方法論記事

イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

11K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/54511

⸱

2016年9月14日

 ,  , 
1Chemotaxis Signal Section, Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

この記事について

サマリー

視覚走化性アッセイは、走化性因子媒介方向の細胞遊走を制御する方法、真核細胞のより良い理解のために不可欠です。 1）リアルタイム、複数の走化性アッセイの高解像度の監視、および2）を同時に化学誘引物質勾配を可視化し、好中球様HL60細胞内シグナル伝達事象の時空間ダイナミクス：ここで、我々はのための詳細な方法について説明します。

要約

真核細胞は、走化性と呼ばれる細胞プロセスである化学誘引性勾配を感知し、それに向かって移動します。走化性は、胚形成、ニューロンパターン形成、がん細胞の転移、炎症部位への好中球の動員、モデル生物Dictyostelium discoideumの発生など、多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。真核細胞は、Gタンパク質共役受容体を使用して化学誘引物質を感知します。ビジュアル走化性アッセイは、真核細胞が化学誘引物質を介した細胞の方向性移動をどのように制御するかをより深く理解するために不可欠です。ここでは、1)複数の走化性アッセイのリアルタイムかつ高分解能モニタリング、および2)好中球様HL60細胞におけるシグナル伝達イベントの化学誘引剤勾配と時空間ダイナミクスの同時可視化のための詳細な方法について説明します。

概要

真核細胞は感知し、化学誘引物質勾配、走化性と呼ば細胞プロセス内のより高い濃度に向かって移動します。走化性は、胚発生1、ニューロンパターニング2、癌細胞の転移3、炎症4の部位への好中球の動員、およびモデル生物細胞性粘菌 5の開発など多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。一般に、真核細胞は、Gタンパク質共役型受容体5を使用して化学誘引物質を感知します。これらの受容体との化学誘引物質の係合は、次に、最終的に細胞遊走5-9を駆動するアクチン細胞骨格の時空間組織を調節する下流のシグナル伝達経路を活性化するヘテロ三量体Gタンパク質GαとGβγの分離を促進します。

細胞生物学者が開発し、走化を改善してきましたアッセイは、Gタンパク質共役受容体（GPCR）シグナル伝達仲介は、細胞遊走を向け方法調べることです。 Boydenチャンバーまたはトランスウェル遊走アッセイはボイデン10によって1960年に開発されました。アッセイは、微多孔膜によって分離された2つのウェル間の化学誘引物質化合物の勾配を作成することによって動作します。そのシンプルさと使いやすさは、それまでで最も広く使用されている走化性アッセイ作ります。しかし、細胞の移行プロセスを有効にしないアッセイが可視化されます。 Zigmond室は、ソース化学誘引物質11に向かって狭いくびれ全体でカバースリップ上の細胞移動の明確なイメージングを可能にする第1の視覚マイクロ流体デバイスです。ダン12とInsall 13は、修正されたとZigmondチャンバー走化性アッセイの高解像度と長期撮像能力を向上させました。そのため、流体の流れの高度に予測可能な、拡散支配的な特性のため、マイクロフルイディクスは、次の-generatiのためのソリューションを提供してきましたこのようなEZ-TAXIScan（セル移動度分析装置）などの走化性アッセイに。

傾斜の安定性を確保して、装置は6走化性アッセイを同時に行うことを可能にする（ 図1A）。上記の様々なチャンバアッセイにおいて生成された方向に固定勾配とは対照的に、ギュンターGerischによって開発された針又はマイクロピペットアッセイは、可動ソース14との勾配を生成します。アッセイでは、化学誘引物質は、安定した勾配を生成するために、可動マイクロピペットから放出されます。この針アッセイで、研究者らは、異なる細胞が根本的に異なる特性を持つ偽足を生成することがわかりました。蛍光顕微鏡を適用して、我々は15を通じて、その定量的な測定を容易にするために、勾配を可視化することができました。本研究では、同時に複数の走化性ASSAを監視し、走化性HL60（ヒト前骨髄球性白血病）細胞を調製するための詳細な方法について説明しますセル移動度分析装置、および可視、時空制御可能な化学誘引物質の刺激に応答して、このような単一生細胞におけるタンパク質キナーゼD1とシグナル伝達分子のGPCRが媒介する時空間的動態を可視化するとYS。私たちの高度な画像処理方法は、一般的な走化性の研究に適用され、そして哺乳動物細胞系に特に適していることができます。

