Nonarteritic前部虚血性視神経症の齧歯類モデル（rNAION）

サマリー

次のレポートは、適切な色素、コンタクトレンズ、レーザーパラメータを使用して、非動脈性前部虚血性視神経障害（rNAION）のげっ歯類モデルを再現する方法を説明しています。また、in vivoでrNAION病変を評価するための適切な手順を明らかにします。

要約

非動脈性前部虚血性視神経ニューロパチー(NAION)は、視神経の限局性虚血性病変であり、生涯を通じて1/700の個人が罹患しています。NAIONは、視神経浮腫、網膜神経節細胞ニューロン(RGC)の選択的喪失、および視神経の萎縮を引き起こします。NAIONのほとんどの特徴と後遺症を発現するNAIONのげっ歯類モデルが開発され、ラットとマウスの両方に適用できます。このモデルは、532 nmの波長の焦点レーザーアプリケーションを利用して、光活性染料であるRose Bengal(RB)を照らし、標的の前視神経(層流領域)で毛細血管の損傷と漏出を引き起こします。rNAION導入後、早期視神経虚血、視神経浮腫、神経内炎症を呈し、その後、選択的RGCと軸索喪失が進行します。視神経は中枢神経系白質路であるため、rNAIONモデルは選択的白質虚血の機構研究、神経保護分析、虚血に対するグリアおよびニューロン応答の短期および長期のメカニズムに適用できます。

概要

Nonarteritic前部虚血性視神経症（NAION）が^1（ON）視神経の前方部分の焦点虚血性病変です。 NAIONは、機構が神経内の浮腫につながるコンパートメント症候群であると考えられる。50 ²歳以上の個人の突然の視神経関連失明の最も一般的な原因であり、視神経内の軸索を供給する毛細血管の圧迫を引き起こします^3。

ONは、実際に、中枢神経系（CNS）管であることから、齧歯類NAION（rNAION）モデルは、単離されたCNS白質ストロークの機構および応答を研究するために使用することができます。 rNAIONモデルは、したがって、白質に脳卒中に関連する損傷に関連した多くの問題を解剖するのに有用であり得ます。白質行程で異なる神経保護戦略と薬剤を評価するために使用することができます。

モデルの中で最も魅力的な特徴の一つは、それがあるということです無痛、非侵襲的な手順。レーザー出力は、虚血性損傷の種々の程度を生成するように調整することができます。別の特徴は、進行性の毛細管機能不全を生成、毛細血管内皮を損傷するレーザー誘起スーパーオキシドラジカルに依存することです。それはNAIONを引き起こすメカニズムと非常に類似していると考えられているこの機能障害および進行性の浮腫です。研究は、それが直接の毛細管凝固を起こさないことを示したが、少なくとも二つのメカニズムを介して動作している：毛細血管内皮細胞の一部⁴のスーパーオキシド誘導死とストリッピング、およびNFkBの（核因子カッパ軽鎖-エンハンサー活性化B細胞の間質⁵に細胞膜を横切る流体輸送を増加して）、内皮の残りにまで炎症レギュレーションに関連。視神経乳頭虚血における間質液の蓄積結果に起因する視神経の毛細血管および圧縮の閉鎖。模式画像がに示されています図2。rNAIONモデルは両方ラットおよびマウス種^6,7で使用することができ、軽度病変から視神経と網膜の完全な、しかし痛み破壊する、その重症度のレベルに変化させることができる、そのような網膜中心動脈閉塞（CRAO）など。

プロトコル

このプロトコルは、メリーランド大学の施設内動物管理及び利用委員会（ボルチモア、MD、USA IACUC）によって承認されました

1.実験の設定

1. 3ミリメートルの厚さの直径プレキシグラスで明確な光学グレード円形7ミリメートル、からカスタム設計されたコンタクトレンズを作ります。ドリルプレスの円形レンズをカットします。内側の曲線を作るために、標準のドリルビットを使用し、最終的には超微細グリット（3000分の1000）のコンタクトレンズ研磨機を使用して、外側と内側のカーブを磨きます。
2. 事前にpH7.4のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に2.5 mMのローズベンガル（RB）を準備し、フィルタまでの6ヶ月間、光を通さない容器に-20℃で0.45ミクロンのシリンジフィルターと店舗1ミリリットルのアリコートで滅菌します。
   注：このようなスプラーグドーリーなどのアルビノの非近交系雄の動物の使用は、ひずみ依存性応答の違いを最小限に誘導の増加使いやすさを可能にし、発情cycliで発生する可能性が変動性を減少させますngの女性。
3. 周波数を設定しネオジムイットリウム・アルミニウム・ガーネット（FD-YAG）532 nmのレーザー光を発生する眼科医療レーザーを、倍増しました。標準的な眼科用レーザーアダプタを使用して、ハーグ・シュトライト眼科スリットランプ上にレーザをマウントします。この市販の装置は、動物の眼とレーザスポットアプリケーションの同時可視化を可能にします。医療レーザーは、レーザー誘導と同じスポットサイズを使用して焦点を当て、適切および中心のための照準ビームを持っています。次のようにレーザパワーパラメータは次のとおりです。
   1. ラットrNAIONの誘導のために：500μmのスポットサイズ/ 50mWのレーザパワー/千ミリ秒の持続時間/千ミリ秒間隔を使用します。
   2. マウスrNAION誘導のため：小さい視神経乳頭のために300μmのスポットサイズを変更し、ラットの設定と同じ他のパラメータを残します。
   3. 日常的にレーザー出力を保証するために、レーザーパワーメーターを使用。

