マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

Summary

いくつかの方法は、マウスにおける細菌性肺炎をモデル化するための文献に記載されています。ここで、我々は、中咽頭にピペット細菌接種の吸引（ すなわち 、吸入）を介して肺炎を誘導するための非侵襲性の、安価で迅速な方法を記載します。肺の先天性免疫応答を評価するための下流の方法も詳しく説明されています。

Abstract

市中肺炎は、主要な公衆衛生問題のままであるが、細菌性肺炎のマウスモデルは、最近、基礎となる細胞および分子病態の理解に重要な前臨床の進歩を促進した。 インビボのマウスモデルがで宿主防御応答の統合生理学と回復力をキャプチャ代替によって明らかにされていない方法は、ex vivoでのアプローチを簡素化。いくつかの方法が「ブラインド」と条件を可視化し、経皮的気管内挿管下エアロゾル、鼻腔内送達、経口気管内挿管を含むマウスにおける細菌の肺内接種のための文献に記載されています。すべてのメソッドは、相対的なメリットと制限があります。ここで、我々は、詳細には、マウスによって吸引（ すなわち 、吸入）含む細菌の気管内送達のための、非侵襲性の技術的、非集中、安価で、かつ迅速な方法を記載します一方、全身麻酔下咽頭内にピペット感染性接種物の。この方法は、非苛性生物・化学物質の多種多様の肺送達のために使用され、さらに肺の手順で最小限の経験と研究室のために、学ぶことは比較的容易であることができます。誤嚥性肺炎の方法を説明することに加えて、我々はまた、特に、in vivoでのマウスの肺の先天性免疫応答、後続をアッセイするためのステップバイステップの手順を提供し、細菌排除し、感染気道の細胞性免疫応答を定量する方法。肺炎の評価にこの統合とシンプルなアプローチは、肺先天性免疫の際に遺伝的および環境的操作の効果の迅速かつ堅牢に評価することができます。

Introduction

市中肺炎は、ワクチン接種の改善および抗生物質戦略^1,2にもかかわらず、過去40年間の死亡率にはほとんど全体的な変化で、米国での感染による死亡の主要な原因のまま。公衆衛生レベルでの知覚進歩性の欠如にもかかわらず、近年の飛躍的な進歩は、前方肺感染症のマウスモデルを使用することによって可能になったこれらのステップの多くは、肺炎の分子や細胞病因の我々の理解で行われています。マウスの遺伝的扱いやすさは、マウスおよびヒトの免疫システム、及び商業的に利用可能になっているネズミ標的免疫学的試薬の広大な配列の類似性は、一緒にフィールドの急速な進歩を促進しました。

文献に記載された細菌性肺炎のマウスモデルは、一般的に病原体接種のための4つの技術的な経路の1つに依存してきた：ⅰ）エアロゾル化。 ⅱ）INTRanasal配達; ⅲ）経口配信。およびiv）外科的気管内注入（ すなわち 、気管切開^）3。感染のすべてのルートは、長所と短所^3を持っています。口鼻内細菌叢、全身麻酔のための要件の混合物のための特定の、相対的な上気道の暴露、潜在的には、遠位の肺に送達接種材料、配信病原体の葉の分布、技術的専門知識の要件、および手続き罹患率の変動は、これらの全体に広く変化しますアプローチ。

一般的に使用される経口感染手法は「ブラインド」（非可視化）の手法のいずれかを経由して、または直接喉頭可視化^3-5の下で気管内（translaryngeal）カニュレーションが含まれます。どちらの方法は、堅牢ながら、かなりの訓練を必要とし、また、上気道に外傷が生じるおそれがあります。本報告書では、wは、経口感染の技術的、非集中的な非侵襲的、安価で、かつ迅速な方法を記述するここに細菌（提供された例で肺炎桿菌 ）、麻酔したマウスの中咽頭内にピペットを吸引（ すなわち 、吸入）を経由して肺に送達されています。我々と他の人が成功し^6-9誤嚥性肺炎の技術を使用しています。この汎用性と簡単に学習した肺の配信方法は、サイトカインおよび他のタンパク質、病原体関連分子（ 例えば 、リポ多糖）、細胞（ すなわち 、養子移入）を含む肺に多くの追加の非苛性薬剤の送達に拡張することができますおよび毒素（ 例えば 、ブレオマイシン）。重要な技術的な考慮事項を議論することに加えて、我々はまた、下流の細菌クリアランスの測定（ すなわち 、コロニー形成単位[CFU]肺及び末梢器官における定量化）および白血球を含む、肺炎に続いて宿主応答を評価するための統合された、定量的アプローチを説明します空域における蓄積。