プロトコル

1.文化と人間の分化好中球様HL60細胞

  1. 準備RPMI（ロズウェルパーク記念研究所）、RPMI 1640培地、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）、0.1mMのピルビン酸ナトリウムを含有する1640培地、及び25mMのHEPES（4-（2-ヒドロキシエチル）-1- -piperazineethanesulfonic酸）。 37°CまでRPMI 1640培地を温めます。
  2. 血球計数器を使用することで、細胞が対数増殖期の段階にあることを確認するHL60細胞の細胞密度を決定します。
    注：細胞は、継代後の第3日目の対数期であるのが普通です。対数期の細胞の密度は、通常、6~8×10 5細胞/ mlです。新しい培養を開始するために必要な細胞密度は、約1.5×10 5細胞/ mlです。
    注：例えば、T-75フラットフラスコ中で10 mlの新しい培養に、対数期の細胞の細胞密度は、その後、6×10 5細胞/ ml、対数期の細胞（2.5mlの6×10 5である場合）10 mは1.5×10 5細胞/ mlに希釈しリットル新しい文化。 10mLの培養物の最終容量を作成するために、たRPMI1640培地7.5mlを添加します。
  3. フラットフラスコに温かいRPMI 1640培地の計算されたボリュームを置きます。 T-75フラットフラスコ培養のために、細胞培養の全体積を10mlです。
  4. 1.5×10 5細胞/ mlの細胞密度に達するために平坦なフラスコに対数期成長HL60細胞の計算されたボリュームを追加します。
  5. 5％CO 2の加湿インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートします。
    注：HL60の倍加時間は、ほぼ24時間です。
  6. 継代RPMI 1640培地で細胞を2〜3日ごと。 HL60細胞の細胞密度が決して1.5×10 6細胞/ mlを超えず、セル流路がもはや2ヶ月以上続くことが重要です。
  7. 5日間の実験の前にHL60細胞を分化します。
    注：RPMI 1640分化培地に含まれているRPMI 1640培地、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）、0.1mMのピルビン酸ナトリウム、25mMのHEPES、1.3％ジメチルスルホキシド（DMSO）。言い換えれば、それは、RPMI1640培地中の1.3％のDMSOです。
    1. HL60細胞を区別するために、37°C​​までのRPMI1640培地を予め温めます。フラットフラスコに温かいRPMI 1640培地を追加します。
    2. DMSOは、急速に、RPMI1640培地によって希釈されるように、フラスコを旋回しながら、最終的な10 mlのHL60分化培養のために、平坦なフラスコに、RPMI1640培地に直接に130μlのDMSOを加えます。
    3. 最終的な10 mlのRPMI1640中の分化培地で1.5×10 5細胞/ mlの最終細胞密度に対数期のHL60細胞を加えます。 5日間、5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で培養したRPMI 1640中でHL60細胞は、分化培地。

2. 4well商工会議所のカバーガラスの表面をコーティング

  1. 、冷蔵庫から2％ゼラチンストック溶液のボトルを取り、70％エタノールでそれをきれいにし、フード内に配置します。 T1ミリリットルの2％ゼラチン原液AKEとすぐに冷蔵庫に残っているゼラチン原液を返します。
  2. ゼラチン溶液が完全に37℃で液化し、徹底的にピペットを許可します。 0.2％ゼラチンの最終濃度までバッファ9 mlの2％ゼラチンストック溶液の予熱した1×ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で希釈します。
  3. それぞれ、底部のカバーガラスで4ウェルチャンバーの2つの中間のウェルまたは1ウェルチャンバーにHBSSに0.5ミリリットルまたは2ミリリットル0.2％のゼラチンを追加します。液体が表面領域全体を覆うように、いくつかの方向にプレートを傾けます。
  4. 37℃のインキュベーターでプレートを置きます。プレートを1時間で使用できるようになります。彼らは、最大5日間使用することができます。ただ細胞を播種する前に、4ウェルまたは1ウェルチャンバーからゼラチン溶液を除去します。

