IgGおよびIgM自己抗体の同時検出のための二色抗原マイクロアレイの生成

サマリー

ここでは、ヒトとマウスの血清IgGとIgMの自己抗体を同時に検出するために使用できるカスタマイズ可能な抗原マイクロアレイを生成する方法について説明します。これらのアレイにより、目的の抗原やエピトープに対する抗体をハイスループットかつ定量的に検出することができます。

要約

自己抗原に対する抗体である

Autoantibodiesは多くの疾患状態に存在し、疾患活動性のマーカーとして役立つことができます。特定の抗原に対する自己抗体のレベルは、通常、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)技術で検出されます。しかし、ELISAによる複数の自己抗体のスクリーニングには時間がかかり、大量の患者サンプルが必要です。抗原マイクロアレイ技術は、マルチプレックス方式で自己抗体をスクリーニングするために使用できる代替法です。この技術では、抗原をロボットマイクロアレイで特別にコーティングされた顕微鏡スライドに配列します。スライドを患者の血清サンプルでプローブし、続いて蛍光標識二次抗体を添加して、血清自己抗体の抗原への結合を検出します。自己抗体の反応性は、蛍光シグナルを検出できるスキャナーでスライドをスキャンすることにより明らかになり、定量されます。ここでは、カスタム抗原マイクロアレイを生成する方法について説明します。当社の現在のアレイは、9本のソリッドピンで印刷されており、最大162個の抗原を重複して検出することができます。アレイは、マイクロアレイ装置が使用するソースプレート内の抗原を変更することで簡単にカスタマイズできます。私たちは、同じスライド表面上でIgGとIgMの反応性を区別できる2色の二次抗体検出スキームを開発しました。この検出システムは、ヒトおよびマウスの自己抗体の結合を研究するために最適化されています。

概要

自己抗体は多くの病状に存在し、しばしば直接的な病原性活性を持つことがあります¹.自己抗体の同定は、特定の疾患の診断、疾患の転帰の予後、および特定の治療法から利益を得る可能性のある患者の分類にとって重要です²。自己抗体は通常、ELISA技術を使用して患者の血清中に同定されます。しかし、この手法で複数の抗原をスクリーニングするのは手間がかかり、大量の患者サンプルを消費します。そのため、自己抗体をより大規模にプロファイリングするためには、新しい技術が必要です。

抗原マイクロアレイ技術は、自己抗体をマルチプ^{レックス方式で}プロファイリングすることを可能にするプロテオミクス技術です3。このプロセスの最初のステップでは、ロボットマイクロアレイを使用して抗原ライブラリをスライド表面に配列します。スライドを希釈した血清でプローブし、蛍光標識二次抗体を添加します。抗体の反応性は、マイクロアレイスキャナーでスライドをスキャンすることで可視化し、蛍光強度で定量化します。抗原マイクロアレイは、自己抗体のスクリーニングにおいてELISA技術に比べて複数の利点を提供します:1)複数の抗原に対する自己抗体を同時にプロファイリングするために必要な血清はマイクロリットルのみである、2)アレイ上にはナノリットルの抗原のみがスポットされるため、抗原を控えめに使用する、3)ELISAと比較して^感度が向上している、4)同時に可能になる、など。 複数の抗体アイソタイプを別々に検出します。抗原マイクロアレイは、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス^4-6などの自己免疫疾患における自己抗体のプロファイリングに使用されています。これら3つの疾患すべてにおいて、アレイを用いて自己抗体を大規模にプロファイリングすることで、疾患の病因に関する新たな知見が得られました。

ここでは、ニトロセルロースでコーティングされたスライドを使用して抗原マイクロアレイを生成するプロトコルについて説明します。この手法を使用して、タンパク質、ペプチド、細胞ライセートなどのさまざまな抗原をスライド上に配列できます。アレイは、抗原ライブラリーを保持するソースプレートに目的の抗原を含めることで、簡単にカスタマイズできます。さらに、一対の二次抗体を使用して、同じスライド表面上でIgGとIgMの反応性を分離する方法を示します。私たちは現在、この技術を最適化して、ヒトとマウスの両方で自己抗体を測定しています。

