作成および糖尿病創傷治癒モデルにおける脂肪由来幹細胞 (ASC) シートの移植

サマリー

脂肪由来幹細胞 (Asc) は簡単に隔離され、正常ラットの脂肪から採取しました。ASC のシーツは、細胞シート工学を使用して作成することができます、ザッカー出展全層脂肪の糖尿病のラット皮膚の露出した骨の欠陥と人工皮膚の層で覆われてに移植することができます。

要約

人工皮膚は、臨床実習でかなり治療成績を成し遂げた。ただし、妨げられる血流や大きな傷、糖尿病患者の傷のため人工皮膚の治療が長引く可能性も。細胞ベースの治療は糖尿病性の潰瘍の治療のための新しい手法として登場している、細胞シート工学は、細胞移植の有効性を改善しました。レポートの数は、脂肪由来幹細胞 (Asc)、間葉系間質細胞 (MSC) の種類は、脂肪組織と他の組織から MSCs と比較されたときコレクションのユーザー補助機能の相対的な豊かさのための治療の可能性を示すことを示唆しています。したがって、Asc は、幹細胞治療上の使用のための良いソースに表示されます。本研究では通常の Lewis ラットの副睾丸脂肪脂肪から ASC シートが作成されましたとアスコルビン酸を含む通常の培養液に温度応答性培養皿を用いたします。ASC シート Zucker 糖尿病性脂肪酸 (ZDF) ラットに移植、2 型糖尿病の減少を示す肥満モデルラット創傷治癒します。傷は後部の頭蓋表面上に作成された、ASC シートが傷に移植した膜人工皮膚シートをカバーするため使用されました。ASC シートを受け取った ZDF ラット ASC シートの移植なし ZDF ラットよりも癒しの傷があった良い。このアプローチは、ASC シート湿潤環境の維持を必要とする、乾燥した条件に敏感であるために限られていた。したがって、人工皮膚は、乾燥を防ぐために ASC シートをカバーしていました。人工皮膚との組み合わせで ASC シートの同種移植も他の難治性潰瘍や火傷、末梢動脈疾患と膠原病、観察などに適用して栄養不足ですか、ステロイドを使用している患者に投与されることがあります。したがって、この治療は糖尿病創傷治癒の治療方法の改善への第一歩かもしれません。

概要

糖尿病患者の人口は世界的に増加しており 4 億 2015年¹;糖尿病患者の約 15-25% は、下肢糖尿病性潰瘍²の進行からのリスクです。下肢糖尿病性潰瘍は難治性で、完全な回復後のリハビリ訓練の長期治療を必要とする可能性があります。頻繁に長い治療期間は、患者の生活の質の大幅な削減の結果します。したがって、糖尿病の傷の治療のために減らすか、悪化を防ぐ新たな治療法が開発されなければなりません。糖尿病創傷治癒過程を評価するため我々 は、糖尿病性潰瘍創傷治癒モデル ラットでは, 実用的な臨床的条件を模倣する、最適化し、創傷治癒促進細胞シート工学を用いた脂肪由来幹細胞 (ASC) シートを移植かどうか評価します。

間葉系間質細胞 (MSCs) は、様々 な細胞の血統³に分化する能力を彼らの免疫調節効果、自己再生能力のための創傷治癒を促進するための優れたポテンシャルを展示します。MSCs パラクリン活動^4、5潜在的な血管新生を含む他のティッシュから得られる利点を展示して Asc が脂肪組織由来 MSC の一種。脂肪組織は人間の体内では、比較的豊富なでき、アクセシビリティ、低侵襲の手順を使用して、コレクションです。したがって、Asc は創傷治癒のアプリケーション^6、7の実験に使用されています。

以前のレポートは、傷の周りの地域に単一細胞 MSC 懸濁液の直接注入が創傷治癒^8,9を加速することが示されています。ただし、単一細胞懸濁液を注入糖尿病性潰瘍モデルにおける創傷治癒の加速のレポート、にもかかわらず、創傷部位に移植細胞の生存時間は明確ではないです。