3.走化性アッセイ用いた細胞モビリティ分析装置

  1. 準備し、RPMIで暖かいRPMI 1640飢え培地、0.1mMのピルビン酸ナトリウム（オプション）と25mMのHEPESを含む培地。
  2. 培地を飢えRPMI 1640中100 nMでのfMLP（N-ホルミル - ロイシル - フェニルアラニン）の100μlのを準備します。
  3. 1％ウシ血清アルブミン（BSA）/ 0.1％BSA / RPMI 1640培地の培地10 mlで飢餓RPMI 1640中の1％BSAを含有するRPMI 1640培地を3mlを準備します。
  4. コー​​ト22ミリメートルの正方形のカバースリップし、室温で1時間、新たに調製した1％BSA / RPMI 1640培地で5μmのセル移動度分析素子チップ。
  5. 以下の手順を使用して、ホルダーを組み立て：
    1. レバーは、ユーザーに向けて傾けることができるように垂直位置にあるレバーとホルダベースを置きます。 70％エタノール溶液41ミリメートルのガラスの表面に適用されます。慎重にそれらを傷つけないように注意しながら、ワイプで表面を拭いてください。
    2. ホルダベースに41ミリメートルのガラスを挿入します。ホルダベースで41ミリメートルのガラスの上に、BSAでコーティングした22ミリメートルの正方形カバーグラスを置きます。
      注：コーティングされた正方形のC41ミリメートルのガラスとチップ間のoverslipは走化性は、塗膜表面の基層上で発生することができます。
    3. ウエハハウジングの底部にOリング（小）を挿入し、背面にある楕円形の穴を持つホルダーベースにウェーハ収納をマウントします。位置にウェーハ収納をロックするために前方に水平位置にホルダーベースの内側のレベルを引き上げます。
    4. エアダスターでウエハハウジングの内部からほこりを飛ばし。ウェーハ収納に0.1％BSA / RPMI 1640培地の4ミリリットルを追加します。
    5. ガラスと接触して下方に構造的な顔をしたウェーハ収納の中心部にあるBSAでコーティングされた細胞の移動度分析素子チップをマウントします。
      注：チップは後方に位置合わせマーク（チップの上部の穴）に挿入する必要があること。
    6. 穴にゴム製のガスケット上の2つの突起を嵌合することにより、ウェハクランプの底部にゴムパッキンを貼り付けます。
    7. 上にOリング（大）をマウントウェーハ収納のトップ。後部にセンサー穴を有するウェハクランプをマウントします。代わりに、ウェハクランプをロックする水平位置に前方ハウジングベースの外側のレバーを引きます。
    8. ホルダーを組み立てた後、ウェル中に気泡がないことを確認するために、光ボックスのホルダーの底に置きます。気泡が検出された場合は、サンプルローディングチップを装着し提供プラスチック注射器を使用してそれらを削除します。
    9. カバーを外し、セル移動度分析装置ユニットの上部にプレート上にアセンブリを置きます。ホルダにセンサブロックを取り付けます。
  6. 走化性アッセイのためにHL60細胞を準備します。
    1. 血球計数器で分化したHL60細胞の細胞密度を計算します。分化の5日後、細胞密度は約1.0×10 6細胞/ mlです。
    2. 2×10 6細胞/ mlの最終細胞密度でHL60細胞の最終体積を計算します。例えば、細胞密度分化したHL60細胞を1.0×10 6細胞/ mlであり、次いで、分化したHL60細胞を10mlの2×10 6細胞/ mlに到達するために、0.1％BSA / RPMI 1640培地5mlで再懸濁されます。
    3. 遠心分離機は200でHL60細胞を分化しました 室温で5分間XG。上清を除去し、ステップ3.6.2において0.1％BSA / RPMI 1640培地の計算された量で細胞を再懸濁さ）2×10 6細胞/ mlの最終細胞密度に。
  7. 画像取得のための細胞の移動度分析装置ユニットとPCを起動します。本機とパソコンを接続します。セル移動度分析装置の電源をオンにします。 PCの電源をオンにします。
  8. セルモビリティ分析デバイスソフトウェアを起動します。
    1. カメラ、ヒーター、撮影、メモ、およびカメラ画像：5コントロールパネルを確認します。
    2. カメラ画像のコントロールパネルでは、カメラ画像パネルでカメラを中心にリアルタイムでホルダー/ビューの位置を調整する「水平線」または「縦線」を使用します。
    3. カメラコントロールパネルで、定義されたチャンネルにカメラを移動するために、CH6にCH1を選択します。チャネルの視野を中心に、カメラのX座標と水平方向にカメラの位置を中央調整する「Rの移動」「移動L」をクリックしますか。
    4. Y座標縦に画面を中央に画像を調整するための細胞移動度分析装置ユニットのフロントパネルに位置ノブを回してカメラのを調整します。
    5. ヒーターコントロールパネルで、39℃に37.0℃までの「ホルダーの一時」と「プレートの温度」​​に設定します。加熱を開始するには「熱」をクリックしてください。また、ホルダに接続された温度センサを使用して温度を制御する「ホルダー」をクリックします。
    6. 撮影パネルで、「間隔」で「15秒」との間隔のための「時間」は、「30分」と走化性アッセイの期間を入力します。チェックし、安全上の理由から、「撮影の最後にオフヒーター」。ドを指定保存された画像のためのstination。
    7. メモパネルに、そのような細胞株のような実験を入力詳細は、治療が適用されたかどうか、使用、および化学誘引物質の濃度は、適用しました。
    8. 実験に使用されるチャネルのすべての中心位置を確認し、必要に応じてすべてのチャンネルの調整を繰り返します。
  9. 下記のように細胞を注入し、揃えます：
    1. ホルダーからバッファを削除し、各チャンネルの上から第3ウェルからのバッファの8μLを取り出します。
    2. 細胞数を制御し、注入時に流れるように、リアルタイムで画面を監視しながら、同じチャンネルで第2のウェルへの細胞の2μLを注入するために注射器を使用してください。細胞がきれいに整列された後、すぐにバッファバックの8μlを添加します。他のチャンネル（ 図1B）に対して同じ手順を繰り返します。
  10. バックホルダーにバッファ、および1μlの100 nMのFMは追加2ミリリットルを追加します。上から第3ウェルにLP。画像の取得を開始し、データを保存します。ソフトウェア9をトレースした画像（ 図2）を用いて得られたデータを分析します。

