5）P _2）の現地生産は、仮足の形成を駆動する初期のアクチンの重合のために重要です。 PI（3,4,5）P ₃への変換は、仮足の拡張とファゴソームの閉鎖¹¹のために必要とされます。いくつかの経路は、PI（4,5）P ₂の消失に寄与する。ホスファチジルイノシトールリン酸キナの最初に脱落ファゴソームの逮捕のPI（4,5）P ₂合成からSES（PIPKIs）。第二に、それがリン酸化することができると私はキナーゼ（PI3K）をPI3Kクラスによって消費され、PI（3,4,5）P ₃ ¹²で変換されました。ホスファターゼ及びホスホリパーゼの役割はまた、哺乳動物細胞および細胞性粘菌 ^13,14における食作用の間にPI（4,5）P ₂の加水分解およびF-アクチンの除去に暗示されています。ホスホリパーゼC（PLC）δは、ジアシルグリセロールおよびイノシトール1,4,5- トリスホスフェートにPI（4,5）P _2を加水分解する。 PI（4,5）P ₂およびPI（3,4,5）P ₃ホスファターゼOCRL（ロウの眼脳腎症候群）もファゴソーム形成に関与しています。 F-アクチンとその解重合の正確な局所的形成は、しっかりと空間と時間に規制され、我々は細胞内区画の募集がローカルOCRLホスファターゼを提供することが重要であることが示されている、したがって、貪食カップの底部に局所のアクチン脱重合に寄与します

機構とファゴソームの閉鎖および膜の切断のために必要とされる分子の選手が不十分なため、ファゴソーム閉鎖のサイトを可視化と監視の難しさの定義されたままです。最近まで、食作用は難しいファゴソーム閉鎖のサイトのタイムリーな可視化を行う、彼らの背面にまたはその両側に粒子を内部固定または生きている細胞で観察されました。また、固定方法は、膜とバイアス仮足の拡張と閉鎖に結果の後退を引き起こす可能性があります。これとは対照的に、我々が設定し、ここで説明しているアッセイは、私たちは偽足拡張子と内部全反射顕微鏡^{（TIRFM）16}に基づいて、生細胞¹³内食作用の閉鎖ステップを、可視化することができます。この光学技術は、透明との間の界面に薄い領域でのフルオロフォアを励起するエバネッセント波を使用していますので、蓋（カバーガラス）と液体（細胞培養培地）。励起深さの厚さは、原形質膜に近い分子事象の可視化を可能にする、固体表面から約100 nmです。 TIRFMは、高い信号対バックグラウンド比を可能にし、細胞の照明に起因収集ピンボケ蛍光および細胞毒性を制限します。

TIRFMを利用して、我々は、カバースリップは、ポリ - リジンで活性化した後、IgGのオプソニン化赤血球抗体（IgG-SRBC）でで被覆された「ファゴソーム閉鎖アッセイ」を開発しました。関心の一過性の蛍光標識されたタンパク質を発現しているマクロファージは、その後のIgG-SRBCを巻き込むために許可されています。細胞は、非共有結合ガラス表面に結合している標的粒子を切り離しながら、偽足の先端部を観察し、TIRFモードで記録することができます。 TIRFの買収は、VISを可能にする、3ミクロン以上のステージをシフトした後に、落射蛍光モードでの買収と組み合わされます貪食カップのベースのualization。そのようなプロセスの間にアクチンまたはダイナミンを阻害するもののような薬理学的薬剤の添加は、分子レベルでのプロセスを分析することも可能です。

ここでは詳細に説明されたプロトコルは、RAW264.7マウスマクロファージ細胞株およびオプソニン化粒子についてであるが、実質的に、それは、他の食細胞およびビーズなどの他の標的と適合させることができます。この方法は、時間と様々な貪食過程で仮足の拡張とファゴソームの閉鎖に関与する分子の選手の空間に規制のより良い特徴付けを可能にします。

注：Lifeact-mCherryを使用したプラスミドは^、17の後に生成された博士ギョームMontagnac、キュリー研究所、パリ、一種の贈り物です。

1.細胞およびトランスフェクション

注：RAW264.7マクロファージをサブコンフルエント完全培地中（RPMI（ロズウェルパーク記念研究所）1640培地に増殖させ、10mMのHEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、50μMのβメルカプトエタノール、2mMのL-グルタミン及び10％FCS（ 100ミリメートルプレートにおけるウシ胎児血清））。これらは、エレクトロポレーションによって、蛍光標識されたタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされます。日常的に約5から6×10 ⁶個^の細胞をそれぞれトランスフェクションまたは同時トランスフェクション用プラスミド20μgのまたは10μgのトランスフェクトされます。エレクトロポレーションまたはリポフェクションに基づいて、トランスフェクションの他の手段は、代替的なアプローチとして使用できることに注意してください。

