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方法論記事

ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定

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DOI：

10.3791/54529

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2016年9月20日

 , 
1Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine

この記事について

サマリー

ここでは、光親和性標識を使用して低分子結合タンパク質を同定する方法を説明します。この技術の利点は、標的タンパク質の結合および共有結合標識が生細胞環境内で行われるため、細胞溶解時に天然タンパク質の構造および結合条件を破壊するリスクが排除されることです。

要約

低分子の分子標的を特定することは、その作用機序を理解するための挑戦的ですが、必要なステップです。さまざまな低分子の結合タンパク質を成功裏に解明するために、いくつかの標的同定法が開発され、使用されてきましたが、これらの手法には欠点があり、特定の種類の低分子-標的相互作用の検出には適していません。特に、細胞溶解によって構造が乱される可能性のある膜タンパク質の相互作用など、天然の細胞条件に依存する非共有結合性相互作用は、アフィニティーベースのターゲット同定法に適していないことがよくあります。ここでは、光不安定性基を含むプローブを用いて、生細胞の環境内で低分子結合タンパク質に共有結合的に架橋し、細胞溶解後の相互作用の維持を必要とせずに標的タンパク質を検出・単離する方法を実演します。この手法は、メカニズムが不明な生物学的に興味深い小分子を研究するための貴重なツールであり、基礎生物学と創薬の両方の文脈で研究できます。

概要

生物活性小分子は、基本的に、細胞内で相互作用し、1つ以上の「標的」分子は、最も一般的にタンパク質の機能を変化させることにより動作します。活性化合物は、表現型スクリーニングによって発見されたときに薬物の発見では、その化合物の分子標​​的（複数可）の同定は作用機序および化合物の潜在的な副作用を理解するためだけでなく、潜在的に発見するためだけではなく、非常に重要です新しい生物学疾患モデルの基礎となると治療1の新たな機構的なクラスの開発のための道を開きます。標的の同定は、治療に使用する薬剤のために必要とされていないが、近年では、検証対象が既知であれば、新規薬剤候補は、臨床試験に成功し、そのための投資でより良いリターンをもたらす可能性がより高いことを増加の認識がありました2。したがって、小さな同定するための方法に関心がありました分子標的タンパク質。

古典的な標的の同定実験は、典型的には、対象の小分子は、樹脂上に固定化され、非結合タンパク質が洗い流され、残りのタンパク質が溶出し、3を識別された後、全細胞溶解物とともにインキュベートされるアフィニティー精製に依存しています。この技術は、多くの小分子4の標的を同定するために使用されているが、それはいくつかの理由のためにユニバーサルターゲットID方式としては不向きです。まず、標的タンパク質は、小分子に結合する能力を保持するために、細胞溶解の際に、その天然のコンフォメーションを保持しなければなりません。これは、多くの場合、それらの天然の環境から取り出された後、コンフォメーション変化を受ける、または単に凝集し、溶液から沈殿する膜タンパク質のために特に問題となり得ます。第二に、小分子は、化学的に維持しながら、樹脂に固定化することができるように修正されなければなりません標的タンパク質に結合する能力。それを樹脂に固定された後ディープ結合ポケットは、したがって、小分子にアクセスできなくなる可能性があります。第三に、結合親和性は、相互作用が低い親和性相互作用の識別が困難に、洗浄工程の間に維持されていることを十分に高くなければなりません。第四に、例えば、pH、イオン濃度、または他の内因性分子の存在などの環境条件は、細胞内で空間的に変化させることができ、そして時には薬物 - 標的相互作用のための前提条件です。したがって、許可および細胞外の結合を維持するための正しい条件を見つけることは試行錯誤のかなりの量を必要とすることができます。

光親和性標識は、小分子と細胞の天然コンテキスト内でその目標の共有結合を可能にすることにより、これらの問題を回避します。むしろ大きなかさばる樹脂への小分子を固定化するよりも、分子ではなく、化学的に二つの小さな機能グラムをインストールするように修正されますroups：特定の波長の光を照射すると、標的タンパク質に共有結合架橋を可能にする光活性成分、および標的タンパク質が検出され、続いて単離することができ、レポーター基。生細胞は、プローブが結合し、共有結合標的タンパク質に架橋し、プローブ - タンパク質複合体を単離し、無傷で、光親和性プローブ​​で処理されます。標的に結合するプローブの特異性は、親化合物の過剰が、標的タンパク質に対するプローブの結合離れて競合するために使用される並列で競合実験を行うことにより実証されます。

