心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

サマリー

この原稿は、成体マウスや、解剖などの筋肉のその後の操作、凍結、切断、ルーチン染色、および筋線維断面積の解析における急性骨格筋再生を誘導するための詳細なプロトコルを記述します。

要約

骨格筋再生は、損傷または疾患に応じて、成人骨格筋に発生する生理学的プロセスです。急性損傷誘導骨格筋再生は筋肉の再生に関与するイベントだけでなく、メカニズムと異なる選手を研究するために広く使用されている、強力なモデル系です。実際には、このプロセスの詳細な知識は、骨格筋の変性につながる病的状態をより良く理解するために不可欠であり、それは新たな標的治療戦略を同定するのに役立ちます。本研究は、心臓毒の単回筋肉内注射（CTX）を介して、マウスにおける急性骨格筋再生を誘導するための詳細と再現性のプロトコルについて説明します。 CTXは、ヘビ毒毒素のファミリーに属し、最終的には再生イベントをトリガ筋線維の筋変性を引き起こします。骨格筋再生のダイナミクスは、筋肉切片の組織学的分析によって評価されます。また、プロトコル、解剖凍結、および前脛骨筋だけでなく、広くその後の形態学的および形態計測分析のために使用されるルーチンのヘマトキシリン＆エオシン染色を切断するための実験手順を示しています。

概要

哺乳類の成体の骨格筋が収縮するために特化して多核筋細胞（筋線維）のfasciculesのグループによって形成されています。各筋線維は、筋細胞膜（原形質膜）に囲まれた、細長い合胞体であり、定期的に繰り返し編成収縮タンパク質（アクチンとミオシンフィラメント）で構成されている筋原繊維を含みます。大人の生活の中で、および休止状態で、骨格筋は、彼らの筋核¹の非常に低い離職率を持っています。確かに、筋線維の周囲に位置している筋核は、筋細胞膜の下で、細胞周期のG0期で停止し^、1,2を増殖することはできませんされています。

骨格筋は、互いに緊密に関連している組織リモデリングのいくつかのイベントの後ホメオスタシスに達し、次のダメージを再生する独特の能力を有します。急性損傷または外傷後、変性は、誘導される再生過程が続きますすなわち、筋細胞、衛星細胞（SCS）の居住集団を含む異なる細胞集団を含みます。実際、任意の環境刺激の非存在下では、衛星細胞は静止状態にあり、筋細胞膜と基底板^3,4の間に特殊なニッチに位置しています。怪我や病気に続いて、SCが、活性化、増殖、損傷領域に移行し、最終的に分化し、新たに筋線維^5を形成を生じます。活性化のSCは、異なる細胞集団で外傷^6-8のサイトで募集されている主に炎症細胞を、クロストークを確立します。このクロストークは、細胞が分子シグナルが最終的ホメオスタシス....

プロトコル

すべての実験は動物研究のための施設のガイドラインに厳密に従って行われ、動物実験に関する法律に従って公衆衛生、動物衛生、栄養と健康のイタリア省の食品安全省によって承認されました。頸椎脱臼手順はIACUCまたはそれと同等の要件に基づいて機関から機関に異なる場合があります。

前脛骨筋1.心臓毒注射

1. 手順を開始する前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中または水中で心臓毒原液を希釈することにより、心臓毒（CTX）の溶液を作業10μMのを準備します。
   注：CTXを1mg / mLで水に可溶です。 70μMストック溶液を準備します。 -20℃で小分けし、店舗。 CTXは、このプロトコルのために使用される約7,000ダの分子量を有する心臓毒の混合物です。
   注意：着用することが示唆されています二重手袋、衛生マスク、安全メガネは、希釈した場合でも、その溶液との接触を避けるために非常に注意する（あるいは安全メガネには、フードの下で作業することが推奨されます）。
2. ケタミンおよびキシラジン（80 mgの/ kg及び10mgの体重の/ kg）または他の承認された利用可能な麻酔薬の腹腔内注射によってマウスを麻酔。
3. マウス面を上にして、70％エタノールで後肢をスプレー。前脛骨（TA）筋の正確な場所を視覚化するために、メスの助けを借りて、膝の下で、下肢の前方部分に離れて髪を切ります。
   ....

結果

H＆E染色は、骨格筋の再生中に特定の時点で再生プロセスの形態の評価が可能になります。 図3は 、野生型マウスの負傷したTA筋肉に行っ時間経過解析を示します。 図3Aに図式として筋肉は、CTXの注射後3、7、15、30日目に単離されています。 H＆E染色した横断面の代表的な写真が（ 図3B-E）は、時間の経過骨格筋修復のダイナミクスを示しています。損傷後3日目に、筋肉の構造的なアーキテクチャは完全に破壊され、両方が筋線維（壊死領域）と単核細胞を縮退される（ 図3B）はっきりと見えます。この細胞の不均一な群は、主に一過性増幅衛星細胞（筋芽細胞）、血液¹¹から募集炎症細胞、およびパルティ間質および内皮細胞で構成されてい損傷部位でトリガされる再生工程、にcipate。この文脈において、新しい再生筋線維の融合および筋芽細胞の分化によって生成されます。再生エリアの主な特徴は、中央に位置する核と暗い染色細胞質（ .......

ディスカッション

ここでは、骨格筋（ すなわち、CTXの筋肉注射）での急性損傷を誘導するためのプロトコルを記述します。これは、 インビボでの骨格筋再生のダイナミクスを研究するための強力なツールとして広く用いられています。 CTX注入は筋細胞膜の脱分極および繊維¹²の収縮によって引き起こされる筋線維の変性を誘導し、筋肉の再生につながる事象のカスケードを誘発します。骨格筋は、実験の要件に応じて、注射および損傷後の所望の時点で解剖し、およびその後の組織学的分析のために使用されます。切開し、筋肉のいずれか凍結保護培地中に封入した後、凍結またはパラフィン中に含めることができます。しかしながら、これらの手順は、成果物を生成することができ、最終的にその後の分析に影響を与える可能性がパラホルムアルデヒドで予め固定のステップを必要とします。直接組織を凍結することで、この問題を防ぐことができます。注目すべきは、多くの一次抗体は、この手順は、より信頼性を向上させ、新鮮凍結筋肉切片^13、排他的にまたは効率的に作業を行います。形態計測分析は、通常、同じ年齢のマウスのグループ間の再生過程における差異の評.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カルジオトキシンから Naja mossambica mossambica	SIGMA ALDRICH	C9759
シリンジ インスリン用 BD Micro-Fine+ 針 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL	BD	324826
Tragacanth Gum	MP BIOMEDICALS,LLC
2-メチルブタン (イソペンタン)	SIGMA ALDRICH	78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat	Bio-optica	05-9801
フェザーミクロトームブレード S35	バイオオプティカ	01-S35
スライドガラス スーパーフロスト プラス	Menzel-GLäser	09-OPLUS
デュモン #5 鏡面鉗子	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	11251-23
はさみ ストレートシャープ/シャープ	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15024-10
はさみ Noyes ストレート	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15012-12
ファインアイリスはさみ ストレートシャープ/シャープ 10.5 cm	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	14094-11
Eukitt	Bio-optica	09-00100
スライドカバースリップ	バイオシグマ	VBS651
キシレン	シグマ アルドリッチ	214736
エタノール 100%	シグマ-アルドリッチ	02860-2.5L
ヘマトキシリン	J.T. ベイカー	3873
エオシン	シグマ アルドリッチ	HT110116
クライオスタット	ライカ	CM3050 S

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