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方法論記事

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

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DOI:

10.3791/54486

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2016年9月5日

 ,  ,  ,  , 
1Virus-Cell Interactions Laboratory, Lady Davis Institute for Medical Research, 2Department of Microbiology & Immunology, McGill University, 3Department of Medicine, McGill University

この記事について

サマリー

HIV-1複製サイクルの統合後のステップを標的とするRNA分子の有効性と毒性を評価する方法が説明されています。これらの方法は、新しい分子をスクリーニングし、既存の分子のフォーマットを最適化するのに役立ちます。

要約

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概要

現在のHIV-1治療の限界は、それらが慢性疾患の進行を予防するために投与しなければならないことです。 HIV-1抵抗性Tリンパ球または造血幹細胞の移植、薬物療法1,2の非存在下でHIV-1複製の長期制御を提供する可能性があり、また、HIV-1の硬化を達成するのに有効なアプローチであり得ます3。 HIV-1複製に耐性細胞をレンダリングするための一つの方法は、自己移植4中に感染した個体の細胞内への抗HIV-1のRNAまたはペプチドをコードする1つ以上の遺伝子を挿入することです。いくつかの候補の抗HIV-1遺伝子は、任意の単一遺伝子をHIV-1抵抗性の発達を防止するために、2つの5または三6の組み合わせでいくつかの入力の臨床試験を用いて設計されています。

抗HIV-1 RNAは、免疫応答を誘発するそれらの低電位による組み合わせ遺伝子治療のために、彼らため上位候補の一つであります非常に短い遺伝子配列から転写されます。いくつかの抗HIV-1 RNAは、ウイルスの侵入及び統合を標的とするように設計されています。しかし、ほとんどの抗HIV-1 RNAは、ウイルスのライフサイクルの後の積分ステップ（ 図1）を標的とします。統合後の阻害剤は、このようなリボザイム7、shRNAは8とU1i RNAを9として、HIV-1調節タンパク質Tatのまたは改訂1、およびアンチセンスベースのRNAを標的とするHIV-1 RNAに異なる部位を標的、デコイRNAを含みます。抗HIV-1 RNAの有効性を比較するために使用されている方法は、10の候補のRNAをコードする遺伝子で形質導入した細胞におけるウイルス複製を監視し、一過候補RNAを発現するプラスミドでトランスフェクトした細胞におけるウイルス産生を測定し、HIV-1発現プラスミドを含みます-13。我々は以前に新しいリボザイム標的部位13-15ためのHIV-1 RNAをスクリーニングするために、HIV-1産生アッセイを使用しています。これらの方法は、以降、RNAのフォーマットを最適化するために洗練されています干渉分子は、shRNAのようプラスミドDNAから発現または合成siRNA 16として配信します。このアッセイは、ヒト胚性腎臓（HEK）293T細胞から成熟したウイルスの産生を測定し、HIV-1複製サイクルの後の積分ステップ（ 図1）を標的とする阻害剤の効果を比較するために使用することができます。統合前のステップを標的とする阻害剤は、このようなTZM-BL細胞感染性アッセイ17などの代替アッセイは、抗ウイルス効果を評価するために必要とされます。

診療所での抗HIV-1 RNAの送達のための主要な安全上の懸念は、人間のRNAまたはタンパク質、および先天性免疫センサーの活性化に対する潜在的なオフターゲット効果が含まれます。抗HIV-1 siRNAの毒性を評価するために、我々は、異なる細胞株16における細胞生存率アッセイを使用しています。我々はまた、二本鎖RNA、免疫センサーの活性化を測定し、RNA活性化プロテインキナーゼR（PKR）及び受容体3（TLR3）Toll様、並びにEXインターフェロンのPRESSIONは、遺伝子、ADAR1のP150を刺激しました。これらのアッセイは、抗HIV-1 RNAの有効性は、細胞の生存または免疫センサーの活性化の間接的な影響によるものではないことを確認するために使用することができます。彼らはまた、さらなる開発の潜在的な毒性を有する候補RNAを除くのに有用です。

次のプロトコルでは、新しい治療のRNAを識別し、既存のフォーマットを最適化するための手順が記載されています。方法は、HIV-1複製のRNAベースの統合後の阻害剤をスクリーニングするために有用であり、そのようなウイルスRNA 18または統合された標的とするように設計されたCRISPR / CASシステムの改訂媒介輸出を標的とする小分子などの他の統合後の阻害剤をスクリーニングするために適合させることができますHIV-1 DNA 19。

