マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

Summary

いくつかの方法は、マウスにおける細菌性肺炎をモデル化するための文献に記載されています。ここで、我々は、中咽頭にピペット細菌接種の吸引（ すなわち 、吸入）を介して肺炎を誘導するための非侵襲性の、安価で迅速な方法を記載します。肺の先天性免疫応答を評価するための下流の方法も詳しく説明されています。

Abstract

市中肺炎は、主要な公衆衛生問題のままであるが、細菌性肺炎のマウスモデルは、最近、基礎となる細胞および分子病態の理解に重要な前臨床の進歩を促進した。 インビボのマウスモデルがで宿主防御応答の統合生理学と回復力をキャプチャ代替によって明らかにされていない方法は、ex vivoでのアプローチを簡素化。いくつかの方法が「ブラインド」と条件を可視化し、経皮的気管内挿管下エアロゾル、鼻腔内送達、経口気管内挿管を含むマウスにおける細菌の肺内接種のための文献に記載されています。すべてのメソッドは、相対的なメリットと制限があります。ここで、我々は、詳細には、マウスによって吸引（ すなわち 、吸入）含む細菌の気管内送達のための、非侵襲性の技術的、非集中、安価で、かつ迅速な方法を記載します一方、全身麻酔下咽頭内にピペット感染性接種物の。この方法は、非苛性生物・化学物質の多種多様の肺送達のために使用され、さらに肺の手順で最小限の経験と研究室のために、学ぶことは比較的容易であることができます。誤嚥性肺炎の方法を説明することに加えて、我々はまた、特に、in vivoでのマウスの肺の先天性免疫応答、後続をアッセイするためのステップバイステップの手順を提供し、細菌排除し、感染気道の細胞性免疫応答を定量する方法。肺炎の評価にこの統合とシンプルなアプローチは、肺先天性免疫の際に遺伝的および環境的操作の効果の迅速かつ堅牢に評価することができます。

Introduction

市中肺炎は、ワクチン接種の改善および抗生物質戦略^1,2にもかかわらず、過去40年間の死亡率にはほとんど全体的な変化で、米国での感染による死亡の主要な原因のまま。公衆衛生レベルでの知覚進歩性の欠如にもかかわらず、近年の飛躍的な進歩は、前方肺感染症のマウスモデルを使用することによって可能になったこれらのステップの多くは、肺炎の分子や細胞病因の我々の理解で行われています。マウスの遺伝的扱いやすさは、マウスおよびヒトの免疫システム、及び商業的に利用可能になっているネズミ標的免疫学的試薬の広大な配列の類似性は、一緒にフィールドの急速な進歩を促進しました。

文献に記載された細菌性肺炎のマウスモデルは、一般的に病原体接種のための4つの技術的な経路の1つに依存してきた：ⅰ）エアロゾル化。 ⅱ）INTRanasal配達; ⅲ）経口配信。およびiv）外科的気管内注入（ すなわち 、気管切開^）3。感染のすべてのルートは、長所と短所^3を持っています。口鼻内細菌叢、全身麻酔のための要件の混合物のための特定の、相対的な上気道の暴露、潜在的には、遠位の肺に送達接種材料、配信病原体の葉の分布、技術的専門知識の要件、および手続き罹患率の変動は、これらの全体に広く変化しますアプローチ。

一般的に使用される経口感染手法は「ブラインド」（非可視化）の手法のいずれかを経由して、ま....

Protocol

全ての実験は、NIEHSの動物実験委員会による審査の後に実験動物の愛護管理と使用上の動物福祉法と米国公衆衛生サービスポリシーに従って行われました。

K.の調製ニューモニエ文化

注意：バイオセーフティーレベル2（BSL2）フードまたは他のBSL2指定された領域内のすべてのステップを実行し、同研究所のBSL2ガイドラインあたりの廃棄物を捨てます。

1. K.のサスペンション成長のためニューモニエ 、バクテリアのグリセロールストックを解凍し、Kの1ミリリットルを転送することによって作業培養物に接種500ミリリットル以上のフラスコ中のトリプティックソイブロス（TSB）の50ミリリットルに肺炎連鎖球菌株 。
2. 培養した対数期Kの900μLを加えることによって、グリセロールストックを作りますニューモニエの滅菌グリセロールを100μlにし、-20℃または-80℃〜で凍結。長期保存のため、-80°Cを推奨します。
3. Sからの培養菌一夜フラスコを振とうすることによって1.1をTEP - 、200から225 rpm.In対数期の成長を促進するために、37℃で（14〜18時間）の午前中に50ミリリットルのTSBを含むフラスコに、この一晩培養1-5 m....

Results

C57BL / 6マウスを、K. 2000 CFUを感染させました肺への口腔咽頭吸引を経由してニューモニエ 43816（血清型2）。この用量では、マウスは通常、嗜眠、フリル毛皮、5〜10％の重量損失（ 図2A）を含む臨床症状12-24時間後に感染を示し始めます。 48~72時間後、感染内、マウスの多くは、典型的には、減少した活性を有する猫背姿勢の20％減量し、その結果の平均値が先行し、刺激に対する応答性を低下させる疾患及び病的状態の症状を示します。長い期間の研究は、Kの低用量を必要とするかもしれませんニューモニエ 。 Kの500 CFUの感染肺炎は、回復と体重増加は一日5-6（ 図2B）で始まると10〜15％の重量減少により特徴付けられる3-5 D感染後のピークより穏やかな病気をもたらします。体重を20％希の重量損失と、しばしば生存を予測しますLY回復に関連付けられています。

Discussion

細菌性肺炎のマウスモデルは、遺伝子ターゲティングでおよびin vivo生物学的および薬理学的な介入で提携し、肺の宿主防御応答に重要な洞察を提供しています。大きな進歩は、感染した空域^10,11に好中球の動員を支配するケモカインおよび接着分子の我々の理解に特になされてきた。肺炎のインビボのモデルを、細胞ベースまたは代替的なアプローチとは異なり、また、内分泌へのキーの洞察を提供してきました感染した肺と肝臓（急性期応答）などの他の臓器との間で発生する通信¹²および副腎（ストレスグルココルチコイド^）13。最後に、in vivoでの肺炎モデルによって明らかにされ、臨床的に重要かつ関連性の高いポイントが成功した病原体のクリアランスがホストの成功に等しいではないということです。多くの場合、過剰に豊富な免疫応答は、宿主の死につながる可能性がありでも成功した病原体のクリアランス^8,14の顔における過度のバイスタンダー肺損傷に起因。この指定された、病原体のクリアランス及び免疫応答の並列測定が一般的に最.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
肺炎桿菌、血清型 2	ATCC	43816
トリプシン大豆ブロス	ベクトン ディッケンソン	211825
エクセル セーフレット IV カテーテル、18 G x 1 1/4 インチ	クラフリン医療機器	MEDC-031122
ヘマ 3 ソリューション 1	フィッシャー	23-122-937
ヘマ 3 ソリューション 2	フィッシャー	23-122-952
Hema 3 固定剤	Fisher	23-122-929
27½ ゲージ ツベルクリン注射器	Fisher	14-826-87
リチウム ヘパリン プラズマコレクター	Fisher	2675187
L 字型使い捨てスプレッダー	Lab Scientific	DSC
1x PBS、pH 7.4	社内で調製	n/a	蒸留水(5L)、NaCl(40g)、KCl(1g)、Na2HPO4(5.75g)、KH2PO4(1g)
	NH4Cl(4.145g)、KHCO3(0.5g)、EDTA(18.6mg)を社内で調製したACK溶解緩衝液、蒸留水およびpH7.4で最大500mlに