方法論記事

白血球に富んだ血液サンプル中のハロゲンペルオキシダーゼ活性の迅速かつ具体的な評価

DOI：

10.3791/54484

⸱

2016年7月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、細胞内のハロゲン化ペルオキシダーゼ活性を特異的に決定するために、少量の血液サンプルから白血球を迅速に濃縮する方法を説明しています。この方法は、ヒトおよび非ヒトの材料に適用でき、新しい炎症マーカーの評価に寄与する可能性があります。

要約

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本稿では小さい全血サンプルから白血球の迅速かつ標準化された濃縮のためのプロトコルが記載されています。この手順は、赤血球の低張溶解に基づいており、人間のサンプルに、ならびに非ヒト由来の血液に適用することができます。約50〜100マイクロリットルの小さな初期サンプル量が実験小動物から再発採血にこの方法が適用可能になります。また、白血球の濃縮は、複数の実験室の環境では、この方法を適用すること、数分以内に、化学品及び計装に関する低い材料の努力によって達成されます。

白血球の標準化精製は、すなわち 、ヘムペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）および好酸球ペルオキシダーゼ（EPO）のハロゲン化ペルオキシダーゼ活性を評価するために高度に選択的な染色法と組み合わせた次亜塩素及び次亜臭素酸（HOClのとHOBr）の形成されています。 MPOが強くNEUTで発現されているがrophils、ヒト血液中だけでなく、単球における最も豊富な免疫細胞型は、関連する酵素EPOはもっぱら好酸球で発現されます。これらの酵素のハロゲン化活性をほとんどHOCl-及びHOBr特異的色素アミノフルオレセイン（APF）および一次ペルオキシダーゼ基質過酸化水素を使用することによって対処されます。その後のフローサイトメトリー分析にすべてのペルオキシダーゼ陽性細胞（好中球、単球、好酸球）を区別し、それらのハロゲン化ペルオキシダーゼ活性を定量化することができます。 APF染色は、細胞表面マーカーの適用と組み合わせることができるので、このプロトコルは、具体的には、白血球のサブ画分に対処するために拡張することができます。方法は、ヒトおよびげっ歯類の白血球の両方のHOClとHOBr産生を検出するために適用可能です。

慢性炎症性疾患におけるこれらの酵素の製品の普及と多様に議論免疫学的役割を考えると、このプロトコルは、より良い理解に貢献するかもしれません白血球由来のヘムペルオキシダーゼの免疫学的関連性。

概要

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多形核白血球（PMNを、とも呼ばれる顆粒球）および単球は、血液1,2における自然免疫系の重要な細胞成分を表します。彼らは、病原体に対する一次防御にだけでなく、獲得免疫系の活性化および全身性炎症反応2-4の開始に貢献しています。しかし、特に好中球、顆粒球の最も豊富な種類、および単球も大幅に急性炎症事象5の調節および終了に貢献しています。従って、これらの細胞はまた、リウマチ性関節炎6,7のような慢性炎症性疾患において重要な役割を果たし得ます。実際、喘息、慢性炎症性気道疾患において、好酸球のアポトーシス障害、血液8で2番目に顆粒型によって特徴付けられます。しかし、顆粒球のアポトーシスおよびマクロファージによるそれらの迅速な除去は、携帯終了時に2つの重要なステップであります炎症9-11の。

名前の免疫細胞密接に関連する2つの酵素、すなわち、ミエロペルオキシダーゼ（MPO、好中球および単球）と好酸球ペルオキシダーゼ（EPO、好酸球）で12,13を見つけることができます。彼らは二電子的殺菌特性14-16のために知られている対応するハイポ（擬似）halous酸に（擬似）ハロゲン化物を酸化ように、これらのヘムペルオキシダーゼは、古典的体液性免疫応答に関連しています。生理的条件下でMPO主にフォーム次亜塩素酸（HOClの）とhypothiocyanite（ - OSCN）、後者と次亜臭素酸（HOBr）は、EPO 17-19によって形成されています。新しい結果は、この（擬似）ハロゲン化酵素活性はまた、炎症反応の調節にし、免疫反応20,21の終端に寄与し得ることを示唆しています。実際には、MPOおよび派生副産物のHOCl産生は、T細胞ベースの適応免疫応答22-2を抑制することが示されました4。