プロトコル

1.を希釈抗原との生成抗原マイクロアレイ

1. 0.2mg / mlの最終濃度までPBS中に抗原を希釈します。 9ピンのマイクロアレイの構成で二重に162までのユニークな抗原を印刷します。陽性対照として、抗原ライブラリ内のIgGおよびIgMの抗原が含まれます。唯一のネガティブコントロールとしてPBSを含めます。
2. 384ウェルソースプレートに各抗原の20μlのを追加します。 （9ピンは印刷に使用されている場合など 、9のグループにおける抗原を手配）プリントヘッドのセットアップをミラーグループ内のソースプレートに抗原を追加します。
3. アレイを印刷する直前まで-80℃で箔と凍結で覆いソースプレート。
4. 3×1分間脱イオン水で超音波処理浴中でそれらをインキュベートすることにより、固体マイクロアレイヤーピンを清掃してください。乾燥した後、マイクロアレイプリントヘッドのピンを配置するラックにピンを配置します。 9ピンの場合、3×3の構成を使用します。
5. プリントヘッドの数のピンを設定することにより、印刷実行のためのプログラムのマイクロアレイヤー、印刷、各スライド上のパッドの数、および各抗原のための複製スポットの数にスライド数。一般的に、9ピン、70スライド、2パッド/スライド、および各抗原について2複製スポットを使用します。プログラムのマイクロアレイは、抗原の異なるグループ間で水の中にピンを超音波処理します。
6. 解凍ソースプレートと100×gで1分間、その後遠心プレート。マイクロアレイ内の指定の場所にソースプレートを置きます。印刷する抗原の最初のグループを覆っている箔の部分を削除してください。
7. アレイヤー表面に印刷されていないスライドを手配し、印刷プログラムを実行します。アレイ機の加湿器でビルドで60％ - 湿度と室温での印刷スライドは55でアレイヤーに設定してください。
8. 抗原の各グループは、すべてのスライドに印刷された後、マイクロアレイヤーを一時停止します。ちょうど箔で印刷された抗原をカバーする（蒸発を防ぐため）、抗原の次のグループを印刷する明らかにする。印刷プログラムを続行します。
9. 全ての抗原が印刷された後、カバーソースPL-80℃で箔、凍結の新しい作品で食べました。スライドボックスと真空シールに印刷されたスライドを配置します。スライドは、翌日使用されるか、または最大1ヶ月後にすることができます。

2.希釈した血清を用いて抗原マイクロアレイをプロービング

1. インキュベーションチャンバーを使用してフレームにスライドを配置します。各アレイ表面にブロッキング緩衝液700μlの（2.5％[容量/容量]ウシ胎児血清（FCS）を、0.1％[容量/容量]をPBS中のTween 20）を追加します。
2. ウェットティッシュの切れ端で密封容器にフレームと場所の上に接着フィルムを置きます。ロッカーに4℃でO / Nインキュベートします。
3. 血清サンプル1を希釈：100をブロッキング緩衝液中。吸引物は、配列からブロッキング溶液を、各アレイ表面に希釈した試料500μlのを追加します。
4. 接着フィルムで覆い、揺動しながら4℃で1時間インキュベートします。
5. ブロッキング緩衝液中で二次抗体を希釈します。人間の研究のために、0.33 / mlのおよびCy5へのCy3標識したヤギ抗ヒトIgG抗体を希釈ヤギ抗フーマー標識0.25 / mlのにIgM抗体のn。マウス研究のために、Cy3の0.38 / mlのおよびCy5にヤギ抗マウスIgG抗体を標識希釈0.7μgの/ mlのヤギ抗マウスIgM抗体標識。
6. アレイからの吸引サンプルとアレイ表面をリンス緩衝液（PBS中0.1％のTween 20）で4回洗浄します。スライドに上にバッファ注ぎ、すぐにオフにフリック。
7. 各アレイ表面を洗浄し、揺り動かしながら室温で10分間インキュベートするブロッキング緩衝液700μlのを追加します。繰り返し洗浄ステップをさらに2回。
8. 各スライドの表面に希釈した二次抗体の500μlを添加して、接着フィルムでカバーしています。揺らしながら4℃で45分間インキュベートします。
9. スライドから吸引した二次抗体の混合物と上記のように4回すすいでください。洗浄液は、上記のように/希釈ブロッキング緩衝液700μLで3回スライド。
10. PBSに浸漬された金属スライドラック内のフレームと場所からスライドを削除します。軌道振とうしながら室温で20分間インキュベートします。 PBSの新たな容器に入れて、別の20メートルをインキュベート振盪しながらインチ
11. 脱イオン水15秒の容器にスライドラックを置きます。水の新たな容器にラックを配置し、別の15秒インキュベートします。
12. 室温で5分間、220×gで遠心分離し、スピンでELISAプレートアダプタのスライド、場所のスライドラックを乾燥させます。
13. スキャンの準備ができるまで、光を通さない箱にスライドを置きます。