Protocol

全ての実験は、NIEHSの動物実験委員会による審査の後に実験動物の愛護管理と使用上の動物福祉法と米国公衆衛生サービスポリシーに従って行われました。

K.の調製ニューモニエ文化

注意：バイオセーフティーレベル2（BSL2）フードまたは他のBSL2指定された領域内のすべてのステップを実行し、同研究所のBSL2ガイドラインあたりの廃棄物を捨てます。

1. K.のサスペンション成長のためニューモニエ 、バクテリアのグリセロールストックを解凍し、Kの1ミリリットルを転送することによって作業培養物に接種500ミリリットル以上のフラスコ中のトリプティックソイブロス（TSB）の50ミリリットルに肺炎連鎖球菌株 。
2. 培養した対数期Kの900μLを加えることによって、グリセロールストックを作りますニューモニエの滅菌グリセロールを100μlにし、-20℃または-80℃〜で凍結。長期保存のため、-80°Cを推奨します。
3. Sからの培養菌一夜フラスコを振とうすることによって1.1をTEP - 、200から225 rpm.In対数期の成長を促進するために、37℃で（14〜18時間）の午前中に50ミリリットルのTSBを含むフラスコに、この一晩培養1-5 mlで希釈し、 〜2.5時間、37℃で振盪しながら戻って置きます。
4. Kの1ミリリットルを転送2分間、7500×gで1.5ミリリットルチューブとスピンへの最後のステップからの肺炎文化。白いペレットが表示されるはずです。静かに滅菌生理食塩水1mlにピペットを用いて細菌を再懸濁し、ペレットを乱すことなく上清を除去し、2分間7500×gで再びスピン。
   1. この洗浄工程を2回、最終の立ち上げを行い、滅菌生理食塩水1mlにペレットを洗浄しました。
5. このきちんとした接種材料のログごとの連続希釈液を実行します。例えば、10 ^-1 -10 ^-9希釈系列を作るために、直列の滅菌生理食塩水3.6ミリリットルに接種物の400μlを添加します。
6. 洗浄KのOD _600を決定_します 肺炎連鎖球菌の1ミリリットルを配置することにより、1：10〜1：100使い捨てキュベットに希釈液および滅菌生理食塩水で最初のブランキングOD _600を測定_します 。正確性を確保するため、重複を測定します。 1.0のOD _600が 4-7×10 ⁸ CFU / mlのとほぼ同等です。 ODとCFUの関係/ mlのは線形ではないかもしれないことに注意してください。
   1. Kの濃度を計算するために希釈液からOD _600を使用しますCFU / mlを超える変換、および希釈でのファクタリング：ODを適用肺炎 。
7. Kを使用肺炎濃度 （下記参照）のマウスへの送達のために、<100μlの体積で、所望の接種CFUの用量を調製しました。
8. また、10 ^{-6〜10 -9}希釈液を100μl、室温で個々のトリプシン大豆寒天（TSA）プレート上に滅菌生理食塩水100μlのプレート。 37℃で一晩インキュベートし、実験に使用し、汚染を制御するために正確な濃度を計算するために細菌コロニーを列挙する。
   注：最終接種の実際の細菌濃度は、吸光度によって予測500 CFU / mlの±とすることができます。彼らの個人的な経験に基づいて、CFU / mlの変換：経験的にOD _600を再調整し、マウスの生体内で使用する前にパイロット研究におけるCFU / mlの関係：実験者は、理想的には、OD _600を確認_する必要_があります。

