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方法論記事

マウスにおける反復震とう頭部損傷モデル

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DOI：

10.3791/54530

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2016年10月12日

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1Program for Neurotrauma, Neuroproteomics & Biomarkers Research, University of Florida, 2Department of Psychiatry, University of Florida, 3Department of Neuroscience, University of Florida

この記事について

サマリー

脳震盪は、最も一般的なタイプの外傷性脳損傷を示します。したがって、患者の損傷の重要な特徴を再現する反復脳震盪動物モデルは、厳密で制御された効率的な方法で脳震盪を研究する手段を提供する可能性があります。

要約

脳震盪/軽度の外傷性脳損傷(mTBI)が最も頻繁に発生するにもかかわらず、その損傷とその影響に関する知識はまだ不足しています。 脳震盪の理解を深めるために、動物は制御された厳密で効率的なモデルを提供するため、よく使用されます。研究では、従来の動物モデルを適応させて mTBI を実行し、損傷パラメーターを変更することにより軽度の損傷の重症度を刺激します。これらのモデルは、形態学的に臨床状態と類似した脳損傷を引き起こし、さまざまな損傷の重症度を提供できるため、使用されてきました。しかし、彼らは患者の傷害の同一の特徴を示す能力に限界があります。従来の衝撃システムを使用すると、反復性脳震盪傷害(rCHI)モデルは、軽度から中等度のヒトのような脳震盪を誘発する可能性があります。損傷の程度は、呼吸の一時的な終了の兆候を伴う意識喪失(LOC)の期間を測定することによって決定できます。rCHIモデルは、mTBIの影響と潜在的な治療法を決定する際の精度とシンプルさのために使用するのに有益です。

概要

脳震盪は、とも呼ばれる軽度の外傷性脳損傷（MTBI）、外傷性脳損傷（TBI）の中で最も頻繁に発生であり、米国で何百万人もの人々に影響を与えます。脳震盪は、診断するのが難しいことができ、脳震盪のための具体的な治療法はありません。成長している認識とスポーツ傷害、戦闘、および他の物理的に魅力的な追求に起因する軽度の機械的外傷が累積し、慢性神経結果1,2を有していてもよいことを、いくつかの証拠があります。しかし、脳震盪とその効果に関する知識の欠如が依然として存在します。唯一の神経学的評価とイメージング評価は臨床診断のために利用可能であるため、現在の方法論は、ヒトの病態と治療の研究を制限します。動物モデルは、MTBIのさらなる診断と治療の希望を持って、効率的で厳格な、かつ制御された方法で脳震盪を研究するための手段を提供します。

研究は、伝統的なTBIを適応していますこのような制御皮質衝撃（CCI）、流体パーカッションのインパクト（FPI）のようなモデルは、重量MTBIを実行し、けがのパラメータを変更することにより、低損傷の重大度を刺激するために、損傷、およびブラスト傷害をドロップします。これらのモデルは、原因の臨床症状と形態学的に類似した脳外傷を複製する能力を使用することは有益です。しかしながら、それらはまた、独自の制限を有します。加速損傷（重量の低下）によって誘発される損傷の重症度は、多くの場合、非常に可変です。軽度のCCIの二つの結果 - くも膜下出血と焦点挫傷は - 典型的な人間の脳震盪と比較することはできません。爆風損傷が異なる露光位置とピーク圧力測定だけでなく、露出3-6中の変数二次的損傷に関して、より論争のモデルでありながら、CCIとFPIは、臨床的に関連していない開頭術を必要としています。更新震とう動物モデルをそれは、臨床セッティに前臨床研究を翻訳することができますngが研究に必要です。