3.スキャン抗原マイクロアレイおよびデータのエクスポート

1. Cy3およびCy5の蛍光シグナルを検出することができる、マイクロアレイスキャナーを用いてスキャンスライド。スキャナの光電子増倍管（PMT）のレベルを調整するために、唯一の二次抗体でプローブしたスライドをプレスキャン。
   注：このスライドはフルプラス（IgGおよびIgM）を含む、その上に印刷された抗原ライブラリと同様に負（PBS）のコントロールを持っている必要があります。プリスキャンは、最適なPMTの設定を見つけるために、迅速にユーザを可能にする低解像度スキャンです。
2. PMT値を設定しているので（Cy3のチャネル上の）ヒトIgGの機能とハム（Cy5のチャネル上の）IgM抗体の機能は、同様の蛍光強度中央値マイナス背景（MFI-B）（通常、40,000）を有しています。 PMTレベルは、「ハードウェア」ボタンを押すことによって設定されます。いったん設定すると、一定のこれらのPMTの設定を保持します。
3. 「スキャン」ボタンを押して、2チャンネルに関する実験スライドをスキャンします。各スキャンの後にスライド画像（両チャンネル）を保存します。
4. 「ファイル」ボタンを使用してマイクロアレイソフトウェアに分析しようとするスライドをロードします。
5. 「ファイル」ボタンを使用することにより、遺伝子の配列リスト（GAL）ファイルをロードします。 GALファイルは、アレイの機能のアイデンティティを持つアレイのレイアウトを持っています。
6. アレイの機能はできるだけテンプレートと一致するように、スキャンした画像の上に配列テンプレートを配置します。
7. 「整列」ボタンを押して、テンプレートを使用してすべてのブロックの機能を合わせます。プログラムは、ほぼ円形の機能の概要を見つけるだろうが、いくつかの手動調整が必要になることがあり。これらの調整は、機能モードに入ることによって作製することができます。ソフトウェアは、抗原のそれぞれについて、MFI-Bを計算します。
8. テキストフ​​ァイルとしてこれらの結果をエクスポートするには、「ファイル」ボタンを使用します。

4.マイクロアレイの有意性分析（SAM）との配列データの分析

1. Excelに個々のテキストフ​​ァイルをロードし、Cy3およびCy5のチャネルのためのMFI-Bを持つ列を識別します。
2. 重複した機能の平均値を計算します。
3. 任意の負のMFI-Bの場合は、10と負の数を置き換えるログベース2を計算することにより、次に100とにより生MFI-Bを分割したデータを変換します。
4. ログを分析し、以前に⁷説明したようにマイクロアレイの有意性分析（SAM）を使用してデータを形質転換しました。
5. 2基（ 例えば 、健常対照対患者）を用いた研究については、ラベル1のグループ"1"とグループ"2"秒である抗原の反応性を識別するために、SAMにおける2クラス、不対分析を使用してください両群間でignificantly異なる（q値<0.05）。
6. プレゼンテーション⁸用の画像を作るために、クラスタリングやヒートマップ作成ソフトウェアを使用してください。