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プロトコル

1.細胞およびトランスフェクション

  1. ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養HEK 293T細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました。細胞培養培地中の2×10 5細胞/ mlの懸濁液を調製します。それぞれ、ウイルス産生のために、24ウェル、96ウェル、12ウェルプレートの各ウェルに細胞の生存および免疫活性化アッセイ細胞懸濁液の500、100〜1,000μLを加える（ 図2A）。
  2. 静かにプレートを旋回し、5％のCO 2で37℃でO / Nそれらをインキュベートします。百分の50から70の密集度に細胞を増殖させます。
  3. トランスフェクションの計画によると、1.5ミリリットルのマイクロチューブ（例、 図2B）に試験RNAおよびそのコントロールの希釈液を準備します。
    1. ウイルス産生アッセイのために、HIV-1発現プラスミド10ngの/μlの希釈を準備し、各チューブに10μlを添加します。次の5μMの試験RNAの希釈液および陰性対照RNを準備A. 25または100 nMの最終濃度のために、対応するチューブに各試験RNAおよび陰性対照希​​釈の2.5または10μLを加えます。
    2. C：細胞生存率アッセイのために、試験RNAおよびポジティブコントロールRNA、低分子量ポリIの10 mg / mlで希釈5μMの希釈液を準備します。それぞれ、100 nMまたはそれを200μg/ mlの最終濃度のために、対応するチューブに試験RNAまたは陽性対照RNA希釈液の2μlを添加します。
    3. 免疫活性化アッセイのために、ステップ1.3.2で作成した試験RNAまたは陽性対照RNA希釈液の20μlのを追加します。それぞれ100 nMもしくは200 / mlの最終濃度、に対応するチューブに。
      テストRNA発現プラスミドのために、試験RNAの5μM希釈液の代わりに、10 ngの/μlの希釈液を調製し、ステップ1.3.1のための25および100 ngの最終的な量を与える：注意してください。およびステップ1.3.2のための100 ngの。および1.3.3。
  4. ウイルスのprodのための各トランスフェクションチューブにDMEMの50、25または75μLを加えますそれぞれuction、細胞の生存および免疫活性化アッセイ。ウイルス産生アッセイのために、次のステップの前にバイオセーフティレベル3（BSL3）研究室への細胞、準備トランスフェクションチューブをもたらします。
  5. トランスフェクションチューブにトランスフェクション試薬を順次2μlを添加して、複合体を形成することができるように、15〜20分間インキュベートします。使用される特定のトランスフェクション試薬のための材料の表を参照してください。
  6. 滴下細胞培養プレートの対応する位置に各マイクロチューブから全トランスフェクション混合物を加えます。ゆっくり旋回し、5％のCO 2で37℃で48時間プレートをインキュベートします。
  7. 細胞培養プレート中のHIV-1産生（セクション2）、細胞生存率（セクション3）と免疫活性化（セクション4）（ 図2C）を測定します 。

2.ウイルス産生アッセイ

  1. インキュベーターから24ウェル細胞培養プレートを外し、静かにBSL3細胞培養内部のプレートを旋回フード。 HIV-1産生を定量化するために使用される96ウェル平底プレートに対応するウェルに、各ウェルからの上清150μlのを転送します。
    注意：一般的なウイルスの定量アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）20、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）21によるウイルスRNAを定量することにより、HIV-1キャプシドタンパク質（P24）の発現を測定し、活性を測定することを含みますHIV-1 RT酵素。 2.2 2.5には、HIV-1 RT活性13,15,16を定量化する方法を説明する手順。
  2. ウイルスの破壊カクテル15（ 表1）の25μLを含む96ウェルプレートの対応するウェルに上清の5μlを採取し、。室温で5分間混合物をインキュベートし、放射能のワークステーションにプレートを転送します。
    注：ステップ2.2。放射能ワークステーションがBSL3実験室で利用できない場合のみ必要です。プレートから除去する必要がない場合BSL3実験室は、2.3に進みます。放射性カクテルを25μlの代わりにウイルス/放射性崩壊カクテル（ 表1）の50μlを添加します。
  3. 放射性カクテル15（ 表1）を準備し、ウイルス上清と混乱カクテルの各ウェルに25μlを添加します。 2時間37℃で培養します。
  4. スポット5ガラス繊維ディエチルアミノエチル（DEAE）フィルターマット紙で対応する四角の上に反応混合物μlのスポットが10分間乾燥させます。どの2つのサンプルが互いに直接ボーダーないように、他のすべての広場に反応混合物を発見。これは、ステップ2.6で分当たりのカウント（cpm）を決定する際にサンプル間のクロスオーバーを回避するのに役立ちます。
  5. 紙は、95％エタノールで2つの1分間の洗浄、続いて2×生理食塩水クエン酸ナトリウム（SSC）緩衝液（ 表1）を用いて5分間、5倍洗浄します。論文は、サンプルバッグにそれらを乾燥し、密封することを可能にします。
  6. クリップサンプルバッグCOカセットにフィルターマット紙をntainingし、マイクロプレートシンチレーションカウンターにカセットを挿入します。実験に使用した[32 P] dTTPのバッチのために提供基準日と32 Pのためのcpmを読むためにカウンタを設定します。プレートマップを使用して、読んで、カウンタを開始するためにどのサンプルを選択します。
  7. 任意のウイルスの定量法については、隣接する負の制御により、各試験RNAについて得られた値を分割し、試験RNAの各反復のためのHIV-1産生の阻害パーセントを取得するには100で、この値を乗算します。異なる濃度での異なる試験RNAを比較した結果の例を図3に提供されます。