2.実験方法

1. レーザーパワーをオンにしますそして、適切なレーザーパラメータを設定します。使用前に少なくとも5分間レーザーを温めます。
2. ケタミン/キシラジンおよびRB色素に対する適切な用量を決定するために動物を秤量します。 80 mg / mlでケタミンおよび4 mg / mlとキシラジンを1ml / kgの混合物の腹腔内注射によって動物を麻酔。
3. 完全に麻酔になるまで加熱されたケージに動物を残します。嫌悪刺激（尾や足指のピンチ）への応答がないか確認してください。麻酔の深さごとに10分のために動物をチェックしてください。
4. 1％トロピカミドで動物の瞳孔を拡張し、0.5％のプロパラカインと眼の表面を麻酔。このようなロング・エヴァンスなどの着色された動物を、使用している場合は、2.5％neosynephrine眼滴が瞳孔拡張が増加します。
5. ビューをブロックしないようするように誘導される側の銃口に近いウィスカーをカットするはさみを使用してください。
6. 1％メチルセルロースまたはカスタムメイドコンタクトレンズの内側に他の眼科用カップリングドロップのドロップを入れて、[トンの上にレンズを適用ラットの目を彼。
7. スリットランプの高さに調節プラットフォーム上で動物を置きます。眼は、スリットランプ、レーザービームに対して垂直になるように45°の角度で、動物の頭を設定します。
8. 眼科スリットランプを通して目を可視化します。照準ビームは、右のサイズだけでなく、集中して可視化視神経に直接中心にあることを確認します。特注のアダプタを使用してスリットランプの目の作品の一つに搭載された高速 - 高ASA（2000 1200）でデジタルカメラを使用して眼底を撮影。
   注：脈絡膜血管を見る能力が網膜の透明性を明らかにする。これが発生した場合の解釈を混乱することができ、後に網膜虚血を検出することができるようにするために重要な兆候です。 rNAIONは、網膜損傷における網膜虚血の結果は、内網膜層の細胞のすべてに影響を与えながら、孤立したRGCの損失をもたらす視神経虚血、です。
9. 必要に応じて、さらに画像網膜と非誘導の目を評価するために、スペクトルドメイン光コヒーレンス断層撮影^（SD-10月8日^）を使用して視神経。網膜（ 図3C）を介して、 面 （ 図3B）、ならびに7断面スキャンエンスキャンします。 SD-OCT画像化は、レーザー誘導のために使用される同一のコンタクトレンズを使用します。
10. 1ml /尾静脈を介してキロRBを注入し、30秒間、次いで、レーザーパワーをアクティブに待機。この遅延時間は、循環全体に均等に分配するためにRBを可能にします。私たちは、1秒/パルスで50mWのレーザーパルスを使用しています。グレーターエネルギー（≥60 MW）は、網膜を損傷したり、網膜血管虚血を引き起こす可能性があります。
    注意：誰もが研究者の目に入る迷光レーザ光を防止するために、適切な遮断波長のレーザー安全フィルタリング眼鏡を持っていることを確認します。
    注：染料は循環から迅速に除去されるので、レーザーの管理は、IV RB注射後急速に与えられなければなりません。長いレーザー誘導、より深刻な視神経虚血。立て続けに12秒のパルス - 一般に、動物を7が与えられます。循環色素レーザ光の接触は、視神経血管にスリットランプ（ 図4B）を通して見ることができる美しい金色の輝きを与えます。これは、染料が全身に注入し、血流中に分布していたことを証明します。グローはかすかな、または全くなし（ 図4A）である場合、色素が静脈内に注射されませんでした。動物が再注入する前に、少なくとも2日間回復する必要がありますので、この場合には、すぐに二回目の注射を与えることはありません。
11. すぐに誘導した後、コンタクトレンズを取り外してください。デキサメタゾンと眼科トリプル抗生物質（ネオスポリン/ポリミキシン/バシトラシン）軟膏で両目を覆い、完全に回復するまで近い観察下で、単一の収容されたケージ内の37℃の加温パッドの上に動物を配置します。
    1. 蒸留ワットでコンタクトレンズを清掃してくださいATERは、将来の使用のための非研磨洗浄布で水分を拭き取ります。
    2. 誘導後の二日は、眼底のカラー写真とSD-OCT分析⁸の両方によって視神経浮腫を評価します。
       注：視神経浮腫の程度を比較するとは、視神経虚血の重症度の推定を与えます。 2日目に、視神経ディスクマージンがぼやけて、網膜静脈はやや反対側（非誘導）目と比較して、拡張されています。電図（ERG）を実行し、2と4週目に視覚誘発電位（VEP ^11）を点滅電気生理学解析のための誘導を投稿してください。