本研究では、温度応答性培養皿を用いた細胞シート工学を適用されます。これらの料理はある温度応答性高分子Nイソプロピルアクリルアミド彼らの表面の¹⁰に共有結合です。グラフト高分子層温度制御細胞接着や培養皿の表面から剥離が可能です。皿の表面は 37 ° c、それは 32 ° C 以下の温度では親水性になったとき、細胞が自発的に表面から切り離すに対し、細胞が接着し、増殖を許可する疎水性になります。の温度を減らすことによって単にそのまま細胞間結合と細胞外マトリックス (Ecm) の連続した細胞シートとして培養細胞を収穫できます。したがって、損傷、トリプシンなどの ECM 蛋白質分解酵素は必要な¹¹ではありません。したがって、細胞シート工学は、細胞間の接続を維持でき、細胞移植の有効性を改善することができます。

さらに、細胞シート移植細胞注入¹²と比較した場合の細胞生存率が増加します。このプロトコル Zucker 糖尿病脂肪 (ZDF) ラットは、創治癒遅延と 2 型糖尿病や肥満モデルとして選ばれました。ZDF ラットは、自発的に約 4 週間で肥満を開発します。彼らは、8、12 週齢、その時点で発揮する高血糖インスリン抵抗性、脂質異常症、高トリグリセリド血症¹³に関連付けられている間肥満と 2 型糖尿病を開発します。創傷治癒、血流の低下、末梢血管、糖尿病性腎症^14,,1516観察も。また、ZDF ラット糖尿病性潰瘍などの難治性皮膚潰瘍の治癒過程を研究するための適切なモデルがあります。

人間および齧歯動物の創傷治癒のメカニズムの違いは、皮膚の解剖学的差異に関連付けられます。正常ラットの創傷治癒は、再上皮化および肉芽組織の形成に基づいて人間の創傷治癒過程に対し創収縮に基づいています。通常、傷副木齧歯動物モデルで使用される創収縮を最小限に抑え、肉芽組織¹⁷、漸進的な形成を可能が非糖尿病ラットで傷はほぼ完全に収縮によって閉じられます。ただし、糖尿病創傷収縮 ZDF ラットは障害者と創傷治癒の主が再上皮化および肉芽組織形成を介して行われますしたがって、このプロセスより人間の創傷治癒の¹⁴に似ています。

糖尿病性創傷デブリドマンが臨床的によく遭遇後露出した骨付き。無胸腺ヌードマウス^18,19の背中に直径 12 mm 全厚皮傷や正常マウス²⁰の背中に直径 10 mm 全厚皮の傷、前が調査されました。重度の糖尿病の傷のための臨床モデルを開発するには、より大きい (15 × 10 mm²) 全層皮膚欠陥は骨を露出し、骨膜なしとして作成された、2 型糖尿病と肥満ラットで、前に説明した²¹。

通常の Lewis ラットの Asc からラット ASC (rASC) シートは、ASC シートの同種移植によって作成されました。臨床実習、潰瘍糖尿病患者は多くの場合、制御不能な高血糖と高体重指数、これら合併症原因創傷治癒障害これらの患者からの脂肪組織の取得の難易度を高めるなど、重度の糖尿病合併症を示すために、自家移植が可能。さらに、糖尿病を展示動物から Asc プロパティを変更、関数²²障害者します。したがって、ここで示されるプロトコルは、正常ラットから rASC シートの同種移植と人工皮膚の糖尿病ラットへの応用について説明します。

このプロトコルで使われる膜人工皮膚の傷の自発収縮を防ぐことができます、新しい結合組織のマトリックスの合成を促進して true 真皮²³を似ています。このプロトコルでは、人工皮膚は rASC シート上に配置、創収縮または緩いラット皮膚から結果の拡大を防ぐために糸で固定します。さらに、人工皮膚が移植された ASC シートや傷の湿潤環境を維持、感染や外部の力から傷を保護に ASC シート三次元フレームワークを提供します。最後に、非粘着ドレッシングは、外的な影響から保護、湿潤環境の維持、滲出液を吸収する創傷で配置されます。