3.細胞生存率アッセイ

  1. / mlのMTT（3- [4.5ジメチル-2-チアゾリル] -2,5-ジフェニル2H-テトラゾリウムブロマイド）ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水で希釈した（インキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、5 mgの20μlのを追加各ウェルにDPBS）。 Fプレートをインキュベートまたは37℃で3時間。
  2. 洗剤（1％NP-40、イソプロパノール中4 mMの塩酸）を各ウェルへと酸性化イソプロパノール150μlを添加して、室温で2時間プレートをインキュベート。
  3. マイクロプレート分光光度計で570 nmの吸光度を決定します。
  4. 隣接するトランスフェクション制御によって各サンプルについて得られた値を割ることにより、各陽性対照および試験RNAの相対MTT代謝を計算します。異なる試験RNAおよび陽性対照を比較した結果の一例を図4に設けられています。

4.免疫活性化アッセイ

  1. インキュベーターから12ウェルプレートを取り外し、培地を吸引除去します。静かDPBSで細胞を2回洗浄し、各ウェルに（プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む、 表1）冷溶解バッファ22の70μlを添加します。氷上で10分間、プレートをインキュベートします。
  2. マイクロチューブに細胞溶解物を移し、高速浸漬することにより、それらを凍結液体窒素中でチューブ。サンプルは解凍と3の合計2以上の凍結融解サイクルの繰り返しを許可します。
  3. 細胞破片をペレット化し、4℃、15,700×gで15分間、溶解物を遠心分離します。新しいマイクロチューブに上清を移し、クマシーブルー（ブラッドフォード）メソッド23,24を用いてタンパク質濃度を決定します。
  4. 10％変性ポリアクリルアミドゲルに各試料からのタンパク質の75μgのを解決し、以前に25,26を説明したように、ニトロセルロース膜に移します。
  5. 膜に電気泳動転写した後、蒸留水で洗浄し、1分間ポンソーS（ 表1）中で膜をインキュベートすることによってタンパク質バンドを明らかにする。 80と55 kDaので膜をカットするためのガイドとしてバンドおよびタンパク質ラダーを使用してください。
    注：カットスルー所定の位置で膜をカットしていないことが容易であるように、ステップでは4.4のサンプルは、34キロダルトンまでの16×18 cm 2のゲル上で実行することができます興味のあるバンド。また、いくつかのゲルは、膜を切断回避するために、同じ試料を用いて実行することができます。
  6. 0.05％トゥイーン20（TBST、 表1）を含有するトリス緩衝生理食塩水ポンソーS染色を洗い流します。完全に膜をカバーするために、5％無脂肪乳でTBSTを追加します。 1時間攪拌しながら室温で膜をインキュベートします。
  7. 、ADAR1（110と150キロダルトン）、ホスホPKR（62キロダルトン）、およびホスホIRF3（47キロダルトン）に対して千1に希釈した3％ウシ血清アルブミン（BSA）とTBSTで膜をO / N及び抗体をインキュベートそれぞれトップ、膜の中央部および底部片のため。
  8. 膜をTBSTで5分間、5倍、1時間（5,000 1に希釈）を5％脱脂乳およびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体を用いてTBSTでインキュベート洗います。
  9. TBSTで5分間膜5回洗浄し、製造元の指示に従って、フィルム上のバンドを可視化するために電気化学発光（ECL）ソリューションを適用します。
  10. フィルム上のタンパク質バンドを可視化した後、抗体剥離液で10分間、膜の中央と下部の部分を洗います。 IRF3（500中1で）総PKRに対する3％BSAを含むTBSTで膜をO / Nおよび抗体をインキュベート（千1時）、それぞれ中間及び底部片のため。繰り返しは、4.8を繰り返します。 4.9。 PKR膜（中央）、抗ウサギ二次抗体の代わりに、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスを用いました。
  11. TBSTで5分間膜5倍の底部片を洗浄し（5000で1に希釈）アクチンに対する抗体で1時間、3％BSAを含むTBST中で膜をインキュベートします。繰り返しは、4.8を繰り返します。 4.9。抗ウサギ二次抗体の代わりに、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスを用いました。異なる試験RNAおよびポジティブコントロールを比較した結果の一例を図5に設けられている。使用される特定の抗体のための材料の表を参照してください。