結果

コンタクトレンズ有効中心網膜の視覚化（ 図1）。焦点レーザスポットは、網膜の奥の視神経乳頭（ 図2）を照射します。通常の非誘導網膜は細隙灯生体顕微鏡（ 図3A）によって、およびSD-OCT（ 図3Bおよび3C）によって撮像示されています。全く色素が循環中に存在しない場合、レーザー誘導中、レーザ光は、容器と、ディスク蛍光（ 図4A）をもたらしません。静脈内RBおよび視神経（ 図4B）に黄金色の蛍光の光学ディスクの結果について、レーザー光の照射。 rNAION誘導2日後、視神経は（ 図 5A）の腫れである。 エン面と断面SD-OCTディスク腫脹（ 図5B）および視神経（ 図5C）の拡大を明らかにしました。

ディスカッション

視神経損傷（視神経挫滅^12、視神経離断^13、及びパイオン^14）のモデルの数がありますが、rNAIONモデルは、ラットとマウスの両方に適応人道的です。これは、より密接NAIONのヒト臨床症状に似ています。この条件は、プログレッシブ前方視神経浮腫、前視神経コンパートメント症候群、焦点軸索虚血、長時間経過にわたって孤立した網膜神経節細胞の軸索損傷および損失が含まれています。現在のレポートは、rNAION誘導のための適切な手順を与える誘導の間に潜在的な問題について説明し、説明した後早期誘導は前のデータを含めるに誘導された病変の品質を評価するために使用することができる分析します。 rNAIONモデルの利点は、実際と、損傷の比較的一定のレベルを達成することができるということです。典型的には10 - 65％のRGC喪失 -​​ 40で11秒露光結果。成功率は、個体から個体へデに変えることができます経験やスキルに保留中が、経験豊富な研究者はほぼ100％の誘導率を達成することができます。

誘導が容易に加えて、病変の重症度と経過時...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
50 mW 532 nmレーザー	Iridex		標準眼科レーザー
0 - 100 mW 532 nmレーザー	Laserglow技術		iridex
レーザースリットランプアダプター	Iridex		SMA結合アダプター
サーモパイルセンサー付きCoherentフィールドメイトレーザーメーター	Coherent		その他も適切
眼科検査スリットランプ生物顕微鏡	様々な		Haag-Streitは最高です;ebayで入手可能な安価なバージョン
ローズベンガル	シグマ	330000-1G	光誘導剤
眼底 コンタクトレンズまたはガラスカバースリップ	カスタム/カンターとニッセル(英国)		目の検査と誘導のためのカスタムデザインの平凸プラスチックレンズ
トロピカミド1%
タミヤ研磨コンパウンド	タミヤ、INC	87068	コンタクトレンズ
2.5%ヒプロメロース(Goniovisc)/ 1%メチセルロース	ハブ医薬品		コンタクトレンズカップリング剤
2.5%ネオシネフリン眼科用ドロップアル	コンラボ		瞳孔拡張剤
トロピカミド1%	アルコンラボ		瞳孔拡張剤
0.5%プロパラカイン	Alcon labs		局所麻酔薬
30 G 溶融針インスリン注射		バラの静脈内注射のための	さまざまな
キサメタゾンを添加した抗生物質軟膏 (トリプル抗生物質軟膏)	さまざまな		角膜の瘢痕を最小限に抑えるために誘導後に適用する
ハイデルベルク株式会社 スペクトル ドメイン-光コヒーレンス 断層撮影	デルベルクCorporation		光コヒーレンス測定のベースラインおよびインダクション後。インダクションには必須ではありません

レーザーの代替品 レーザー出力用研磨器 デ ハイ