1. セルリフターで細胞をこすり落とし、数回ピペッティングにより培養液10mlに再懸濁します。
2. 遠心分離機細胞懸濁液を300×gで、スイング角度ローターで、室温で5分。
3. 完全培地の予熱10mlを37℃にてゲンタマイシン10μg/ mlのを補充しました。
4. 遠心分離後、上清を破棄し、エレクトロポレーションキットから「洗浄バッファーA」の3ミリリットル中にペレットを再懸濁。
5. 細胞懸濁液を300×gで、スイング角度ローターで室温で5分間遠心します。
6. その間に、室温でDNAミックスを準備します。QSP 240μlのH ₂ O 120μlの2×緩衝液B、目的のタンパク質のためのプラスミドDNAコーディングの20μgの、
7. 遠心分離後、全体上清を捨てます。
8. DNA混合物中の細胞ペレットを再懸濁し、4ミリメートルのエレクトロポレーションキュベットに移します。
9. 3分間室温でインキュベートします。
10. 250 V、900μFで電気穿孔。
11. すぐにゲンタマイシンを補充した予熱した（37℃）完全培地中で細胞を再懸濁し、プレート100ミリメートル皿でメートル。
12. 37℃、5％CO ₂で一晩トランスフェクトされた細胞を培養します。
13. 翌朝は、無血清顕微鏡培地10ml（フェノールレッドなしのRPMI 1640、10 mMのHEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、50μMののβメルカプトエタノール、2mMのL-グルタミン）で完全培地を交換してください。

赤血球の2オプソニン

注：マクロファージ粒子対象のモデルとして、ヒツジ赤血球（SRBC）を使用します。通常、35ミリメートルガラスボトムディッシュあたり約7×10 ⁶ SRBCをが使用されます。

1. 1×PBS（リン酸緩衝生理食塩水）/0.1% BSA（ウシ血清アルブミン）及び遠心（600×gで、4分）の100μlでSRBCを洗浄します。
2. 遠心分離後、上清を廃棄し、1×PBS / 0.1％BSAおよび遠心分離（600×gで、4分）の100μlのSRBCを再懸濁します。
3. 遠心分離後、上清を破棄し、ウサギのIgG抗SRBCを用いて1×PBSで/ 0.1％BSAをSRBCを再懸濁サブ凝集濃度で。 SRBCをの抗体/ 5μLを含む溶液500μlを使用してください。
   注：抗体のサブ凝集濃度は、ネットワークの形成として検出凝集を誘発しなかった最低の濃度に相当します。一般に、サブ凝集濃度は、8.2μgの/ mlです。
   1. 赤血球凝集試験によってSRBCををオプソニン化するために必要なのIgG抗SRBCをの濃度を決定します。マイクロプレート内の1 / 25,600 - シリアル1/50の間（13.1 mg / mlでの在庫）のIgG抗SRBCを希釈します。各ウェルに2×10 ⁶ SRBCをを追加します。いくつかの時間室温で暗所でプレートをインキュベートします。
4. 低速回転で30分間、室温でインキュベートします。
5. 1×PBSで2回洗浄/上記のように0.1％BSA後、予め温めた無血清顕微鏡培地中のIgGオプソニン化SRBCを抗体（IgG-SRBC）で（2ミリリットル/皿）に再懸濁します。

カバーガラスの3ポリリシンコーティング

1. その間室温で30分間、0.01％ポリ-L-リジンの2mlで35mmのガラスボトムディッシュを治療します。
2. 1×PBSの2ミリリットルで皿を2回洗浄します。

4.グラスボトムディッシュにSRBCをの非共有結合固定

1. 35ミリメートルのガラスボトムディッシュあたりSRBCを懸濁液の2ミリリットルを注ぎます。
2. 35ミリメートルのガラスボトムディッシュ上に2分間で500×gでスイングローターで遠心分離します。
3. 上清を除去し、1×PBS / 10％のBSAの2mlで1回洗浄。
4. ディッシュあたり1×PBS / 10％BSAの2mlで30分間粒子をインキュベートします。
5. 1×PBSの2ミリリットルで皿を3回洗浄します。
6. 予め温めた（37℃）で、無血清顕微鏡培地2mlの1×PBS置き換えます。