K. 2.マウス気管内（it）吸引中咽頭からニューモニエ

1. そのマウスを確認を一意にテールマーク、入れ墨、または他の承認された識別子によって識別されます。
2. 手続きを迅速化するために、イソフルランからマウスを削除する前にP200ピペットを用いて細菌の接種物を投与描きます。それ吸引で最良の結果を得るために、オーバーフローを防止するために、<100μlの容量を使用します。ここで、Kの2000 CFU / 50μLを使用しますニューモニエ 。
3. イソフルランガス（1L /分の流速で、例えば 、2％イソフルラン）と透明なチャンバ又はinstitに従ってマウスを麻酔utionalガイドライン。一緒に麻酔するマウスの数は、典型的には1〜2時間で、実験者の快適さのレベルによって決定されます。呼吸を観察し、深呼吸が表示され、2-3秒の呼吸の間でカウントすることができたら、麻酔のレベルを確認します。
   注：揮発性（吸入）麻酔薬の可能交絡影響が懸念される場合には、麻酔はケタミン/キシラジンの腹腔内注射で代わりに実現することができます。上述の方法では、深い麻酔は数分続きます。より長時間の麻酔が誘導された場合に、眼軟膏、眼の乾燥を防ぐために使用されるべきです。
4. マウスを麻酔した後、傾斜プレキシガラスボード上のペグ（ 図1）間に張らゴムバンドからの上顎切歯によって中断半横臥仰臥位、でそれを配置します。
5. 優しくP200 pipettと口腔内鈍非隆起し鉗子および預金量一対の側にマウスの舌を引っ張ります電子。舌や咽頭のいずれかに外傷を誘導することを避けるために細心の注意を払います。
6. 引き込ま舌を維持したまま、マウスが吸入されるまで、そっと手袋をはめた指で鼻を塞ぎます。マウスが2以上の吸入をとっている、と液体が口腔内に表示されなくなるまで鼻をカバーするために続けます。鼻を覆うことマウスが必須の鼻ブリーザーあるように、マウスは、肺に細菌を吸い込むことを確実にするのに役立ちます。
7. 接種ボードからマウスを削除し、そのケージに戻って、マウスが麻酔から回復している間に鼻孔をブロックから寝具や破片を防ぐために、その背中の上でマウスを置きます。
8. 一旦、全てのマウスが投与されており、麻酔から目覚めてきた、Kを投与されてきたマウスのみを含むキュービクル/客室内に家のマウス48時間後に感染を越えて行く場合ニューモニエ。体重を含め、毎日マウスを監視します。
9. マウスは48を超えて行くことを許可する場合は、毎日マッシュおよび/または補足熱を使用してください時間。