慢性炎症性疾患で、自然免疫系からの白血球の免疫学的役割に多くの洞察を得るためにこの生理機能にMPOおよびEPOの寄与を決定するために、我々はすぐに後続の特定のために少量の血液サンプルから白血球を豊かにする方法を開発しましたこれらの細胞におけるハロゲン化ペルオキシダーゼ活性の決意。赤血球の枯渇のために我々は低材料コストで迅速な白血球濃縮につながる蒸留水と2-その後の低張溶解工程を含む標準化された方法を選択しました。その後のハロゲン化MPOの決意とEPO活性についてHOCl-とHOBr特有の色素アミノフルオレセイン（APF）が25から27を使用しました。非特異的ペルオキシダーゼ染色法28,29のアプリケーションとは対照的に、このアプローチは、多くの場合、重度のINFLで損なわれるハロゲン化ペルオキシダーゼ活性の選択的検出を可能にしますammation 30,31。

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プロトコル

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すべての人間の血液サンプルを、健康なボランティアから得た、と適用白血球濃縮プロトコルはライプチヒ大学の医学部の倫理委員会のガイドラインに従います。ラットの血液を用いた実験では、動物の管理と使用に関するドイツのガイドラインに従って、責任ある地域の倫理委員会（Landesdirektionザクセン、Referat 24）によって承認されました。

1.実験のセットアップ

注：血液サンプルから赤血球の枯渇のための低張溶解手順は、タイムクリティカルな手順があるので、事前にプロトコルのこの部分のために必要なすべての機器（ 例えば、バッファ）を準備します。

  1. 低張溶解のための1つの15ミリリットルの遠心管及び血液サンプル当たり、その後のアミノフルオレセイン（APF）染色のための1つの1.5ミリリットルのサンプルチューブにラベルを付けます。
    1. 白血球の濃縮は、無菌条件下で実施される場合、流下でこの標識化を行いますボックス。
  2. サンプルあたり約12 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS、10 mm）を準備します。白血球は、無菌条件下で単離されたかしなければならないかどうかに応じて、供給業者から滅菌準備溶液を使用して、または蒸留水にPBS錠剤を溶解することによってのいずれかPBSを準備します。 pH値をチェックし、必要に応じて、0.1 MのHClおよびNaOH溶液の少量を使用してpH7.4に調整します。
    1. 約16個のサンプルのために十分な非滅菌緩衝溶液を得るために蒸留水200mlに（材料の表を参照）をPBS錠剤を溶解します。必要であれば、滅菌濾過することにより、このソリューションを滅菌します。
  3. カルシウムを補充し、約1ミリリットルハンクス平衡塩溶液（HBSS）2+サンプルあたりを準備します。
    1. 100ミリリットルでHBSS塩（最終容量）二回蒸留水の970 mgを溶解します。最終容量まで充填する前に、pH値をチェックして、pHを7.4に調整。その低緩衝能力のために、毎日新鮮にこのバッファを準備します0.1 MのHClおよびNaOH溶液の少量を使用して、特別なケアでpH調整を行うdは。
      注：滅菌溶液は、実験に応じて、使用することができます。溶液を滅菌濾過することによって滅菌することができます。
  4. 二つのバッファ、ラベルに加えて、チューブを準備する（ 例えば、50ミリリットルの遠心分離管）またはフラスコ（ 例えば、計量カップ250ミリリットル）を予め低張溶解手順のための二重蒸留水で。サンプルあたり約10ミリリットルの水を準備します。
  5. 氷の上で行われるAPF染色（セクション3）、のために砕いた氷の入った容器を準備します。
  6. 染色（ステップ3.2）の間に使用される作業ソリューションの迅速な調製を可能にし、繰り返し凍結およびAPFソリューションの融解を避けるために事前にAPFのアリコートを準備します。
    注：APFは、一般的に5mg / mlのメチルアセテート（11.81ミリモル）のストック溶液として得られます。
    1. 0.5ミリリットルチューブに10-100μlのアリコートを凍結します。 APFは、最終的な染色について10μMの色素濃度は（ステップ3.8）に使用されます。