RASC シートは薄い、柔軟性、および変形を暴行心²⁴など、受信者のサイトに移動に付着することができます。細胞シート工学は様々 な組織の再建のために使用されているし、治療効果^25,26.を生成することができます。臨床治療の可能性を示す ASC シートは、多くのタイプの傷の治癒を促進可能性があります。さらに、ASC シート、人工皮膚の使用と組み合わせるの同種移植は難治性の潰瘍や末梢動脈疾患や膠原病にみられるなど、火傷の治療に適用されるかもしれないまたは彼らは栄養不足ですか、ステロイドを使用している患者に投与されることがあります。このアプローチには、Asc を移植の効率が上がります。ZDF ラットの創傷治癒モデル人間の創傷治癒過程に似ており、小型の実験動物の臨床条件を模倣する重度の巻き具合が生成されます。

プロトコル

以下に提示するすべての実験プロトコルは、東京女子医科大学医学部の動物福祉委員会によって承認され、動物実験の適正な実施のためのガイドラインのすべての要件を遵守しています。

1. 動物、器具、培地、皿の準備

1. 20%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む最小限の必須培地アルファを使用して、完全な培地を調製します。使用するまでこれを4°Cで数か月間保管してください。
2. 2型糖尿病性肥満モデルとして、成人男性のZDFラットを使用します。オスのルイスラットの脂肪パッドを使用して脂肪組織を分離し、細胞シートを準備します。