軽度のTBIのモデル化における重要な問題は、最も密接に臨床設定で怪我を複製する実験的な傷害の重症度を、定義することです。最近、別の研究グループは、閉鎖性頭部外傷または震盪頭部外傷（CHI）モデル7-10を開発しました。 CHIは開頭せずにCCIの変形であるが、それはまだ頭部衝撃を生成するために、従来の電子、磁気インパクト方式を使用しています。 CHIはインパクトパラメータを調整することによって、軽度から中等度の範囲で脳震盪を誘導することができます。意識消失（LOC）は、すぐに呼吸速度または呼吸の一時的停止の減少を検出することにより、衝撃後に観察することができます。 LOCの期間は、損傷の重症度を決定するために使用されます。本稿では、詳細なステップバイステップのプロトコルおよび代表的な結果と一緒に、マウスにおける反復CHI（rCHI）モデルのわずかに改善および更新されたバージョンが含まれています。 rCHIモデルの研究戦略のA脳震盪誘発性の病理学的変化の全てを模倣することのできるいかなる個々の動物モデルが存在しない、特に以来、MTBIの効果と潜在的な治療法を決定する上で有益な再。

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プロトコル

すべての手順は、フロリダ大学の施設内動物管理使用委員会によって、および実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って承認されたプロトコル番号201207692下で行いました。

1.動物ケア

  1. 3-4ヶ月齢の雄のC57BL / 6Jマウスを使用してください。寝具、ネスティング材料、食品、および水を自由に提供します。一定の12時間明/ 12時間暗サイクルで22°C - 20で制御された周囲温度にマウスを保管してください。

2.事前衝突準備

  1. 電磁定位インパクトデバイスにカスタムメイドのシリコーンゴムでコーティングされた金属チップを取り付けます。先端の平坦な底部は、プローブ先端（ 図1A）の表面に平行であることを確認してください。
  2. 2.5％イソフルランの維持麻酔に続いて4％イソフルランでマウスを麻酔。流量計を介して麻酔を確認してください。 Monito動物がペダル撤退反射の消失を示すことによって、麻酔の外科的なレベルに達するまで、麻酔レベルrを。
  3. 加熱パッド上の腹臥位でマウスを置きます。麻酔下でマウスを維持するために漏斗状のノーズコーンを使用してください。完全にトリマーを使用して頭を剃ります。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、マウスの目にワセリン眼軟膏を使用してください。

3.インパクトパラメータ設定

注：影響システムは、衝撃パラメータを設定するための制御ボックス、衝突を実行するためのアクチュエータ、及び3の移動軸を有するデジタル定位フレームを含みます。

  1. 4メートル/秒の衝撃装置の速度を事前に設定し、コントロールボックスに240ミリ秒に滞留時間。

4.ポジショニングインパクトセンター

  1. 39℃付近で体温を維持するために、動物の体の下に柔らかい加熱パッドを置きます。 PRONに定位フレームにマウスをマウント平滑末端耳バー付きの電子の位置。
  2. Z-ドライバを移動することで、マウスの頭部に近い衝撃先端を下げます。ターゲットは矢状縫合の上座標に途中でX軸とYドライバを移動させることにより、フラットなインパクトチップ（直径9mm）を調整します。
  3. 衝撃先端の1辺が上下に2耳（ 図 1C）の間に引かれた仮想の水平線に平行であることを確認してください。インパクトの中心はinterfrontalとラムダ状縫合（0ミリメートル、横4.5ミリメートルを耳にする耳9ミリメートル）の間の中央矢状縫合の中間に相当します。