エレクトロポレーション4.トランスフェクション

  1. 第1コート4ウェルまたは1ウェルチャンバーで説明したように第2の指示に従って5日間実験の前にHL60細胞を分化します。
  2. 準備し、37℃でRPMI 1640培地、20％（v / v）のFBS、0.1mMのピルビン酸ナトリウム、および25mM HEPESを含有する温かいたRPMI1640エレクトロ回収媒体。
  3. 右側のトランスフェクション実験を開始する前に、それぞれ、事前にコーティングされた4ウェルまたは1ウェルチャンバーのウェルに300μlあるいは3ミリリットルRPMI 1640培地のいずれかを追加します。
  4. 5％CO 2で加湿した37℃のインキュベーター中でチャンバーをインキュベートします。これらのチャンバは、直ちに使用するか、将来の使用のためのインキュベーター（2週間）に格納します。
  5. 分化したHL6の細胞密度をカウントし血球計数器で0細胞。
    注：細胞密度は、多くの場合、約1.0×10 6細胞/ mlに達しました。 3.0×10 6細胞/ mlより高い細胞密度は、通常、望ましくないトランスフェクション効率を与えます。 HL60細胞は浮遊細胞であるため、全く再懸濁する必要はありません。
  6. 200で細胞を遠心分離 室温で5分間XG。上清を除去し、トランスフェクション試薬を100μlの2×10 6 HL60細胞を再懸濁。
  7. 細胞およびトランスフェクション試薬100μlの混合物にGFP-PKD1プラスミド9の4μgのを加え、穏やかにし、十分に混合します。提供キュベットに混合物を追加します。
  8. ヒト白血球細胞株については、製造元の事前設定されたプログラムを選択し、エレクトロポレーションを行います。
    注意：より詳細な情報については、製造元のWebサイトから入手可能です。
  9. エレクトロポレーション後、すぐに、穏やかに細胞に予め温めておいた500μlのRPMI 6140エレクトロポレーション回復培地を追加し、静かに提供するプラスチック製のピペットで1.6ミリリットルチューブにキュベットから細胞を移します。
  10. 5％CO 2で加湿した37℃のインキュベーター中で30分間、細胞をインキュベートします。 4ウェルまたは1ウェルチャンバーの1つのウェルにシード100μlあるいは細胞を500μl、それぞれ。
  11. それぞれ、4ウェルまたは1ウェルチャンバーの同じウェルに1 mlまたは4 mlの最終体積にしたRPMI1640培地を加えます。 3時間、5％CO 2で加湿した37℃のインキュベーター中で細胞をインキュベートします。 37°Cにプリ暖かいRPMI 1640飢え培地。
  12. 1ミリリットルピペットを用いて、静かにそれぞれ、4ウェルチャンバーのウェルまたは1ウェルチャンバーからRPMI 1640培地の0.8ミリリットルまたは3ミリリットルを削除します。穏やかなおよびHL60細胞を付着離れて吸引を避けます。
    注：HL60細胞が成長し、懸濁媒体中で区別されます。差別化された後、または特定の治療と、HL60細胞は、ポリリジン、コラーゲン、ゼラチン、ま​​たはFi接続でコーティングされた基層に接着しますフィブロネクチン。
  13. それぞれ、4ウェルまたは1ウェルチャンバーのウェルに培地を飢え0.8ミリリットルまたはRPMI 1640の3ミリリットルを追加します。 1時間待ちます。
    注：この時点で、細胞は、イメージング実験9の準備ができています。