2. rASCの分離と文化

1. イソフルランを使用して全身麻酔下でルイスラット(8〜33週齢、雄)から脂肪組織を採取します。.
   1. げっ歯類の機械換気装置と4%イソフルランを準備します。いくつかの滅菌綿の先端、清潔なガーゼ、メス、ニードルホルダー、手術ハサミ、鉗子、および5-0ナイロン縫合糸を準備します。手術器具と消耗品を滅菌します。
   2. 得られた脂肪組織を一時的に保存するために、10mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む100mmのシャーレを準備します。手術を開始する前に、天びんを使用してPBSでペトリ皿の重量を量り、採取した脂肪組織を測定します。手術器具と消耗品を滅菌ドレープにレイアウトします。
   3. げっ歯類の機械換気装置を介してイソフルランを3〜4%で使用してラットを麻酔し、手術中にラットを2〜3%のイソフルランに維持します。各ラットの呼吸の深さと呼吸速度を観察することにより、麻酔の深さを監視します。
   4. 滅菌手袋を着用しながら、滅菌ドレープの上でラットを仰臥位に置きます。電気カミソリで手術部位を剃り、70%エタノールに浸した滅菌ガーゼを使用してラットの腹部を清掃します。
   5. ラットの外側下腹部にメスで約5cmの長さの皮膚切開を作成します。外側の斜めの筋肉を露出させて解剖します。次に、精巣上体を取り巻く精巣上体脂肪組織を露出させます。精巣上体脂肪組織をそっと引き出します
      注:脂肪組織はラットの腹部の両側で得ることができます。
   6. 精巣上体脂肪組織のみを切除し、精巣上体、精巣、および精巣上体血管の損傷を避けます(図S1)。切除した脂肪組織をペトリ皿のPBSに浸して乾燥を防ぎ、組織の重さを量ります。
   7. 5-0 VICRYLで腹筋を閉じ、5-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。次に、手術を受けた各ラットを別々のケージに戻します(ケージごとに1匹のラット)
      注意: ラットが完全に回復するまで監視します。
2. 2〜3 gの脂肪組織からrASCを分離します(Lewisラットから切除し、以前に報告された方法に従って処理します)²⁷。簡単に言うと、切除した脂肪組織を0.1%A型コラゲナーゼで37°Cで1時間酵素的に消化し、間質血管画分(SVF;図 S2)。
   1. 生物学的クリーンベンチ上に、100μmのセルストレーナー数個、50mLチューブ数本、15mLチューブ数本、メス2個を準備します。遠心分離機の電源を入れ、ウォーターバスを37°Cに温めます。さらに、0.1%(最終濃度)のA型コラゲナーゼを含む50 mLチューブに約50 mLの滅菌PBSを調製します。
   2. 脂肪組織を2つのメスで細かく刻みます。
   3. すべてのみじん切り脂肪組織を50 mLチューブに移し、PBSを加えて総量を15 mLにします。.
   4. 50 mLチューブを直立させて5分間休ませ、上層を廃棄し、破片以外の下層を回収します。
   5. 脂肪組織を酵素的に消化するために、上層を含むPBSを含む50mLチューブに0.1%のタイプAコラゲナーゼ溶液を加えます
      注:37°Cの水浴中で脂肪組織2〜3 gあたり約20 mLのPBSを温めます。.
   6. 50 mLチューブを傾けて、120〜130 rpmで37°Cのウォーターバスで1時間静かに振とうします。
   7. 振とう後、50mLチューブを直立させて5分間休ませます。
   8. 100 μmのセルストレーナーを使用して溶液をろ過し、新しい50 mLチューブに溶液を注ぎます。ろ過した溶液を2本の15 mLチューブに分注します。
   9. 15 mLチューブ内の溶液を700 x gで5分間遠心分離します。上清の上層を慎重に取り除き、溶液の下層を5mL残します。ペレットを吸引しないでください。
   10. 各15 mLチューブに約5 mLの完全培地を、15 mLチューブあたり最大10 mLまで加え、ペレットを慎重に再懸濁します。
   11. 手順 2.2.8 から 2.2.9 を繰り返します。次に、SVFを取得します。
3. 60cm2カルチャーディッシュを2皿ご用意します。2回の遠心分離後、700 × gで5分間SVFを回収します。SVFを懸濁し、各60 cm²培養皿に10 mLのSVF溶液をプレートします。
4. 5% CO₂インキュベーターで37°Cで24時間培養します。
5. PBSと0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を調製し、使用するまで4°Cで数ヶ月間保存可能にします。
6. 最初のプレーティング(24時間)後、細胞をPBSで3回洗浄して、付着していない細胞と破片を取り除きます。新鮮な完全な媒体を追加します。
7. 3日目にほぼサブコンフルエントな細胞を継代します。0.25%トリプシン-EDTAを1mL加え、細胞を5%_CO2インキュベーターで37°Cで3〜5分間インキュベートします
   注:細胞の損傷を防ぐために、トリプシン化ステップを10分以内に完了してください。
8. トリプシン処理後、光学顕微鏡で細胞を観察し、すべての細胞が皿から完全に分離したことを確認します。次に、9 mLの完全培地を皿に加えます。
9. 血球計算盤を使用して細胞の数を数えます。
10. 細胞を1.7 x 10³細胞/cm²の密度で3日ごとに継代3まで継代培養する。継代培養した細胞を37°Cで、5%_CO2インキュベーターの加湿雰囲気で培養します。