5.インパクトの深さの設定

  1. 正しくインパクトの深さを設定するには、絶縁されたシリコーンゴムでコーティングされたインパクトチップを交換するために、追加のプローブ・チップを使用しています。
  2. ヒントを切り替えた後の衝撃中心のないシフトがないことを確認するために、ヒントを切り替える前にゼロにデジタル定位コントロールパネルにXとYのチャンネルを設定します。
  3. PROBを移動手動でX-とY-ドライブを移動することにより、インパクトエリアの中心に電子チップ。
  4. マウスの尾のクリップ接触センサ。
  5. プローブ先端が衝突部位の表面に触れるまでインパクタ（Zドライブ）を下に移動します。
  6. ゼロに定位コントロールパネルのZチャンネルを設定します。
  7. 手動でX軸とYドライバまで、X軸とYドライバ（NOTデジタル定位コントロールパネル上のゼロボタン）を調整することにより、バックインパクトエリアへの衝撃先端を移動（衝撃先端が以前に配置された）はゼロです。
  8. コントロールボックスに後退スイッチを動かすことによって、アクチュエータを撤回。手動で4ミリメートルによって（Zドライバ）インパクターを下に移動。

6.影響

  1. コントロールボックスへの影響スイッチをクリックすることで、衝撃をトリガし、4ミリメートルの変形の深さを実現。

7.ポストインパク

  1. タイマーを使用して、マウスの最初の呼吸までの衝撃からの時間を測定します。
  2. 楽器から動物を削除し、自分の体の温度を維持するために暖かいパッド上に置きます。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。
  3. きれいなケージに戻って動物を返す前に、リカバリを可能にします。完全に回復するまで、他の動物の会社に動物を返しません。
  4. 毎日マウスを観察し、重量を量ります。マウスは、痛みの兆候を示した場合は、腹腔内に1でメロキシカムでそれらを注入 - 24時間 - 2ミリグラム/毎12 kgです。

8.繰り返しインパク

  1. 日4、7日にマウスを追加傷害を与え、最初の損傷（インパクトの間に72時間間隔）後の10。

9.免疫組織化学（IHC）

  1. Transcardial灌流
    1. 200メートル/ kgのペントバルビタールで腹腔内注射によりマウスを麻酔。
    2. 評価し、つま先のピンチによって外科的平面麻酔を確保します。秒URE優しく化学ヒュームフードの内側に発泡スチロールの作業面に前足と後足をテーピングすることにより、仰臥位でマウス。
    3. ちょうど鎖骨の剣状突起下から胸部正中線に沿って皮膚を通して切開を行います。剣状突起の2つの追加の皮膚切開を行い、横方向に腹側胸郭のベースに沿って進みます。
    4. 胸腔を開き、胸部の筋肉や肋骨を切断することにより、心臓を露出。
    5. 鈍鉗子で鼓動している心臓を固定し、1作る - 左心室中2ミリメートルの切開を。
    6. すぐに右心房に翼状針を挿入します。ゆっくりとシリンジを押して20ミリリットルの生理食塩水の注入を開始します。
    7. 生理食塩水から4％パラホルムアルデヒドに切り替えます。パラホルムアルデヒドの20ミリリットルで灌流を続けます。
    8. マウスを刎ねるとハサミで皮膚を取り除きます。骨カッターを使用して、頭蓋骨から脳を分離します。
  2. C言語切片ryostat
    1. -80℃における最適切断温度（OCT）製剤、凍結中の埋め込み脳組織。矢状方向にクライオスタットに脳を置きます。カット脳切片厚さ5μm。
  3. 染色
    1. 室温で1時間凍結切片を乾燥させます。
    2. 室温で1時間、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の2％ヤギ血清および0.1％トリトンX-100100μlでスライドをインキュベートします。
    3. 300μlのPBSでスライドを3回洗浄。 4℃で別々に一晩：（200 1）または抗フェリチン抗体：その後、抗GFAP（200 1）でスライドをインキュベートします。
    4. 300μlのPBSでスライドを3回洗浄。その後、ビオチン結合二次抗体とともに室温で2時間、スライドをインキュベートします。
    5. 300μlのPBSでスライドを3回洗浄。その後、室温で30分間アビジン - ビオチン複合体（ABC）溶液（午前1時50分）でスライドをインキュベートします。
    6. 300μlのPBSでスライドを3回洗浄。 8分-そして5用の3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）基質溶液（50ミリリットルPBS、10μlのH 2 O 2、10ミリグラムのDABピル、使用する前に、フィルタ）でインキュベートします。陽性細胞が現れるまで顕微鏡下でスライドを観察します。
    7. 5分間の実行速度の遅いスライドを水道水ですすぎます。ラボ・ワイプできれいにスライドします。その後、封入剤とカバーガラスとのセクションをマウントします。