赤血球の2.低張性溶解

注：汚染を避けるために層流ベンチ下（遠心分離工程を除く）低張溶解手順を実行します。室温で全体の手順を実行します。低張溶解は、時間重要なプロセスであるので、事前に水（2mL）およびPBS（5ml）で添加するためのピペットを調整し、手順を開始する前に、水及びPBSフラスコを開きます。使用前に室温でPBS溶液と蒸留水を保管してください。

  1. 各血液サンプル移送から適切な15ミリリットルの遠心チューブに100μlの。
    注：我々の実験では、血液サンプルは、通常、凝固を回避するために、ヘパリン10U / mlで含みます。まだによるサンプル材料の異なるソースに抗凝固剤の性質と濃度が異なる場合があります。 APF染色への影響は比較例によりテストする必要があります他のタイプ又は抗凝固剤の濃度を補充した血液サンプルから得られた結果に結果をる。
  2. 2ミリリットルを蒸留水を追加し、中レベルに設定し、ボルテックスミキサーを使用して、サンプルを混ぜます。その後、サンプル毎に5ミリリットルのPBSを加え、ボルテックスミキサーを用いて混合し、60秒間のサンプルをインキュベートします。
    注：約5サンプルまでを並行して製造することができます。サンプル順序匹敵するインキュベーション時間を達成するために、水とPBSの添加と同じにしてください。
  3. PBSの添加（ステップ2.2）を室温で6分間450×gでの遠心分離により、すべてのサンプルの残りの無傷の細胞をペレット化することによって等張条件の再生後。
  4. テーブルのごみ箱にそれを注ぐことにより、上清を取り除きます。遠心チューブを反転し、ペーパータオルの上に開口部をタップすることで、できるだけ多くの液体できるだけを削除してください。細胞ペレットは、できるだけ乾燥していることを確認してください。
  5. （ステップ2.2）の前に説明したように低張溶解手順を繰り返します。
    NOTEは：原理的にこの低張溶解手順は、得られる混合白血球画分の純度に応じて、複数回繰り返すことができる（2.5へ2.3ステップ）。 2溶解は、得られた混合細胞画分に残っている赤血球のシェアをステップした後、約25％です。
  6. 室温と450×gで6分間遠心分離することにより、残りの無傷の細胞をペレット化。上清を除去し（ステップ2.4​​を参照してください）​​。ペレットに500μlのHBSSを加え、穏やかに均質な溶液が得られるまでそれを溶かします。それに応じてラベルされた1.5ミリリットルのサンプルチューブに各サンプルを転送します。
  7. 実験に応じて、直接、（フローサイトメトリーを介して、 例えば、）得られた試料25、32（単一の細胞型の同定のための）蛍光標識抗体で染色を分析（細胞の活性化実験のために）細胞刺激と33をインキュベートまたは氷との使用に格納されています後で。研究の目的に応じて、すぐにその後の実験を行います顆粒球は、約20時間のかなり短い半減期を有するため、混合白血球画分。
    注：これは、後述ペルオキシダーゼ活性染色のために保持しています。

3.ハロゲンペルオキシダーゼ活性染色

注：血液由来のヘムペルオキシダーゼMPOおよびEPOによってHOCl-及びHOBr生産名前付き次亜ハロゲン酸によりフルオレセインに酸化されたAPFを用いて定量化されます。蛍光標識抗体を用いた細胞標識は、APFの染色と組み合わせて行われる場合したがって、フルオレセインの発光信号を妨害するフルオロフォアを避けます。