結果

抗原は、384ウェルプレートに配置され、 図1に示すように、ロボットマイクロアレイヤーによりスライド上に印刷されている。 図2をインキュベーション室と処理した後にスキャンしたスライドとフレームに配置されたスライドを示している。 図3は、正および負の対照スライドを示しています。負のスライドのみ、二次抗体でプローブされ、陽性対照スライドは、全身性エリテマトーデスを有する患者からの血清でプローブされます。 2別々に標識された二次抗体を用いて、IgGおよびIgMの反応性は、同じスライドの表面に分離することができる。4図は、一本鎖DNA（ssDNA）およびIgG広い上リボソームP（リボP）に対する抗体に対するIgM抗体の蛍光強度を示します血清希釈の範囲。リボPに対する既知の反応性を有する全身性エリテマトーデスを有する患者から、この実験の陽性対照血清を用いました。リン耳応答は、すべての血清希釈上のIgMチャネルで観察されます。線形応答は約30,000...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、抗原マイクロアレイ技術を使用して自己抗体の定量を可能にします。抗原マイクロアレイは自己抗体をスクリーニングすることで、従来のELISA法に比べていくつかの利点を提供します。まず、核酸、タンパク質、ペプチド、お​​よび細胞溶解物を含む種々の抗原は、従って、自己抗体の多重スクリーニングを可能にする、ニトロセルロースでコーティングしたスライド上に配列することができます。抗原のナノリットルを各スライド上にスポットされているので、また、抗原の唯一のマイクログラムは、配列を生成するために必要です。 100サンプル希釈：血清のわずか5μlのが1でアレイ表面を探査するために必要とされる配列はまた、非常に少ない患者のサンプルを必要とします。最後に、ニトロセルロース上にスポットアレイは、自己抗体⁹をスクリーニングすることで、従来のELISAよりも感度であることが示されています。

自己抗体をスクリーニングするための抗原マイクロアレイの使用に加えて、アレイは、使用することができdは、モノクローナル抗体の特異性を規定するために、以前に^9-12

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リボソーム P0	Diarect	14100	0.2 mg/ml に希釈
	Jackson Immuno	009-000-003	0.2 mg/ml に希釈 PBS
		IgG	0.2 mg/mL に希釈
	Sigma-Aldrich	I5381
			0.2 mg/mL に希釈PBS二本鎖DNAで0.2 mg / mlに希釈
	Sigma-Aldrich	D1626	で0.2 mg / mlに希釈
	Sigma-Aldrich	D8899	0.2 mg / mlに希釈
	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	タイプのアレイアーは、適切な
固体印刷ピン	です Arrayit Corporation	SSP015
ロボットマイクロアレイ用ソフトウェア	Virtek	Chipwriter Pro
FASTスライド(2パッド)	GVSノーサアメリカ	10485317
FASTフレーム	GVSノースアメリカ	10486001
FASTインキュベーションチャンバー(2パッド)	GVSノーサアメリカ	10486242
384ウェルプレート	Whatman	7701-5101
プレートシー	ラーVWR	60941-062
ホイルプレートカバー	VWR	60941-124
Tween-20	フィッシャーサイエンティフィック	BP337-500
ウシ胎児血清	Invitrogen 12483020
Cy3 ヤギ抗ヒト IgG	ジャクソン免疫	109-165-096	50% グリエルコール
Cy5 ヤギ 抗ヒト IgM	ジャクソン免疫	109-175-129	50% グライエルコール
Cy3 ヤギの作業ストックを使用抗マウスIgG	ジャクソン免疫	115-165-071	は、50%グライエルコール
Cy5ヤギ反マウスIgM	ジャクソン免疫	115-175-075	作業ストックを使用し、50%グライアコール
マイクロアレイスキャナー	分子デバイス	軸on 4200A
マイクロアレイソフトウェア	分子デバイス	Genepix 6.1
クラスタリングソフトウェア	eisenlab.org	Cluster 3.0
Heatmap software	eisenlab.org	Treeview 1.60
Microarray 統計ソフトウェア	Stanford University	SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)