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結果

このモデル（ 図1 AC）では、あえぎ呼吸や浅い呼吸の短い期間ではありました。意識（無意識）の損失は、呼吸速度または正常な呼吸を再開する前に、呼吸の一時的停止の減少として定義されます。頭の中心への影響は短期的無意識（個別インパクト時の7.5±4.7、7.8±5.5、10.2±8.8、9.5±8.0秒、 図1D）が発生しました。マウスの脳には明らかな構造的病変または衝撃（ 図2A）に起因する組織損傷を示さなかっれ、H＆E組織学的染色によって正常な形態を示しました。 TBIに応答して、星状細胞、活性化、増殖、または反応性グリオーシス11,12を含む特定の変化を受けることが知られています。大きな細胞体と厚いシナプスと増加グリア線維酸性タンパク質（GFAP）陽性細胞は活性化星状細胞です。 corpurCHIマウスの脳からの脳梁は、最後の影響（ 図2B）後7日目にアストロサイト活性化の明らかな兆候を示しました。

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ディスカッション

臨床症状と形態学的に類似した脳損傷を模倣するために、ポスト脳震盪の症状が期待されています。ポスト脳震盪の症状は、一般的に頭痛、めまい、めまい、疲労感、メモリや睡眠の問題、トラブル集中だけでなく、不安、および抑うつ気分が含まれます。身体症状はまだ動物モデルにおいて測定可能ではないかもしれないので、運動および認知機能および感情行動の変化は、合理的に、動物モデルにおいて脳震盪を評価するための基準として使用されます。以前報告された研究では、rCHIマウスモデルは、空間学習、記憶、不安8の欠損を誘導することが示されました。より重要なことに、このプロトコルで使用されるrCHIモデルは、浸潤性脳損傷または脳構造破壊することなく臨床的設定を表し、出血、出血、浮腫、または急性細胞死/組織の損失をもたらす可能性が両方とも。

以下に成功一貫したconcussioをモデル化するための重要なヒントを紹介します電子マグネット影響システムを用いてN / MTBI。

直接衝突時の動きによって引き起こされる可能性が最初に脳損傷に続く第2の...

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開示事項

著者には開示すべき金銭的利益はありません。

謝辞

この作品は、Florida Healthの助成金（脳脊髄損傷研究基金（KKW）からの資金提供によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
麻酔器Eagle Eye Anesthesia, IncModel 150 麻酔
電磁インパクターLeicaBiosystemsImpact One Stereotaxic ImpactorPerforming Impaction
デジタル脳定位固定装置LeicaBiosystems39462501マウントマウスと位置決めチップ
Siciloneゴムコーティング金属チップ精密工具&エンジニアリング、ゲインズビルFLカスタムメイドインパクトチップ
リチウムイオンオールインワントリマーWAHLホーム製品9854-600シェービングマウスヘア
ペーパークリップカスタムメイドプローブチップ
コットンチップアプリケーターMEDLINEMDS202055生理食塩水ティ
ッシュテックOCTスASKURA FINETEK USA INC4583組織包埋
IHC 抗 GFAPDakoCA93013抗体
抗フェリチンSigmaF6136IHC
VECTASTAIN Elite ABC用ベクター研究所PK-6100IHC 検出システム
Permount Mounting MediumFisher ScientificSP15-100
Aperio XT ScanScopeスキャナーLeica Microsystems Inc,スライドスキャン
Leica AutoStainer XLLeica 病理学会社ST2010H&E染色
DAB sigmaD3939IHC検出システム
クラブヘッド抗体 キット

参考文献

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