5.マルチチャネル蛍光顕微鏡によりPKD1のGPCRが媒介する膜トランスロケーションを監視

  1. 刺激等の媒体を飢えRPMI 1640中100 nMでのfMLPとを1μg/ mlのAlexaの594の新鮮な混合物を準備します。
    注：fMLPのおよびAlexa 594ニーズの混合物を新たに最大の効果を保証するために行われます。
  2. マウント1 4ウェルチャンバーは、40X油レンズの上に細胞を播種しました。
  3. 下記のようにマルチチャンネル構成で、蛍光顕微鏡を設定します。
    1. 付着したHL60細胞を同定するための化学誘引物質fMLPのためのGFPタグPKD1、赤色発光チャネル（580から620 nm）を（アレクサ594）用の緑色発光チャネル（500から530ナノメートル）、および透過光チャネルを設定します。
    2. 「ライブ」の取得を開始し、3つのチャネルの取得条件を最適化します：
    3. イメージングの長い期間のための光退色を最小限に抑えるために、すべての3つのチャネルのための強度とレーザパワーと微調整。
    4. 必要であれば、画像の質の向上のためのバックグラウンドノイズ比を減少させる毎に2〜4フレームを平均化します。 1秒間隔を使用してください。
  4. GFPおよびDIC（微分干渉コントラスト）チャネルの観点から強いPKD1-GFPを発現する細胞を接着させるための検索。付着した細胞は、形態学的に平坦であり、急速に移動しません。
  5. 高いGFP-PKD1を発現するHL60細胞の接着識別した後、長期的画像化（ 図3A）のための光退色を減少させるために、各チャンネルのための検出器利得を増加させながらレーザパワーを低下させることによって取得条件を最適化します。
  6. 200μlのピペッターでのfMLP /アレクサ594溶液100μlを取り、脇に置きます。 「タイムラプス取得」を選択し、に間隔を設定します2秒、フレーム数は100に取得します。
    注：間隔と取得するフレームの数は、実験の目的に依存します。 1~2秒間隔と100のフレームは、多くの場合、 図3に示すように、画像化実験のために使用されている。ゆっくりと細胞を移行するために、より長い間隔が長期的画像化のために必要です。対照的に、迅速に細胞を移行するため、短い間隔は、細胞移動の連続的な詳細を観察するために必要とされます。
  7. チャンバーの位置が変更されないように慎重に4ウェルチャンバーの蓋を取ります。すぐに取得を開始し、ガイドとしてのレーザ光のスポットを用いて、細胞上に直接200μlのピペッターを位置決めしながら非刺激細胞の3-5画像を取得します。
  8. タイムラプス買収の完全なセットを流れて終了しても、迅速かつで撮像されているセル上のfMLP /アレクサ594混合物をピペット。さらに、データ分析に供されるデータに名前を付けて保存します。

    9. 可視および制御可能な化学誘引物質刺激6.イメージングChemotaxing細胞

    1. 10μlのマイクロピペッターと注入のヒントを使用して、たてのfMLPとAlexa594の混合物を調製した30μlのマイクロピペットを埋め戻します。
    2. 顕微鏡ステージの上に取り付けられたマイクロピペットホルダーにマイクロピペットを取り付け、圧力供給装置、着実な勾配を生成するために、マイクロピペットからのfMLP / Alexa594ソリューションを解放するために一定の圧力を提供する装置にチューブを接続します。
    3. 圧力供給をオンにして、70ヘクトパスカルに補償圧力（PC）を設定します。
    4. 共焦点顕微鏡またはそれと同等の蛍光顕微鏡上の40X油レンズの上にPKD1-GFPを発現するHL60細胞を播種1ウェルのチャンバーカバースリップをマウントします。
    5. 次の設定でチャネルモードでの設定取得：GFPタグPKD1のための緑のチャンネル（500から530ナノメートル）。化学誘引物質fMLPで（Alexa594）のための赤チャネル（580から620ナノメートル）。そして、トランス付着したHL60細胞を同定するための光チャネルをmitted。
    6. 「ライブ」の取得を開始し、3つのチャンネルの取得条件を最適化：イメージングデータの定量分析のために、各チャネルの強度を調整します。すべての3つのチャネルについての強度とレーザパワーとの間の微調整は、最高品質の画像を取得し、光漂白剤を最小限にします。必要であれば、より良い画質ごと2~4フレーム平均します。我々は通常1秒間隔を使用します。
    7. 「ライブ」の取得を開始し、GFPと透過光チャネルの観点から強いPKD1-GFPを発現する細胞を接着させるために検索します。 fMLPの勾配を可視化するために、明視野光学系、センタービュー（ 図4A）の中心分野でマイクロピペットを使用し、PKD1-GFPを発現する接着HL60細胞。
    8. タイムラプス取得を選択して、2秒間隔と100に取得するフレーム数に間隔を設定します。
      注：各トンを収集した後IME-経過シリーズ、名、さらにデータ分析に供されるデータを保存します。