3. rASCシートの作成

1. 直径35mmの温度応答性培養皿を数皿用意します。5% CO₂インキュベーターで37°CのFBS(またはFBSを含む完全な培地)で1時間以上、皿をプレコートします
   注:直径35mmの温度応答性培養皿は市販品です。
2. サーモプレートを調製し、以下の実験手順のために37°Cでインキュベートします。
   注:細胞が皿から自然に剥がれるのを防ぐために、37°Cのサーモプレートで温度応答性培養皿を使用してすべての手順を実行してください。
   1. 実験前に、手順で使用する全培地を37°Cに温めてください。
   2. ルイスラット由来の種子継代3 rASCを直径35 mmの温度応答性培養ディッシュに、密度1.5 x 10 5細胞/ディッシュで3日間、全培養培地2 mLを使用して
      注:rASCを新しい培養皿に播種するときは、インキュベーター内で皿を前後左右にゆっくりと揺さぶって、均一なrASC播種と均一な厚さのrASCシートを実現する必要があります。
   3. 37 °C のサーモプレートでインキュベートした温度応答性培養皿に播種した後、3 日目に 2 mL の培地を 16.4 μg/mL L-アスコルビン酸リン酸マグネシウム塩 n-水和物 (AA) を含む完全培地 2 mL に変更します。
      注:溶解したAAは、-30°Cで数ヶ月間保存できます。
   4. 細胞をさらに4〜5日間培養し、2日ごとに培地をAAを含む新鮮な培地と交換します。
   5. 光学顕微鏡でASCの増殖と生成を確認し、連続した細胞シートの細胞間にギャップが生じたかどうかを判断します。
3. 細胞シートをインキュベーターからベンチトップに15〜20分間移し、室温まで冷却し、細胞が連続した細胞シートとして自発的に剥離するのを観察します。一対の鉗子で皿の表面からrASCシートを採取します.
   注:通常、rASCシートは一対の鉗子で扱うことができます。必要に応じて、細胞シートがもろくて壊れやすい場合、転写膜を使用して培養皿から創傷部位に細胞シートを移すことができます。

4. 全層皮膚欠損創傷モデルの作成とrASCシートの移植

1. げっ歯類の機械換気装置と4%イソフルランを準備します。いくつかの滅菌綿チップ、清潔なガーゼ、5-0ナイロン縫合糸、メス、骨膜ラスパトリー、ニードルホルダー、手術ハサミ、および鉗子のペアを準備します。手術器具と消耗品を滅菌します。手術器具と消耗品を滅菌ドレープにレイアウトします。
2. PBSを準備し、人工皮膚と非粘着性包帯とともに室温で維持します。人工皮膚(15 x 10 mm)と非粘着性ドレッシング(20 × 15 mm)を事前にカットします。人工皮膚を使用する前に、人工皮膚の内側のコラーゲンスポンジ層を生理食塩水に浸してください
   注:人工皮膚は、外側のシリコーンシート層と内側のコラーゲンスポンジの2層でできています。
3. ZDFラット(16〜18週齢、雄、500〜600 g)を2型糖尿病と肥満の創傷治癒モデルとして使用します。
4. げっ歯類の人工呼吸器を使用して 4% イソフルランを吸入することにより、ZDF ラットに麻酔をかけます。げっ歯類の人工呼吸器を介してイソフルランを4〜5%使用して麻酔を誘発し、手術中は3〜4%に維持します。つま先をつまんで各ラットの呼吸の深さと呼吸速度を観察することにより、麻酔の深さを監視します。
5. 滅菌手袋を着用しながら、滅菌ドレープの上でラットを腹臥位に置きます。ラットの頭部を70%エタノールに浸した滅菌ガーゼで洗浄し、電気カミソリで手術部位を剃り、70%エタノールを浸した滅菌ガーゼで剃った後は皮膚を洗浄します。
6. 麻酔をかけたZDFラットの頭部に、表皮から骨膜までの皮膚組織を切除することにより、四角い全層皮膚欠損(15 x 10 mm²)を作成します。メスで皮膚と皮膚組織を切除し、骨膜ラパトリーで骨膜を切除します。
7. 35 mmの温度応答性培養皿上のrASCをインキュベーターから移植直前に室温環境に移します。
8. 35 mmの温度応答性培養皿のrASCが、創傷形成後に皿表面からシート状に自然に剥離する様子を観察します。rASCシートは、温度応答性培養皿で7日間培養した後、収穫します。培地を取り出し、rASCシートをPBSで3回洗浄します。乾燥を防ぐために、移植までrASCシートをPBSに浸します。
9. 一対の鉗子を使用して、rASCシートを頭蓋骨の欠損のすぐ上に置きます。細胞シートがもろくて壊れやすい場合は、メンブレンを培養皿から創傷部位に細胞シートを移すための足場として使用できます。
10. rASCシートと欠損部を人工皮膚(15×^10mm2)で覆い、5-0ナイロン縫合糸を用いて約10本の縫合糸で傷口を閉じます。創傷を保護するために、5-0ナイロン縫合糸を使用して非粘着性包帯(20 x 15 mm²)を人工皮膚の上に置き、創傷環境を湿潤に保ち、滲出液を吸収します。
    注:非粘着性包帯は、塗布後数日以内にZDFラットによって除去されます。したがって、移植後のラットを定期的に監視する必要があります。通常、非粘着性包帯は全身麻酔下で2日ごとに交換されます。
11. 手術を受けた各ラットは、完全に回復するまで別々のケージに戻します(ケージごとに1匹のラット)。観察期間の後、承認されたイソフルランの過剰摂取方法を使用してラットを安楽死させます。.