  1. 氷の上で4℃でAPF染色を実行します。
  2. APFの作業溶液を調製するために、色素（ 例えば、10μlの、11.81ミリモル）の適切なアリコートを解凍し、正確に1 mMの（ 例えば、10μlに108.1μlのバッファを追加）するHBSSでそれを希釈します。
    1. 各サンプル（500μlの細胞溶液）の場合は5μを準備説明APFワーキング溶液のリットル。したがって、118.1μlのAPF作業溶液（1 mm）は、約20個のサンプルを準備するために生じるAPF（11.81ミリモル）、のいずれかの10μlのアリコートを使用します。計算されたよりも約10％以上APFワーキング溶液を調製ピペッティング時の損失による。
  3. APF染色のペルオキシダーゼ特異性を確認するために、ヘムペルオキシダーゼ阻害剤、4-アミノ安息香酸ヒドラジド（4- ABAH）35と対照試料を調製します。
    1. 500μlの溶媒に75.6 mgの4 - ABAHを希釈することにより、ジメチルスルホキシド（DMSO）中の4- ABAH（151.17グラム/モル）の1 Mストック溶液を準備します。また、HBSSで4-ABAH 1/10に希釈します。
  4. H 2 O 2使用液ラベルの製造をそれぞれ「70 mMのH 2 O 2」、「7 mMのH 2 O 2」を有する2つの1.5 mlの遠心チューブ用。
    1. 「70mMのH 2 O 2」と表示されたチューブでは、たて10μLを希釈します約88 mMの濃度を得るために、蒸留水990μLを用いてH 2 O 2の30％ストック溶液（8.8ミリモル）の。氷上で保存し、4時間以内に使用します。
      注：H 2 O 2は、典型的には、供給者によって、30％ストック溶液として提供されます。 4℃で保存した場合、約3年間安定です。分解を避けるために、蒸留水にH 2 O 2の希釈を行います。 H 2 O 2の希釈液はまた、0.1M NaOH溶液中で調製することができます。
    2. 正確なHの決意2 O 2濃度は、標識された1.5mlチューブに蒸留水900μlにこの溶液の100μLを添加することにより、第1のH 2 O 2のストック溶液（約88ミリモル）から、更に1〜10の希釈液を調製します「7 mMのH 2 O 2 "。
    3. （UV-Visのphotospectrometerを使用して、近紫外域（ 例えば、200から300ナノメートル）でスペクトルを記録し、240 nmの吸光度を使用します49; 240 = 34 M -1 cm -1で）は、第2のH 2 O 2のストック溶液34内の実際のH 2 O 2濃度を決定します。参照キュベットは、蒸留水のみが含まれていることを確認してください。測定用石英キュベットのためのUV範囲におけるスペクトルが記録されます。
    4. この結果から、両方のH 2 O 2のストック溶液の正確な濃度を算出します。蒸留水を適量添加することによって、「70mMのH 2 O 2」サンプルチューブに正確に70 mMの第一のストック溶液の濃度を調整します。氷の上で得られたワーキング溶液を保存し、1時間以内に使用します。
  5. 1mMの最終濃度に適したサンプルに4-ABAH作業溶液（100 mM）の5μlのを追加します。 APFの添加前のインキュベーター中で37℃で15分間、サンプルをインキュベートします。
  6. それぞれに5μlのAPF作業溶液（1 mm）を追加します。500μlのサンプルを、10μMの最終色素濃度を得ました。サンプルを穏やかに（ 例えば、メディア設定にボルテックスミキサーを使用して）混合し、37℃で30分間インキュベートします。
  7. 700μMの最終濃度のために、各500μlのサンプルに5μlのH 2 O 2作業溶液（70mMの）を追加します。穏やかにサンプルを混合し、37℃で60分間それをインキュベートします。並行して、適切な制御測定を行います。
    注：コントロールの測定は、700μMH 2 O 2は、細胞に対して毒性ではないことを示しました。有意な細胞応答が観察されました。
    注：APF染色はまた、科学的疑問に応じて、H 2 O 2の添加を省略することにより行うことができます。 H 2 O 2の添加は、細胞による最大のHOClとHOBr生産の検出を可能にしながら、過酸化水素の非存在下でのみ、基底塩素化MPOおよびEPOの活性を測定します。 T彼は、後者は、有意に高い蛍光シグナルを意味します。
  8. 細胞をペレット化するために、室温と400×gで10分間サンプルを遠心します。徹底的にペレットを破壊することなく上清を除去し、細胞を再懸濁するために250μlのHBSSを追加します。
    注：サンプルは今25フローサイトメトリーを介して、分析のための準備が整いました。
  9. 漂白を避けるために、分析まで暗所でサンプルを保管してください。 480から490 nmで励起した後、約525ナノメートル37でフルオレセインの発光を検出します。

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結果

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以前に報告されたように、上述の方法は、ヒトおよび非ヒト材料32の両方に適用可能であることが判明しました。喘息の症状を有するマウスについて示さまたようAPF染色は、全身炎症促進性状態の違いを検出するのに適したツールであってもよいです。したがって、その後の研究で、我々はプリスタン誘導関節炎（PIA）でメスのダークアグーチラットで繰り返しMPO（及びEPO）のハロゲン化活性を評価するために、このプロトコルを使用していました。この実験の間に実行白血球濃縮および染色の代表例を図1に示されている。約200μlの全血を、麻酔し、ヘパリン化の下で動物の眼球後静脈叢から得ました。赤血球枯渇およびその後のAPF染色は100μlの試料体積を用いて行きました。その後、サンプルをフローサイトメトリーによって分析しました。

セルの粒度（ 図1A）に対...