3.気管支肺胞洗浄液（BALF）の収集と分析

1. 機関のガイドラインあたりのマウスを安楽死させます。これはCO ₂吸入と頸椎脱臼に関連した肺への可能な合併症を回避するようにここでは、失血に続いて150ミリグラム/ kgのペントバルビタールナトリウムや商業安楽死ソリューションの等価線量の致死注射を使用します。
2. バックの位置でマウスとは、特に胸や首の領域にわたって70％エタノールで毛皮を噴霧することにより、マウスを滅菌します。
3. その後、鉗子で胸骨を保持し、ちょうど胸骨の下の縦方向のカットを行い、ニック横隔膜、肺が戻って胸腔内に落下することができます。気管を露出させ、血管系のいずれかの側に胸腔を通ってカットした後、首を通ってアップ。
4. 気管がいずれかの側に縦走筋に囲まれているように、注意深くとして、中央から切断され、側面に組織をプッシュこれは、気管内に血液を導入することができ、周囲の血管系を、切削避けることができます。血管系がニックを入れている場合は、気管内腔にアクセスする前にガーゼで周囲を清掃してください。
5. ニックに気管ダウンヘッドからの道の1/4程度を手術用ハサミや針を使用し、尾側に気管内に1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）1mlでプリロード1mlシリンジに取り付けられたカニューレを挿入します。マウス<8週齢または女性を使用している場合は、600〜800μlにlavaging量を減らします。
6. すべてのローブは膨らませると、その後3回繰り返し、注射器でバックボリュームを引き出しできるように、ゆっくりと肺にボリュームを押してください。 PBSは、鼻孔から出てくるされている場合はカニューレを気管に十分に押されていないか、またはインフレがあまりにも急速に発生しています。肺が十分に膨張されていない場合は別の方法として、カニューレはあまりにも遠くに押されたので、少し撤回します。
7. 氷上で15 mlのチューブ内のプールされた洗浄液を収集します。
8. スピン5分間1,200×gで空域洗浄液を1.5 mlチューブに上清を回収し、-80℃で凍結します。続いて、タンパク質を測定するため、サイトカイン、および他の様々な生化学的アッセイのために上清（ 即ち 、BALF）を使用します。ペレットは、気管支空間から細胞を表します。
9. 赤血球（RBC）の色に基づいて細胞ペレットに明らかである場合は、1分間のACK溶解緩衝液1 mlの溶解は、溶解反応を停止し、バッファに希釈し、1×PBS 5mlを加えました。 ACK溶解緩衝液で処理かのいずれかで、同一の全ての検体を取り扱います。
10. スピン細胞を5分間、1200×gで、上清をデカントし、1×1mlのPBSに細胞を持ち出します。
11. 総空域細胞の計数のための血球計数器上の細胞をボルテックスし、数えます。
12. 細胞の密度に基づいて、サイトスピン遠心分離機にスライドチャンバーに約80から150マイクロリットル（感染したマウスとナイーブマウスのための〜150のための〜80μl）を追加します。スピンセル顕微鏡への細胞の差動集団を決定するために、その後の染色のためにスライドします。
13. 細胞は一晩スライド上で乾燥することができます。ステインスライドを固定液で7回、汚れ1で9回、ステイン2で7回（汚れの間にはリンス）を浸漬することによってトライ染色で細胞（ 例えば 、ヘマ3 [表を参照]）、および乾燥することができます。汚れが乾燥した後、手動でカバースリップのスライドとは、顕微鏡による差を数えます。一般的には、好中球および単球/マクロファージは、簡単にそれらのサイズおよび核形態によって区別されます。

4.肺および末梢組織における細菌負荷を決定

1. 始める前に：血のために、肺および脾臓のために1×PBS900μlの希釈用チューブを準備し、1×PBS90μlの。細菌を培養するため、室温で設定されたラベルプレート。組織が収集された後、したがって、時間が細菌増殖のための均質化とメッキとの間に最小化されます。
   注：これにより、不均一deposiに吸引で発生する可能性が肺の中の細菌の化は、個々のマウスは、総気道細胞性または合計（二国間）肺細菌負荷のいずれかの分析に使用することをお勧めします。
2. ステップ3.1に従ってマウスを安楽死させると、その後凝固を避けるために、ヘパリン処理したチューブ内に配置し、左心室から血液を採取。 1×PBSの2ミリリットルに脾臓と配置を除去し、1×PBSの5ミリリットルを含む15mlチューブ内のすべての肺葉と場所を削除してください。氷の上にチューブを入れます。各組織/マウスとの間にエタノールで楽器をきれいにするために注意してください。
3. 好ましくは、各サンプル間で変化させることができる使い捨てホモジナイザーで、氷上で組織をホモジナイズします。使い捨てホモジナイザーヒントは実験間の再利用のためにオートクレーブ処理することができます。
4. 組織が均質化された後、連続希釈液とプレートを実行します。プラスチック上の分割線を描くことによって、単一のTSAプレート上に二重に所定の組織/希釈のプレートサンプル。めっきおよびジリューションの提案は以下の通りです（すべてのケースでは、10μlのサンプルをプレート上に広げる）および24時間感染後の剖検に基づいています。 48〜72時間の試料を分析する場合は、希釈液のより大きな数は、後の時点で増加細菌負荷にメッキされる必要があるかもしれません。
   1. ブラッドのために - 滅菌1×PBS90μlの中に血液を10μlを添加することにより、1:10に希釈します。プレートきちんとして重複した中で1:10に希釈した試料。血液がメッキされた後、サイトカインおよびケモカインの測定のために血漿を抽出するために10分間、9,300×gでの残留血液をスピン。
   2. シリアル滅菌1×PBS900μlの中に均質化された肺の100μLを添加することにより、100：肺のために - 1 - 1:10希釈します。プレートきちんとホモジネートと重複ですべての希釈。
   3. シリアル滅菌1×PBS900μlの中に均質化された脾臓100μlを加えることにより、100：10-1： - 脾臓のために1を希釈します。プレートきちんとホモジネートと重複の両方の希釈液。
5. スプレッドサンプルを簡単に乾燥することができます。
6. 一晩静37℃のインキュベーターにTSAプレートと場所を反転。
7. プレートの両側から、各希釈から細菌コロニーを平均化することにより、コロニー形成細菌の数を決定します。全組織のCFUを決定するために、肺のために5ミリリットルおよび脾臓のための2ミリリットルの初期希釈液の要因。