結果

細胞移動度分析装置を使用して複数のHL60細胞の走化性の同時イメージング

マイクロ流体16の原理に基づいて、製造業者は勾配のシミュレートされたプロファイルを提供した：勾配は、1分以内に生成された5分以内に安定化し、そして2時間にわたって維持されます。マイクロ流体工学により生成された安定した勾配の高度に予測可能なプロファイルが複数走化性アッセイを同時に行うことを可能にします。本研究では、我々は3同時走化性アッセイ（ 図2Aおよびムービー1）を観察しました。私たちは、HL60細胞が化学誘引物質は、化学誘引物質のウェルに注入した直後のchemotaxing開始したことを発見し、勾配の安定性のためのシミュレーション結果と一致し、次の60分間の直線路でchemotaxing続けました。移動経路および形態をトレース細胞の定量的測定および細胞（ 図2B）の合計のパスの長さ、速度、方向、および丸みを含み走化性インデックスを使用して、走化性行動のその後の比較を可能にします。総経路長は、パスの重心を結ぶ線分の長さの合計です。速度は、時間の総経路長を分割することにより得られます。総経路長さで割っ（Yパスの最後の座標マイナスYは最初の座標）方向が上向きに測定されると定義されます。これは、上方への直接移動物体のために1.0を提供します。セルの真円度は、周囲の所定量が領域を囲む方法を効率的に（パーセント）尺度です。円は、任意の周囲の最大面積を有しており、100％の真円度パラメータがあります。直線領域はありませんし、0％の真円度パラメータがあります。選択された走化性パラメータにより記載されているように我々は、定量的に測定走化性挙動を示します（ 図2C）。

時空間可視および制御可能なのfMLP刺激下HL60細胞におけるPKD細胞内局在を監視

実験系に蛍光標識し、制御可能な化学誘引刺激を適用するための大きな技術的進歩です。歴史的に、我々は細胞応答や行動を観察するために、均質な（とも呼ばれる均一な）刺激または勾配刺激のいずれかを適用しています。しかし、「ブラインド」刺激は、刺激が細胞に到達する方法には、時空間情報を提供していないだけでなく、私たちは刺激が表示されていないという理由だけで、刺激に対する細胞応答のいずれかの「異常」の観測に疑問を投げかけます。我々は以前に、蛍光色素（Alexa594）は、化学誘引物質濃度とMとの間の線形関係を確立するために化学誘引物質を適用することができることを示しています蛍光色素の強度15を onitored。緑色蛍光タンパク質（GFP）、蛍光色素（Alexa594）、透過光の赤色発光の収集構成により、我々は、付着細胞、刺激の適用、及び刺激に対する細胞応答をモニターすることができる（ 図図3（a））。プロテインキナーゼDは、有向細胞遊走9,17に重要な役割を果たしているセリン/スレオニンキナーゼのファミリーです。均一に塗布fMLPで（赤）刺激に応答して、HL60細胞は、GFPタグ化タンパク質キナーゼD1（緑）（ 図3Bおよびムービー2）の強固な膜移行を仲介します。 fMLPの勾配（赤）（ 図4A）では、HL60細胞が活発にリーディングエッジ（ 図4Bおよびムービー3）にPKD1を募集します。リーディングエッジの突起におけるGFPの細胞内局在の密接な比較は（PKD1は、前縁の後部に局在することを示しています図4C）。

figure-results-1
図1.セル移動度分析装置は、6同時走化性アッセイまで使用できます。（A）スキームは、6つの独立した走化性アッセイの同時モニタリングのための細胞移動度分析装置のチップの設計を示 ​​します。レッドは、化学誘引物質をウェルに加え示しています。細胞のウェルに（B）HL60細胞の導入化学誘引物質が定常のfMLP勾配を確立するために拡散している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-2
HL60細胞を用いた複数の走化性アッセイの図2.同時モニタリング。（ ）モンタージュngのは、細胞の移動度分析装置は勾配の適用後に0と12分の時間で走化性に対するPKD特異的阻害剤の阻害効果を調べるために走化性アッセイの画像を示しています。走化性HL60細胞を、30分間、PKD阻害剤1μMのCID755673で前処理しました。 PKD阻害剤の治療を伴うまたは伴わないHL60細胞をRPMI1640飢え培地または12分間100 nMでのfMLP勾配のいずれかに走化させました。 （B）方式は、トレースHL60細胞の移動経路の長さと形態を示します。総経路長さ、速度、方向、及び真円度などの走化性の（C）定量。 SDが示されている平均±。 n = CID755673処理と無勾配、fMLPの勾配CID755673処理なし、とのfMLPの治療のための10、12、または11、それぞれ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