5.貪食TIRFMによって可視化

1. 顕微鏡
   注：TIRFMは、油浸対物レンズ（N 100X、NA1.49）、CO ₂と加熱室を備えた顕微鏡を用いて行い、両者が歌います1.5Xレンズと相まってル光子検出カメラEMCCD（電子増倍電荷結合素子）。
   1. TIRF顕微鏡セッションの前日には、顕微鏡ステージの均一な加熱を可能にするために、37ºCで加熱室をオンにします。
2. 臨界角の決意
   注：ImageJのカラープロファイラーソフトウェアがTIRF画像ストリームを処理するために使用されます。
   1. 顕微鏡下で無血清顕微鏡培地でオプソニン化SRBCを含む35ミリメートルのガラスボトムディッシュを置きます。
   2. 細胞をこすり落とし、それらを追加する前に、培地中に再懸濁 - 皿に（100〜500μl）を。
   3. 顕微鏡を制御し、491 nmおよび/または蛍光タグ化タンパク質を発現する細胞を同定するために561 nmレーザーで励起を行うために、「ライブ取得」ソフトウェアを使用してください。
   4. 蛍光標識されたタンパク質を発現する細胞を識別します。
   5. フィールドの真ん中にそれを置き、500イムを取得異なる角度を持つ1つの励起波長での年齢は、0.01º（ 図2A）の増加と、5°までの0°から始まります。角度が自動的に顕微鏡システムによって変更されます。
   6. 入射光が完全にガラス/媒体界面で反射されることを可能にする臨界角を決定し、エバネッセント波を発生させます。 ImageJのカラープロファイラーソフトウェアを使用して、「ファイル」をクリックして「開く」画像シーケンスを開き、ファイルを選択します。
   7. 均一な蛍光（ 図2B黄色1）と細胞内で、長方形ツールを使用して、関心領域（ROI）を選択します。
   8. ドロップダウンメニューと「プロットZ軸プロファイル」の「スタック」、「画像」タブをクリックすることにより、x軸の角度の関数とROIで測定された平均蛍光強度」、Z軸のプロファイルを「プロット（ 図2B赤2）。
      注：臨界角はミリアンペアにつながる角度であります蛍光の急激な減少の前にximum蛍光。
   9. 例2.00（ 図2C）としてTIRF信号を得るために、顕微鏡のセッション中に臨界角よりも優れた、x軸上の角度のいずれかの値を使用してください。
3. 買収
   1. ライブ取得ソフトウェアを使用して、「プロトコル・エディター」（ 図3A）モジュールと買収のパラメータを設定します。
      1. TIRF地域への関心のタンパク質からの蛍光信号を取得する「マルチチャンネル」の取得を含む「ループ」でプロトコルを作成します。 （例えば、2.00用）TIRF角、露光時間（例えば50ミリ秒）とレーザー強度（例えば50％）（図3B 1）を入力します。
      2. 「マルチチャンネル」ツールを使用して落射蛍光における信号取得を取得するためにTIRF地域上記の目的3μmの「Z移動」を導入。トン以下の角度を入力してください彼臨界角（例えば1.00など）、博覧会の時間（50ミリ秒）及びレーザー強度（50％）（ 図3B、図2及び図3）。
      3. 次TIRF地域（ 図 3B 4）に戻るには、3ミクロン以下の目的の「Z移動」を追加します。 （発光ダイオード）（ 図3B 5）LED明るい光の中で、細胞の「スナップショット」を追加します。
   2. 粒子の周囲に、原形質膜を拡張することによってSRBCの食作用を開始する蛍光タグ付きタンパク質発現の適度なレベルで目的の細胞を見つけます。
   3. フィールドの中央に配置します。
   4. 千フレーム - 500の取得をストリーミングを開始。 「ル ​​ープ回数」タブで、「750フレーム」（ 図 3B 1）を入力します。
      注：ImageJのカラープロファイラーソフトウェアがTIRF画像ストリームを処理するために使用されます。
   5. クリックして画像Jソフトウェアのシーケンスの画像を開きます。、「開く」「ファイル」とファイルを選択します。
   6. 「Hyperstacksは「機能」をhyperstackするスタック」ドロップダウンメニュー上に、タブの「イメージ」をクリックすることで、チャネルを分離。注文：登場ウィンドウ完了xyctzを。チャネル（C）：チャンネル数（例： "2"次の2つの蛍光色素を持っている場合）。スライス（z）は、Z軸方向におけるスライスの数（例：「1」z軸での動きがない場合）。フレーム（トン）：チャンネル数毎に分割された画像の数;表示モード：グレースケール。
      注：2つの別個の画像シーケンスが生成され、二つの異なるチャネルに対応します。

本稿に記載された実験システムを図1に概略的に示されている。蛍光タグに融合した目的のタンパク質を発現するトランスフェクトRAW264.7マクロファージは、非共有結合的に固定したIgGオプソニン化ヒツジ赤血球（SRBC）と接触するように配置されていますカバースリップ上。マクロファージはそれを巻き込むためにカバースリップからSRBCを切り離すことができます。使用TIRF顕微鏡はTIRF領域からの信号の同時取得が3μm以上のZシフト後落射蛍光モードで偽足との信号の先端に対応することができます。

