ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定

Summary

ここでは、光親和性標識を使用して低分子結合タンパク質を同定する方法を説明します。この技術の利点は、標的タンパク質の結合および共有結合標識が生細胞環境内で行われるため、細胞溶解時に天然タンパク質の構造および結合条件を破壊するリスクが排除されることです。

Abstract

低分子の分子標的を特定することは、その作用機序を理解するための挑戦的ですが、必要なステップです。さまざまな低分子の結合タンパク質を成功裏に解明するために、いくつかの標的同定法が開発され、使用されてきましたが、これらの手法には欠点があり、特定の種類の低分子-標的相互作用の検出には適していません。特に、細胞溶解によって構造が乱される可能性のある膜タンパク質の相互作用など、天然の細胞条件に依存する非共有結合性相互作用は、アフィニティーベースのターゲット同定法に適していないことがよくあります。ここでは、光不安定性基を含むプローブを用いて、生細胞の環境内で低分子結合タンパク質に共有結合的に架橋し、細胞溶解後の相互作用の維持を必要とせずに標的タンパク質を検出・単離する方法を実演します。この手法は、メカニズムが不明な生物学的に興味深い小分子を研究するための貴重なツールであり、基礎生物学と創薬の両方の文脈で研究できます。

Introduction

生物活性小分子は、基本的に、細胞内で相互作用し、1つ以上の「標的」分子は、最も一般的にタンパク質の機能を変化させることにより動作します。活性化合物は、表現型スクリーニングによって発見されたときに薬物の発見では、その化合物の分子標​​的（複数可）の同定は作用機序および化合物の潜在的な副作用を理解するためだけでなく、潜在的に発見するためだけではなく、非常に重要です新しい生物学疾患モデルの基礎となると治療¹の新たな機構的なクラスの開発のための道を開きます。標的の同定は、治療に使用する薬剤のために必要とされていないが、近年では、検証対象が既知であれば、新規薬剤候補は、臨床試験に成功し、そのための投資でより良いリターンをもたらす可能性がより高いことを増加の認識がありました^2。したがって、小さな同定するための方法に関心がありました分子標的タンパク質。

古典的な標的の同定実験は、典型的には、対象の小分子は、樹脂上に固定化され、非結合タンパク質が洗い流され、残りのタンパク質が溶出し^、3を識別された後、全細胞溶解物とともにインキュベートされるアフィニティー精製に依存しています。この技術は、多くの小分子⁴の標的を同定するために使用されているが、それはいくつかの理由のためにユニバーサルターゲットID方式としては不向きです。まず、標的タンパク質は、小分子に結合する能力を保持するために、細胞溶解の際に、その天然のコ....

Protocol

注：このプロトコルは、生細胞での使用のためにマッキノンとトーントン¹⁰から適応されました。

培養細胞の調製

1. （下記参照）を所望のサンプル数のための無菌6 cmの細胞培養皿を準備します。
   注：細胞の一皿は、処理条件ごとに使用され、より多くのタンパク質が必要な場合は2または3皿を条件ごとに調製し、UV照射後に組み合わせることができます。
   1. 細胞の少なくとも3皿を準備し; DMSOのみ（D）、プローブ処理のみ（P）、およびプローブ+競合物（C）と陰性対照。
   2. 必要に応じて、プローブで処理されたが、UV光にさらされないべきなしUVコントロールとして4 ^番目の皿を、準備します。
      注：複数の競合分子は、このような関心の小分子の異なる類似体として、試験する場合は、必要に応じて追加の競合プレートを準備します。
2. 4mlの培地で培養皿にHEK293T細胞を加えます。 350万Cを使用しますプレート当たりells。
   注：細胞は、実験の開始時に、ほぼ100％コンフルエントになるように細胞数が最大タンパク質収量を達成するために、各細胞型のために決定されるべきです。 HUVECは、プレート0.3万個の細胞を使用しています。良い近似がコンフルエント15cmの皿に細胞の1/10です。 HEK293T細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地で培養す....

Results

ここに示す結果は、抗真菌薬のイトラコナゾールの光親和性プローブ、以前に^16を公表されたを使用して得ました。これらの結果は、正常に35 kDaの膜タンパク質電位依存性陰イオンチャネル1（VDAC1）などの主要なイトラコナゾール結合タンパク質を同定するための生細胞光親和性標識技術の使用を実証します。

上記のプロトコルは、競合分子として光標識および非修飾イトラコナゾールためのイトラコナゾールのプローブを用いてHEK293T細胞で行いました。記載されるように試料を調製した後、それらは分子量によってタンパク質を分離するために、SDS-PAGEに供しました。左側の分子量マーカー単位はキロダルトン（kDaの）です。最初のレーンは、DMSOコントロール試料（D）であり、第二のレーンは、プローブ試料（P）であり、第3レーンは競合サンプル（C）です。バンドのpDMSOのみのレーンに憤慨背景と考えられています。結合タンパク質、その特定の点に注意してくだ.......

Discussion

薬剤の細胞表現型は、それらの既知の機能に基づいて、その潜在的なターゲットを絞り込むために使用されるトップダウン、またはボトムアップ、ターゲット：小分子の標的を同定するために、異なるアプローチは、大きく二つのカテゴリーに分類することができます化学的または遺伝的手段³によって直接識別されます。トップダウンまたは表現型の研究では、小分子の究極の表現型の基礎となる可能性がある薬剤（ 例えば 、転写/翻訳/ DNA合成、細胞周期のブロック、経路の活性化/シグナル伝達阻害、 など ）によって影響を受ける特定の細胞プロセスを識別することができ、これこれらのプロセスに関与するタンパク質への潜在的なターゲットのリストを絞り込むことができます。しかしながら、トップダウンアプローチの主要な欠点​​は、すでにこれらのプロセスについて知られているものに依存し、したがってその機能が特徴付けられていない、または以前に関与することが記載されていない標的に対して付勢されていることです与えられたプロセスインチ

ボトムアップ・アプローチは、公平な方法で直接ターゲッ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)	Life Technologies	20490	新鮮な使用日を作ります。100 mMストックを4 eq NaOHを含む水に調製します。
トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン(TBTA)	AnaSpec	63360-50	1.7 mM ストックを t-ブタノールと DMSO の比率 4:1 で調製し、-20 °C.
硫酸銅(CuSO4•5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	50 mMのストックを水に調製し、室温で保存してください。
ビオチンアジド	クリックケミストリーツール	AZ104-100	DMSOで10 mMストックを準備し、-20 °C.
アレクサフロー647-アジド	ライフテクノロジー	ズ A10277	DMSOに1 mMのストックを準備し、-20 °C.
365nmのUVランプ	Spectroline	FC100	UV遮断メガネは、操作中に着用する必要があります。
プロテアーゼ阻害剤錠剤、EDTAフリー	ロシュライフサイエンス	11873580001	50倍溶液を水で調製し、-20°Cで保存します。°C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	出力 1、デューティ 30% に設定。
蛍光ゲルスキャナー	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	赤色レーザーを使用してAlexa-fluor 647を検出します。
界面活性剤対応 Dc タンパク質アッセイキット	Bio-Rad	5000112
High Capacity Streptavidin Agarose beads	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose	ThermoFisher Scientific	11885092
Fetal Bovine Serum, qualified	ThermoFisher Scientific	26140079
Penicillin/Streptomycin solution	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	LC2676