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結果

手順の一般的な概略図は、3つの試験RNAおよび図2Bに設けられたコントロールRNAのための例示的トランスフェクション計画を図2に示されています。ウイルスの産生および細胞生存率アッセイのために、各試験構築物のための読み出しは、陰性対照に正規化されます。各試験RNAは、その隣接する負の対照に対して標準化されるように複製が、セットでトランスフェクトされます。これは、例えば、陰性対照のすべてが最初にトランスフェクトされ、場合に生じ得る、複合体およびトランスフェクションの間の時間に関連した不正確なデータを避けるために行われています。 HIV-1は、免疫応答27,28に影響を与えることができるので、細胞の生存および免疫活性化アッセイは、HIV-1を発現するプラスミドの添加なしに行われます。

HIV-1 RNA（位置1498から1415で保存された部位を...

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ディスカッション

HIV-1産生アッセイを説明11,31標的部位をHEK293T細胞（ 図2）を使用して実施し、効果的なリボザイム13、shRNAを10,29のためのHIV-1 RNAをスクリーニングするために使用されるアッセイと類似して、siRNAの30、及びU1i RNAました。 HIV-1産生を定量するために異なる方法を使用して、ほとんどの研究は、候補RNAとHIV-1発現プラスミドのコトランスフェクションした後、ウイル​​ス産生の48時間を測定しました。 HIV-1の産生に続いて、未成熟ビリオンは、新しい細胞に感染することができる成熟ビリオン、となるようにHIV-1プロテアーゼによるそのポリタンパク質のタンパク質分解的切断を受けます。工程2.2に記載のHIV-1 RT酵素活性アッセイのために。 RT酵素が成熟ビリオンでのみアクティブになりますので、2.5に。、生産および成熟段階の両方が、評価されます。対照的に、カプシドタンパク質及びウイルスのRNAの両方の成熟と未成熟ビリオン中に存在してもよいです。したがって、p24のELI...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

ここで紹介する作品は、（AGにDCB-120266、PPP-133377およびHBF-348967を付与）健康研究（CIHR）のカナダの研究所によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
ペニシリン/ストレプトマイシン GibcoThermo Fisher15140-122
細胞培養プレート、96 ウェル、24 ウェル、6 ウェル。Corning353075, 353047, 353043
Micro tubes AxygenCorning311-08-051
低分子量 Poly I:CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01合成RNA用トランスフェクション試薬
TransIT-LT1Mirus MIR2300RNA発現プラスミド
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
poly(A) RNA template Sigma-Aldrich10108626001
オリゴ(dT)<サブ>12-18 DNAプライマーサーモフィッシャー18418-012
DEAE フィルターマット紙 Perkin Elmer1450-522
マイクロプレートシンチレーションカウンターPerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
マイクロプレート分光光度計Bio-rad1706930
Lysis buffer tabletsRoche4693159001, 4906837001プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤
微量遠心分離機Eppendorf5415R
Bradford 試薬Bio-rad500-0006
ゲルランニングチャンバーHoeferSE600
セミドライトランスファーセルBio-rad1703940
Protein ladder EZ-RunThermo FisherBP3603-500
ニトロセルロースメンブレンBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
抗体ストリッピングソリューションミリポア2504
ECL - PierceThermo Fisher 
ADAR1 抗体. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antibodyAbcamab32036
phospho-S396-IRF3 antibodyCell Signaling4947
PKR antibodyfrom Dr. A. Hovanessian
IRF3 antibodyCell Signaling11904
Actin 抗体ミリポアMAB1501
ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギKPL474-1506
ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスKPL474-1806
ポンソーS シグマ-アルドリッチ6226-79-5
用トランスフェクション試薬PI32106 Dr

参考文献

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