キープtogether.withinページfigure-results-3
均一に塗布fMLPの刺激に応答して、PKD1の図3. GPCR媒介強固な膜移行。PKD1-GFP（緑色）の（A）マルチチャンネルのモニタリング、化学誘引物質（1μMのfMLPは赤を0.1μg/ mlの蛍光色素アレクサ594と混合） RPMI 1640培地中の0.2％ゼラチンでコーティングした4wellチャンバーのウェルに付着HL60細胞を同定するため、およびDIC（微分干渉コントラスト）。 =10μmのスケールバー。 （B）モンタージュは均一に塗布fMLPの（赤）PKD1-GFP（緑色）の強固な膜移行を誘導することを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-4
FigurHL60細胞をchemotaxingにおけるPKD1の電子4.リーディングエッジローカライズ。（A）チャンネルモード取得設定はfMLPの勾配とPKD1の時空間ダイナミクスの可視化を容易にします。で- C、HL60細胞を一過GFPタグPKD1を発現しました。マイクロピペット（DIC）、100 nMのfMLPで（レッド）から生成されたのfMLP勾配を可視化するためには0.1μg/ mlの蛍光色素アレクサ594（B）chemotaxing細胞の先端のPKD1の濃縮された局在と混合しました。 =10μmのスケールバー。 （C）合併画像 ​​はPKD1はHL60細胞における最先端の後部に局在することを示しています。グリーンはPKD1細胞内局在を示しており、DIC画像は、前縁の突出領域を示しています。スケールバー=5μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

本研究では、我々は、走化性アッセイの二つの例を示す：細胞移動度分析装置による複数の走化性アッセイの最初の、同時モニタリングを。第二に、化学誘引物質勾配の可視化とリアルタイムで同じ細胞内シグナル伝達事象の時空間ダイナミクス。

複数の同時走化性アッセイのための細胞移動度分析装置

本研究では、細胞移動度分析装置を用いて複数の同時走化性アッセイを実行するための詳細なプロトコルを導入しました。このデバイスは、ユーザは、従来の明視野観察では10倍の対物レンズで細胞走化性の挙動を観察することができます。なぜなら、流体の流れの拡散支配的特性を、細胞移動度分析装置は非常に予測可能な、安定した勾配を生成し、同時に実施される6走化性アッセイまで可能にします。プロトコルの重要なステップがあります信頼性の勾配を得るために、テラスライン上のセルを配置します。ユーザーは、厳密にホルダアセンブリおよび化学誘引物質と細胞を注入するための製造元の指示に従ってください。詳細な手順については、オンラインでもご利用いただけます。代替走化性方法11-13,15と比較して、このデバイスは、著しく走化性アッセイの信頼性と効率を向上させます。サイズのセルの移動度分析装置チップの4つのサイズは4、5、6、8ミクロンの異なるタイプ、細胞の大きさを収容するのに利用可能です。我々は、4または5μmの細胞移動度分析装置チップHL60およびDに適していることが見出さ直径約10〜15ミクロンであるdiscoideumの細胞 。しかし、1つの制限は、この装置は、セルの全てのタイプに適していないということです。我々は、Raw267.4細胞と細胞移動度分析装置走化性アッセイを使用してほとんど成功していました。その理由は、Raw267.4細胞があまりにもゆっくりと移行している可能性があります。効率的なチェために必要な時間Raw267.4細胞のmotaxisは勾配がデバイスによって維持されている時間よりもはるかに長くなる可能性があります。代わりに、トランスウェル遊走アッセイは、Raw267.4細胞9のためによく働きました。別の制限は、蛍光観察は、現在の装置では不可能であるということです。今後の方向性は、より高い倍率で蛍光イメージングを監視することです。これは、蛍光検出および100倍の対物レンズを備えている改善された細胞の移動度分析装置を用いて可能です。また、同時に多数のアッセイはまた、すべてのこれらの改善は、走化性アッセイの増強能力、細胞の移行における細胞内動態の観察を容易に12に増加します。

HL60細胞の高いトランスフェクション効率は、蛍光タンパク質タグ化タンパク質を発現します

HL60細胞は活発に分裂白血病細胞株であり、懸濁液中で増殖します。以前18-20に報告されたように、HL60細胞は、Gに耐性でありますエン転送。脂質及びエレクトロポレーション、遺伝子転写の両方がテストされている、およびエレクトロポレーションが原因でエレクトロポレーションに起因する深刻な損傷の高いトランスフェクション効率を得るために重要である後に高い生存率を取得部4で詳細に説明するように、より高いトランスフェクション効率は、エレクトロポレーションを用いて得ました。続いて、徹底した穏やかな細胞処理は、特にエレクトロポレーション後、必要とされます。すべてのメディアは、予め温め、ゆっくりとエレクトロポレーション後の任意の段階で細胞に添加しなければなりません。また、エレクトロポレーション試薬への細胞の暴露時間を最小限に抑えることが重要です。細胞死を回避するために、エレクトロポレーション後、RPMI1640培地エレクトロ回復培地は直ちに細胞に添加されなければなりません。我々は、回復培地中20％FBS、10％FBSよりもはるかに高い細胞回収率を与えることを見出しました。エレクトロポレーション後、30分間のRPMI1640エレクトロ回復培地でのインキュベーションは、より高い生存率およびトランスフェクションのために重要です効率。さらに、トランスフェクション効率を高めるために、我々はまた、製造業者が推奨するプラスミドのほぼ二倍の量は、トランスフェクションあたり4μgのプラスミドDNAを使用しました。