光親和性プローブ​​の設計と合成は1、小分子から別のものに大きく変化し、このプロトコルではカバーされません。しかし、件名にいくつかの優れた議論が5-9を公開されています。主な考慮事項はpresumab従って、プローブは、親化合物の生物活性を保持することですLY同じ対象（複数可）に結合します。構造活性相関（SAR）研究は、分子の部分は生物活性の損失なしに変更することができるかを決定するために実行されなければなりません。別の化学基の種々は、それぞれ長所と短所10を有しているジアジリン、ベンゾフェノンおよびアリールアジドを含む光活性架橋剤として使用されてきました。同様に、プローブの結合タンパク質を単離するために使用されている複数のレポータータグがあります。レポーター基は、一般的に使用されるビオチンまたは蛍光タグのように、自分で機能的であってもよいし、小さく、生物活性11を危うくすることがにくいという利点を有する光架橋工程の後にさらなる官能化を必要とする前駆体であってもよいです。

このプロトコルでは、我々は、Cu（I）-catalyz介しジアジリンの光架橋基を含有する光親和性プローブ​​、およびレポーター基の結合のための末端アルキンを使用していますEDアジド-アルキンシャープレス-ヒュイゲンの環（またはクリック）反応12-15。 SAR研究、プローブ設計と合成、およびこれらの研究の結果は、他の場所で16-18を発表されています。

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プロトコル

注：このプロトコルは、生細胞での使用のためにマッキノンとトーントン10から適応されました。

培養細胞の調製

  1. （下記参照）を所望のサンプル数のための無菌6 cmの細胞培養皿を準備します。
    注：細胞の一皿は、処理条件ごとに使用され、より多くのタンパク質が必要な場合は2または3皿を条件ごとに調製し、UV照射後に組み合わせることができます。
    1. 細胞の少なくとも3皿を準備し; DMSOのみ（D）、プローブ処理のみ（P）、およびプローブ+競合物（C）と陰性対照。
    2. 必要に応じて、プローブで処理されたが、UV光にさらされないべきなしUVコントロールとして4 番目の皿を、準備します。
      注：複数の競合分子は、このような関心の小分子の異なる類似体として、試験する場合は、必要に応じて追加の競合プレートを準備します。
  2. 4mlの培地で培養皿にHEK293T細胞を加えます。 350万Cを使用しますプレート当たりells。
    注：細胞は、実験の開始時に、ほぼ100％コンフルエントになるように細胞数が最大タンパク質収量を達成するために、各細胞型のために決定されるべきです。 HUVECは、プレート0.3万個の細胞を使用しています。良い近似がコンフルエント15cmの皿に細胞の1/10です。 HEK293T細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地で培養する必要があり、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました。
  3. 一晩培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）に細胞を戻します。