結果

このプロトコルでは、セルベースの難治性の糖尿病性創傷の治療法を確立しようとしています。(図 1に示す) として簡潔に同種 rASC のシーツは細胞シート工学を用いた正常ラットから作成された、糖尿病ラットの重層全層皮膚欠損創に人工皮膚を使用してそれから移植します。RASC シート (図 2 a) の良い例と悪い例 rASC シート (図 2 b) の光学顕微鏡の画像は図 2のとおりです。Asc は、新しい培養皿にメッキが、料理は、ゆっくりと前後に揺り動かしたと左と右制服 rASC シードと均一に厚 rASC シート (図 2 a) を実現するインキュベーターでする必要があります。RASCs を均一に接続および培養皿の表面に培養できない、シートを連続する ASC シート (図 2 b) として収集できません。図 3は、Asc が皿の表面に均一...

ディスカッション

RASC シートを正常に培養するための最も重要な手順は次のとおりです: 1) 温度は、温度応答性培養皿上での培養中におよそ 37 ° C に保たれなければなりません。RASC シートの作成時にすべてのプロシージャを 37 ° C の熱板に行ったし、すべての試薬は自発的に料理³¹から切り離す細胞を防ぐために 37 ° C に加温しました。2) 受信者 ZDF ラットを監視すると、rASC シートの巧妙な移植のために重大である非粘着ドレッシングの削除を禁止する必要があります。ドレッシングを削除した場合、新しい非粘着ドレッシングは傷のサイトから切り離す移植 ASC シートを防ぐために適用する必要があります。

この手順を使用して、rASC シート一般に得られた通路をシードの 5-7 日以内温度応答性培養皿上の 3 のセル。RASC シートを生成するために必要な培養時間は、最初の細胞密度や AA を含む完全な培養液を適用する時間に応じて調整できます。RASC シート細胞培養中に皿から切り離すと、rASC シートをリメイクする必要があります、細胞...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
&α;-MEM glutamax	Invitrogen	32571-036	Carlsbad, CA
シ胎児血清 (FBS)	Japan Bioserum Co. Ltd.	S1650-500
ペニシリン/ストレプトマイシン	Life Technologies	15140-122
コラゲナーゼ A	ロシュ ダイアグノスティック	10 103 578 001	マンハイム、ドイツ
60 cm2 Primaria tissue culture dish	BD Biosciences	353803	Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS)	Life Technologies	1490-144
0.25% トリプシン-エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)	ライフテクノロジーズ	25200-056
L-アスコルビン酸リン酸マグネシウム塩 n水和物	和光	013-19641
35mm温度応答型培養皿 (UpcellTM)	CellSeed	NUNC-174904	東京
マイクロウォームプレート (MP-1000)	北里科学	1111
げっ歯類用人工呼吸器	Stoelting	#50206	Wood Dale, IL
4% isoflurane	ファイザー	日本 114-13340-3	東京
人工皮膚 (Pelnac®)	スミス&甥っ子	PN-R40060	東京、日本
非粘着性ドレッシング(ハイドロサイトプラス®)	スミス&甥	66800679	Allevyn非接着性®として知られています。 米国
5-0 ナイロン縫合糸	Alfresa	EP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBES	greiner bio-one	227 261
15 mL Centrifuge Tube	Corning Incorporated	430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL	Hu-Friedy	P14	Chicago, IL