タンパク質発現の仮初と細胞数の制限（トランスフェクションあたり2×10 6細胞）：エレクトロポレーショントランスフェクション上の2つの主要な制限があります。ベクタープラスミドは、各細胞分裂の後半分に希釈されるの​​で、未分化細胞においては、発現は、唯一の細胞分裂の最初のカップルの間に検出可能です。分化したHL60細胞には48を超える時間を生き残るありません。その結果、いずれの実験では、新鮮なトランスフェクションを、実験前に6時間を必要とします。 1エレクトロポレーション用の細胞数は、単に任意の生化学的アッセイのための最小要件を満たしています。繰り返し使用や大量の目的のために、強く、未分化のHL60細胞株を安定的に目的のタンパク質を発現することを確立することをお勧めしますWHIウイルスベクターが利用可能であるか、または構築することができる場合はchが、ウイルスベクターにより蛍光タンパク質でタグ付けされています。

開示事項

著者らは、この研究に対して競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業はNIAIDの学内基金、NIHによってサポートされています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMI 1640 ミディアム GlutaMAXライフテクノロジー61870-036
ピルビン酸ナトリウムサーモフィッシャー Scietific11360-070
ウシ胎児血清ジェミニ バイオプロダクツ100-106
1 M HEPES 滅菌溶液、pH 7.3Quality Biological Inc.A611-J848-06
ペニシリンストレプトマイシン溶液フィッシャーサイエンティフィック15140122
NucleofectorTM 2bロンザAAB-1001
AmaxaTM 細胞株 NucleofectorTMキットVを含むNucleofectorTM溶液、シングル用ピペット、AmaxaTM認定100mlアルミニウムを含む電極キュベットロンザVCA-1003
Lab-Tek chambered #1.0 ホウケイ酸カバーガラスNalge Nunc International Inc155383
2% ゼラチン溶液Sigma-AldrichG1393
フィブロネクチンSigma-AldrichF1141
HBSS (Hanks'Balanced Salt Solution)Life technologies14025-076
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA3803
シングルウェル Lab-Tek II カバーガラスチャンバーNalge Nunc International Inc155361 Four-well
Lab-Tek II カバーガラスチャンバーNalge Nunc International Inc155383
Alexa 594サーモフィッシャーサイエンティフィックA-10438
fMLPSigma -AldrichF3506-5MG
カバーガラス厚 (2) 22 mm x 22 mmCorning2855-22
EZ-TAXIScan EffectorCell Institute, Inc.MIC-1001
EZ-TAXIScanチップ(5mm)株式会社エフェクターセル研究所EZT-F01-5
1701RN 10 μl シリンジハミルトン80030
フェムトチップ II インジェクションチップエッペンドルフ5242956003
フェムトチップス IIエッペンドルフ930000043
TransferMan NK2、モーターモジュール、角度調整器付きXヘッド、位置決め補助具を含む。 エッペンドルフ5188900056
DIASソフトウェアソルテック株式会社
LSM 780 META または同等の共焦点顕微鏡と 40X 1.3 NA または 60X 1.4 NA オイル DIC Plan-Neofluar 対物レンズCarl Zeiss

参考文献

  1. Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).
  2. Wen, Z., Zheng, J. Q. Directional guidance of nerve growth cones. Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).
  3. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  4. Zigmond, S. H. Chemotaxis by polymorphonuclear leukocytes. The Journal of cell biology. 77, 269-287 (1978).
  5. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  6. Dong, X., et al. P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils. Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).
  7. Li, Z., et al. Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42. Cell. 114, 215-227 (2003).
  8. Van Haastert, P. J., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nature reviews: Molecular cell biology. 5, 626-634 (2004).
  9. Xu, X., et al. GPCR-Mediated PLCbetagamma/PKCbeta/PKD Signaling Pathway Regulates the Cofilin Phosphatase Slingshot 2 in Neutrophil Chemotaxis. Mol Biol Cell. , (2015).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of experimental medicine. 115, 453-466 (1962).
  11. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).
  12. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).
  13. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PloS one. 5, e15309(2010).
  14. Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis. Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).
  15. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  16. Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4, 164-167 (2004).
  17. Eiseler, T., et al. Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot. Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).
  18. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).
  19. Schakowski, F., et al. Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines. Genet Vaccines Ther. 2, 1(2004).
  20. Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells. Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).

再版と許可

タグ

走化性アッセイGタンパク質共役受容体マイクロフルイディクス細胞遊走蛍光色素キナーゼ移行リアルタイムイメージング細胞運動能解析勾配可視化
イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。