細胞および光架橋の2治療

  1. 翌日、前アリコート1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに以下の薬剤：
    1. 最初の治療のために、1管に2チューブおよび10mMの競争相手（ すなわち、変更されていない親化合物）の4μlにDMSOの4μlを添加します。
    2. 二回目の治療のために、1チューブにDMSOの16μlを添加し、50＆の16μlの＃181; 2チューブにMの光親和性プローブ​​。
      注：最適濃度は（議論を参照）異なるプローブごとに異なる​​かもしれないが、200から500の間nMでは（ここでは200 nMのを使用します）良い出発点です。競合相手の濃度は、プローブの少なくとも20倍（ここでは10μMを使用）のものを超えている必要があります。 DMSOの最終濃度は、全てのプレートで同じであるべきで、0.5％（20μl容量）を超えてはなりません。
  2. 細胞培養フード内に細胞プレートを持参し、次のようにステップ2.1.1から事前等分し薬を追加：培養培地の吸引除去1ミリリットル、メディアで事前に小分け薬を再懸濁し、穏やかにプレート降下に戻ってそれを追加します賢いです。 DMSO（D）プレートとプローブ（P）プレートにDMSOを追加し、競争（C）プレートに競技者を追加します。 30分間培養インキュベーターにプレートを返します。
  3. 淡色培養フード内のライトで、プローブするステップ2.1.2から事前に小分けプローブを追加（P）との競争（C）プレートと追加上記のようにDMSO（D）プレートにDMSO、。 1時間培養インキュベーターにプレートを返します。
  4. インキュベーションの間、以下の項目を準備し;プレートのすべてに適合することができます氷の皿;氷冷溶解緩衝液（PBS [pHを8.5] + [水の中に作られた50倍ストック溶液から希釈した完全無EDTA、] 1×プロテアーゼ阻害剤カクテル、200μL/プレート）。マイクロ遠心チューブを氷上で、異なる処理条件ごとにD、P、またはC標識。
  5. 1時間のインキュベーションの終了前15分は、低温室でUVランプ（365 nm）を設定し、電球をウォームアップするためにそれをオンにします。
  6. プローブと1時間インキュベートした後、氷の上に皿を置きます。過剰のプローブを除去するために穏やかに5mlの氷冷PBS（pH7.4）で細胞を洗浄します。 4ミリリットルの氷冷PBSで細胞を再カバーしています。
  7. ランプからの加熱を最小限に抑えるために氷パックの上にUVランプの下で3センチメートルを中心とした細胞の皿を置きます。 3分間照射します。氷のトレーに皿を削除し、すべてのサンプルについて繰り返します。
  8. AFTER照射、細胞からPBSを吸引し、各プレートにプロテアーゼ阻害剤との氷冷PBS（pHは8.5）の200μlを添加します。氷上で予め標識マイクロ遠心チューブにゴムスクレーパーと転送を使用して、細胞をプレートから外します。
  9. （サンプル250μlの中に10％SDS10μlの）0.4％の最終濃度までSDSを追加します。
    注意：SDS粉末は危険です。鼻と口の上にマスクを身に着けていることによってSDS粉末を吸入しないでください。
  10. 細胞を溶解し10パルス（出力1、デューティ・サイクル30％）のためのサスペンションを超音波処理することにより、10パルスの第二ラウンドの前に1分間氷上でインキュベートします。
  11. 必要に応じて、サスペンションの2μLを削除し、完全な細胞溶解を確実にするために、光学顕微鏡下で確認してください。
  12. 細胞溶解を完了し、すべてのタンパク質を変性させ、5分間95℃に設定したホットプレート上のサンプルを沸騰させます。
  13. 例えば番目として、分光光度洗剤互換タンパク質アッセイを用いて、各試料中のタンパク質濃度を測定750 nmでの吸光度を測定するように設定され分光光度計を用いて、製造業者の指示に従って、E DCタンパク質アッセイ19、。
  14. 必要に応じてPBS pHを8.5 + 0.4％SDSを添加することによって2.5 mg / mlとし、タンパク質濃度を標準化（または濃度である場合よりも低いの2.5mg / mlの、最も低いタンパク質濃度を有するサンプルを正規化する）（例えば、サンプルが5である場合に250μlの中mg / mlでは、）を2.5mg / mlの最終濃度を得るために、PBSのpHは8.5 + 0.4％SDS250μlのを追加します。

標識タンパク質の可視化のためのクリックケミストリーにより蛍光タグの3別紙

  1. 細胞溶解物の40μlのを削除し、新しいマイクロチューブに移します。ビオチンアジド（ステップ4）との反応のための残りの溶解物を保管してください。
  2. 順番に以下の試薬を追加します：0.2μlのフッ素 - アジド（DMSO中の1mMストック溶液）、0.58μlのTCEP（100 mMストックを水にNaOHを加え、4当量で、新たに調製）、および3.38μlのTBTA（1。DMSOにt-ブタノールの1の比率）：4で7 mMストック。ミックスする渦。
  3. 反応を開始するために、1.14μlののCuSO 4・5H 2 O（水中50mMの）を追加します。簡単にボルテックスし、暗所で30分間室温でインキュベートします。
  4. 反応をクエンチするために2×SDSサンプル緩衝液50μlを加えます。この時点で、一晩必要に応じて-20℃で最良の結果、またはストアのSDS-PAGEゲル20上で直接サンプルを実行します。
  5. サンプルを凍結した場合、ゲルにロードする前に95℃で5分間再加熱。
    注：標的タンパク質の分子量は、典型的には、この段階では知られていないので、それは別のアクリルアミド濃度の2ゲルを実行することが推奨される（ すなわち 、8％および15％）、または広い分子量範囲の勾配ゲル（ すなわち、 4〜15％）は、完全な分子量範囲を確保します。
  6. 色素の先端がゲルの末端に到達したときに、過剰unreacteのすべてを確実にするために、さらに5分間ゲルを実行し続けますDフッ素アジドは、ゲルを完全に終了しました。
  7. ddH 2 Oで容器にゲルを削除し、すべての過剰フルオロ-アジドを洗い流すために、穏やかに攪拌しながら10分間インキュベートします。
  8. ガラス板上にゲルを置き、製造元の指示に従って台風蛍光ゲルスキャナーを用いてゲルをスキャンします。