Results

C57BL / 6マウスを、K. 2000 CFUを感染させました肺への口腔咽頭吸引を経由してニューモニエ 43816（血清型2）。この用量では、マウスは通常、嗜眠、フリル毛皮、5〜10％の重量損失（ 図2A）を含む臨床症状12-24時間後に感染を示し始めます。 48~72時間後、感染内、マウスの多くは、典型的には、減少した活性を有する猫背姿勢の20％減量し、その結果の平均値が先行し、刺激に対する応答性を低下させる疾患及び病的状態の症状を示します。長い期間の研究は、Kの低用量を必要とするかもしれませんニューモニエ 。 Kの500 CFUの感染肺炎は、回復と体重増加は一日5-6（ 図2B）で始まると10〜15％の重量減少により特徴付けられる3-5 D感染後のピークより穏やかな病気をもたらします。体重を20％希の重量損失と、しばしば生存を予測しますLY回復に関連付けられています。

Discussion

細菌性肺炎のマウスモデルは、遺伝子ターゲティングでおよびin vivo生物学的および薬理学的な介入で提携し、肺の宿主防御応答に重要な洞察を提供しています。大きな進歩は、感染した空域^10,11に好中球の動員を支配するケモカインおよび接着分子の我々の理解に特になされてきた。肺炎のインビボのモデルを、細胞ベースまたは代替的なアプローチとは異なり、また、内分泌へのキーの洞察を提供してきました感染した肺と肝臓（急性期応答）などの他の臓器との間で発生する通信¹²および副腎（ストレスグルココルチコイド^）13。最後に、in vivoでの肺炎モデルによって明らかにされ、臨床的に重要かつ関連性の高いポイントが成功した病原体のクリアランスがホストの成功に等しいではないということです。多くの場合、過剰に豊富な免疫応答は、宿主の死につながる可能性がありでも成功した病原体のクリアランス^8,14の顔における過度のバイスタンダー肺損傷に起因。この指定された、病原体のクリアランス及び免疫応答の並列測定が一般的に最...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
肺炎桿菌、血清型 2	ATCC	43816
トリプシン大豆ブロス	ベクトン ディッケンソン	211825
エクセル セーフレット IV カテーテル、18 G x 1 1/4 インチ	クラフリン医療機器	MEDC-031122
ヘマ 3 ソリューション 1	フィッシャー	23-122-937
ヘマ 3 ソリューション 2	フィッシャー	23-122-952
Hema 3 固定剤	Fisher	23-122-929
27½ ゲージ ツベルクリン注射器	Fisher	14-826-87
リチウム ヘパリン プラズマコレクター	Fisher	2675187
L 字型使い捨てスプレッダー	Lab Scientific	DSC
1x PBS、pH 7.4	社内で調製	n/a	蒸留水(5L)、NaCl(40g)、KCl(1g)、Na2HPO4(5.75g)、KH2PO4(1g)
	NH4Cl(4.145g)、KHCO3(0.5g)、EDTA(18.6mg)を社内で調製したACK溶解緩衝液、蒸留水およびpH7.4で最大500mlに