図2で説明したように、原形質膜100nm以下の領域からクリーンなTIRF信号を確実に全反射蛍光の臨界角を決定することが必須である。 図3は acquisitiの発展を表します「プロトコル・エディタ」と呼ばれるモジュールを介してパラメータにライブ集録ソフトウェアに含まれています。このモジュールは、それらが処理を実行する顕微鏡に送信される前に、ユーザーがワークフローを作成し、管理することができます。取得の終わりには、ユーザは、TIFFストリームを収集します。

図4に示すように、プラスミド（ 例えば 、後に生成さLifeact-mCherryを、博士ギョームMontagnacの寄贈、キュリー研究所、パリでトランスフェクトRAW264.7マクロファージにおける「ファゴソーム閉鎖アッセイ」の代表的な生細胞TIRFM映画17）アクチン重合に従います。マクロファージは、一過性に発現するプラスミドは、カバーガラスに結合したIgG-SRBCを巻き込むさせました。偽足の先端が1 SRBCの周りにカバーガラスに並置されたように、F-アクチンリングがTIRFエリアで、それが閉じられるまで次第に狭く（上部パネル）を検出しました。並行して、ぼやけたFアクチン3ミクロン（下のパネル）の上にステージをシフトした後に、落射蛍光によって検出された信号は、貪食カップの基部に解重合に対応していました。透過光（右側のパネル）で確認されたように、取得の3分後に、SRBCは完全に、内在化しました。

したがって、この方法は、適切に偽足及び貪食カップの基部に発生する分子事象の極めて末端で起こる分子事象を区別するために使用することができます。

図TIRFMによって分析」ファゴソーム閉鎖アッセイ」の1略図 。ファゴソーム閉鎖アッセイは、一過性一つまたは二つの蛍光タグ化タンパク質を発現するマクロファージを用いて行われます。マクロファージは、非共有結合ポリリシンCOA上に固定されたIgGオプソニン化SRBCを上に堆積されますテッドはカバースリップ。画像は貪食カップのベースを検出するために、ファゴソーム閉鎖のとエピ蛍光モードでサイトを検出するために、TIRFモードで記録されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：TIRFM の臨界角の決意。 （A）「ライブ取得」を使用して、蛍光標識タンパク質を発現する細胞は、（赤領域1）フィールドの中央に配置されています。 TIRFスタックオプションを使用すると、画像が異なる角度は0.01°（赤領域2）の増分で、5℃まで0°から始まる、1つの励起波長で取得した。（B）一連の画像は、ImageJのを使用して開かれていますカラープロファイラーソフトウェアとARの平均蛍光強度関心のegion（ROI）は「スタック」と「気絶する軸プロファイル」（赤領域1）を使用して、x軸の角度の関数でプロットされている。（C）は、プロット上の蛍光のピークのx位置に対応します臨界角：1.98°（黒色の点線）。この角度の後に任意の値を使用することができます。例としては、2.00°（赤線）を選択することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ライブ取得モジュールを用いて、 図3. ワークフロープロセス：「プロトコル・エディタ」。 （A）「プロトコル・エディター」ウィンドウで、ワークフローキャンバスが作成される。（B）このプロトコルは、顕微鏡を決めた回数を繰り返すことはアクションの「ループ」を含みますユーザーによる。例として：750（1）。一つのループが含まれる：TIRFモードでの関心の蛍光タンパク質のレーザー励起と「マルチチャンネル」買収。例として：レーザー491 nmの強度50％-TIRF角度2.00（2）;対物レンズ3ミクロン（3）の「Z移動」。落射蛍光モードで「マルチチャンネル」買収（4）;バックTIRF地域（5）と透過光（6）中の「スナップショット」を目的の「Z移動」。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4. F-アクチンは、一過性プラスミドLifeact-mCherryを（博士ギョームのMoの親切な贈り物を表現RAW264.7マクロファージを用いて行ったファゴソーム閉鎖。ファゴソーム閉鎖アッセイのサイトでのポイントとして蓄積され、17後に生成さntagnac、キュリー研究所、パリ、）。プラスミド信号はTIRFエリア（上）にし、落射蛍光モード（下）で取得しました。赤い矢印は、TIRF地域におけるアクチン蓄積を示しています。 3分の透過光像は、内在化SRBCを示し、提示されています。スケールバーは10μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ムービー1：それは一過性発現プラスミドRAW264.7マクロファージを用いて行った貪食カップファゴソーム閉鎖アッセイのベースから除去されている間、F-アクチンは、偽足の先端およびファゴソーム閉鎖部位に蓄積されます 。 TIRFMを用いてプラスミドTIRFエリア（上）での撮像と落射蛍光モードで（下）は、代替を実施しました37℃で3分間の光年ごとに50ミリ秒。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。