標識されたタンパク質のアフィニティー精製のためにクリックケミストリーによって、ビオチンタグの4別紙

  1. ステップ3.1からの残りの溶解物の、2.5に正規化した後、mg / mlで得られた試​​料の体積は500を使用し、500、550、および600μlのであれば全てのサンプルは、例えば、同じボリューム（あるように、タンパク質の正規化後最大量を使用します各μlの）。
  2. PBS（pH7.4）で50μlに高容量ストレプトアビジンアガロースビーズ、プレ洗浄2回追加することにより、溶解物をプレクリア。回転させながら4℃で1時間インキュベートします。
  3. 3分間千×gでの遠心分離によってビーズをペレット。トンを削除します彼は氷の上で新しいマイクロチューブに上清およびビーズを捨てます。
  4. 「入力」と表示された新しいチューブにDMSOサンプルの百分の1から2を削除してください。 -20℃での2×SDSサンプルバッファーとストアの同等のボリュームを追加します。
  5. 溶解液500μlのあたり、以下の試薬を追加します。1.38μlのビオチン - アジド（DMSO中の10mMストック）を、5.5μlのTCEP、および32.5μlのTBTA。ミックスする渦。
  6. 11μlの簡単溶解液と渦500μlのあたり・5H 2 OのCuSO 4を追加します。室温で30分間インキュベートします。
  7. -20℃に冷却し、アセトンの4サンプル容量を追加します。ボルテックスのサンプルと完全にタンパク質を沈殿させ、未反応のビオチンアジドを除去するために、-80℃で一晩インキュベートします。
  8. 遠心分離機は、4℃で15分間、17000×gでサンプルが沈殿したタンパク質をペレット化します。
  9. 完全に上清を吸引除去し、150μlのPBS（pH7.4）で+ 1％SDS中での超音波処理によりタンパク質を溶化。
  10. 0.2％にSDSの濃度を希釈するために、PBS（pH7.4）で600μlのを追加します。
  11. 30μlの予め洗浄した高容量ストレプトアビジンアガロースビーズにサンプルを追加し、回転させながら4℃で1時間インキュベートします。
  12. 3分間千×gでの遠心分離によってビーズをペレット。非結合タンパク質を含む上清を吸引し、廃棄します。
  13. ビーズに洗浄緩衝液（400mMの塩化ナトリウム、50mMトリス、0.2％SDS、pH7.4）中の1ミリリットルを追加し、回転させながら室温で5分間インキュベートします。
  14. 繰り返しは、4.12と4.13を3回繰り返します。
  15. ビーズから完全に洗浄緩衝液を吸引し、2×SDSサンプル緩衝液30μlを追加します。
  16. ビーズからタンパク質を放出するために95℃のヒートブロックで5分間インキュベートします。
  17. 室温で13,000×gで1分間、ビーズを遠心分離。
    注：この時点で、サンプルは、SDS-PAGEを実行する準備ができるまで-20℃で保存することができます。サンプルを凍結する場合、使用前に95℃で5分間再加熱。
  18. 慎重にビーズのオフタンパク質を含む試料緩衝液をピペット、およびSDS-PAGE 20にロード（以下、重要な考慮事項を参照してください）。ビーズは、必要に応じて後で再沸騰のために保存することができます。
    注：銀染色によるタンパク質の検出のために、良好な結果を1mm厚さのゲルを用いて得られます。バンドは、質量分析（MS）分析のための銀染色ゲルから切り出しする場合は、滅菌溶液からの新鮮な全ての試薬を準備し、ゲル上のサンプル間でよく空のままにしておきます。その背景タンパク質が減算することができるので、プローブ車線からカットごとの帯域については、並列スライスはDMSOレーンから取得する必要があります。ウェスタンブロットによるタンパク質のIDを検証するためには、SDS-PAGEゲルを実行するときにもステップ4.4からの入力サンプルをロードすることが重要です。
  19. 標的タンパク質（複数可）を検出するための銀染色21またはウェスタンブロット22のいずれかのための標準プロトコルに従ってください。