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ディスカッション

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好中球は、ヒト血液中で最も豊富な白血球であるとしてペルオキシダーゼ陽性細胞の単離は、多くの場合にのみ、これらの細胞に着目し、密度勾配遠心分離38によって他の白血球からの好中球の分離を含みます。好中球は、マウスの血液サンプルではるかに少ない豊富で、まだ後者より複雑な方法のための39の 40を使用しなければなりません。また、両方の方法はまた、より大きな血液容量のニーズに、試料からのペルオキシダーゼ陽性単球の除去につながると（ 例えば、400μlの41）、小実験動物から再発採血中に得られたマイクロサンプルには適用されません38,40。腹膜滲出液からのマウスの好中球の精製もまた、血液由来の顆粒球38,40が得られない、動物の犠牲を必要と。最近ネズミBLから高度に精製された顆粒球画分を得るための方法を開発OOD（ 例えば 、抗体のアプリケーション）40,42,43を消費し、多くの場合、高価な複雑で時間があり、再び一つだけのペルオキシダーゼ陽性白血球の型の精製に...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この作業は、ドイツ連邦教育研究省（BMBF 1315883）））からの資金提供と、欧州地域開発基金（ERDF）の資金提供から100116526 Sächsische Aufbaubank））プロジェクトによって可能になりました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
材料/機器
15 ml遠心分離チューブVWR/Corning734-0451-1.5
ml サンプルチューブVWR/Eppendorf211-2130DE-Pipettes
最大5 mlの容量に対応Eppendorfe.g., 3120000070私たちは、1-10 µの範囲で調整可能な容量を持つEppendorf Resarch plusピペットを使用しています。L、10-100 µL、100-1,000 & マイクロ;l 500-5,000 & マイクロ;l
層流ベンチThermo Electron CorperationHeraSafe-Vortex
mixerBender &Hobein AGVortex Genie 2-
卓上遠心分離機Kendro Laboratory ProductsLaborfuge 400R遠心分離機は450 x gで使用できる必要があります
小型遠心分離機Eppendorf5415D遠心分離機は400 x gで使用できる必要があります
インキュベーターHeraeuscytoperm 2設定:37 °C、95%の湿気、5% CO2内容
紫外線視覚分光光度計VarianCary 50のbio200と300nm間のスペクトルが記録されなければならない。したがって、石英キュベットを適用する必要があります
フローサイトメーターベクトン、ディキンソンBD Facs Caliburフルオレセイン(例えば、488nmアルゴンレーザー)の励起に適したレーザーを装備したフローサイトメーターを使用することができます
名前Companyカタログ番号コメント
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS)amrescoK812滅菌溶液、すぐに使用できる
Rho⇐緩衝生理食塩水 (PBS)Sigma-AldrichP4417錠剤 200 ml ミリポア水
Hanks 平衡塩溶液 (HBSS) と Ca2+Sigma-AldrichH1387970 mg / 100 ml、慎重にチェックし、pH値を7.4
酸メルクミリポア1.09057.10001 M溶液
酸化ナトリウムRiedel-deHaëに調整します。n30620固体ペレット。1 M 溶液の場合、4 g/100 ml ミリポア水
Aminophenyl fluoresceinCayman101575 mg/ml 溶液 (11.81 mM) を酢酸メチル、アリコート (例 100 µl)は-20°Cで準備して保管する必要があります。C
過酸化水素Sigma-AldrichH1009この30%原液は、約8.8 Mの濃度に相当します。それ以上の希釈は、使用の直前に蒸留水で新たに調製し、吸光度測定によって定量化する必要があります
4-アミノ安息香酸ヒドラジド(4-ABAH)シグマ-アルドリッチA419091 Mの最初のストック溶液は、DMSOで100 mMの2番目のものをHBSS
DMSOVWR化学薬品23500.26-
塩水で1:10希釈することにより、DMSOで調製する必要があります。

参考文献

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