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結果

ここに示す結果は、抗真菌薬のイトラコナゾールの光親和性プローブ、以前に16を公表されたを使用して得ました。これらの結果は、正常に35 kDaの膜タンパク質電位依存性陰イオンチャネル1（VDAC1）などの主要なイトラコナゾール結合タンパク質を同定するための生細胞光親和性標識技術の使用を実証します。

上記のプロトコルは、競合分子として光標識および非修飾イトラコナゾールためのイトラコナゾールのプローブを用いてHEK293T細胞で行いました。記載されるように試料を調製した後、それらは分子量によってタンパク質を分離するために、SDS-PAGEに供しました。左側の分子量マーカー単位はキロダルトン（kDaの）です。最初のレーンは、DMSOコントロール試料（D）であり、第二のレーンは、プローブ試料（P）であり、第3レーンは競合サンプル（C）です。バンドのpDMSOのみのレーンに憤慨背景と考えられています。結合タンパク質、その特定の点に注意してくだ...

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ディスカッション

薬剤の細胞表現型は、それらの既知の機能に基づいて、その潜在的なターゲットを絞り込むために使用されるトップダウン、またはボトムアップ、ターゲット：小分子の標的を同定するために、異なるアプローチは、大きく二つのカテゴリーに分類することができます化学的または遺伝的手段3によって直接識別されます。トップダウンまたは表現型の研究では、小分子の究極の表現型の基礎となる可能性がある薬剤（ 例えば 、転写/翻訳/ DNA合成、細胞周期のブロック、経路の活性化/シグナル伝達阻害、 など ）によって影響を受ける特定の細胞プロセスを識別することができ、これこれらのプロセスに関与するタンパク質への潜在的なターゲットのリストを絞り込むことができます。しかしながら、トップダウンアプローチの主要な欠点​​は、すでにこれらのプロセスについて知られているものに依存し、したがってその機能が特徴付けられていない、または以前に関与することが記載されていない標的に対して付勢されていることです与えられたプロセスインチ

ボトムアップ・アプローチは、公平な方法で直接ターゲッ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

光親和性標識プロトコルの設計に関する助言をいただいたBen Nacev博士、イトラコナゾール光親和性プローブの合成についてWei Shi博士、アフィニティプルダウン実験について助言を提供してくださったYongjun Dang博士、そして有益なコメントとサポートを提供してくださったJ.O.L.研究室の他のメンバーに感謝します。この研究は、薬理学/毒物学のPhRMA財団フェローシップ(S.A.H.に)によって部分的に支援されました。国立がん研究所助成金R01CA184103;客室乗務員医学研究所。前立腺がん財団(JOL);ジョンズ・ホプキンス大学臨床・トランスレーショナル研究所(Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research)は、全米トランスレーショナルサイエンス推進センター(NCATS)のグラントUL1 TR 001079から一部資金提供を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)Life Technologies20490新鮮な使用日を作ります。100 mMストックを4 eq NaOHを含む水に調製します。
トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン(TBTA)AnaSpec63360-50 1.7 mM ストックを t-ブタノールと DMSO の比率 4:1 で調製し、-20 °C.
硫酸銅(CuSO4•5H2O)LabChem, Inc.LC13440-150 mMのストックを水に調製し、室温で保存してください。
ビオチンアジドクリックケミストリーツールAZ104-100DMSOで10 mMストックを準備し、-20 °C.
アレクサフロー647-アジド ライフテクノロジーズ A10277DMSOに1 mMのストックを準備し、-20 °C.
365nmのUVランプSpectrolineFC100UV遮断メガネは、操作中に着用する必要があります。
プロテアーゼ阻害剤錠剤、EDTAフリーロシュライフサイエンス1187358000150倍溶液を水で調製し、-20°Cで保存します。°C.
SonicatorBransonSonifier 250出力 1、デューティ 30% に設定。 
蛍光ゲルスキャナーGE Healthcare Life SciencesFLA 9500赤色レーザーを使用してAlexa-fluor 647を検出します。
界面活性剤対応 Dc タンパク質アッセイキットBio-Rad5000112
High Capacity Streptavidin Agarose beads Life Technologies20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucoseThermoFisher Scientific11885092
Fetal Bovine Serum, qualifiedThermoFisher Scientific26140079
Penicillin/Streptomycin solutionThermoFisher Scientific15140122
SDS Sample Buffer (2x)サーモフィッシャーサイエンティフィックLC2676
ThermoFisher Scientific (2x)の

参考文献

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