ショウジョウバエおよび哺乳動物の造血系は、 ショウジョウバエの造血を研究するための魅力的な遺伝モデル作り、多くの共通の特徴を共有します。ここでは、免疫組織化学のための主要な幼虫の造血器官の解剖と取り付けを示しています。また、循環血球と固着液晶セルを含む様々な幼虫の造血コンパートメントをアッセイする方法を記載しています。
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この記事について
サマリー
要約
多くの類似点は、 ショウジョウバエ、哺乳動物の適応免疫を特徴付けるリンパ系統を欠いていても、 ショウジョウバエおよび哺乳動物の造血系の間に存在し、ショウジョウバエおよび哺乳動物の造血は、いくつかの血液細胞系統を生成するために空間的および時間的に異なる段階で起こります。両方のシステムが成熟した系統を展開したり交換すると、血液前駆細胞の貯水池を維持します。造血系は、 ショウジョウバエや哺乳類が応答すると免疫の課題に適応することができます。重要なのは、生成、保守、および造血系の機能を制御する転写調節因子およびシグナル伝達経路は、哺乳動物へのハエから保存されています。これらの類似性は、 ショウジョウバエは遺伝的モデル造血開発および疾患に使用することができます。
ここでは詳細なアッセイは、 ショウジョウバエの幼虫の造血系を検討しました。に特に、我々は、血液細胞数および濃度を測定生体内で特定の成熟した系統を視覚化し、循環中および造血器官に血液細胞の免疫組織化学法を実行するための方法を概説します。これらのアッセイは、遺伝子発現の変化及びシグナリング、生存、増殖、および分化を含む細胞プロセスを明らかにすることができるし、造血に関する質問の様々な調査するために使用することができます。 ショウジョウバエで利用可能な遺伝子ツールと組み合わせて、これらのアッセイは、定義された遺伝的改変の際に造血系を評価するために使用することができます。具体的にここで説明されていないが、これらのアッセイは、造血系の、そのような感染症や食事などの環境変化の影響を調べるために使用できます。
概要
血液疾患における造血系の開発とその誤動作の座標転写因子およびシグナル伝達経路を調節する複雑なメカニズムはよくわかっていないままです。これらの転写因子およびシグナル伝達経路、ならびにそれらの調節は、非常にショウジョウバエおよび哺乳動物の造血1~5の間で保存されています。したがってショウジョウバエ造血系は、造血及び下地血液疾患を制御する分子機構を定義するための優れた遺伝的モデルを表します。
哺乳類と同様に、 ショウジョウバエは、造血の空間的および時間的に別個の相では、血球と呼ばれる、血液細胞を生成します。伝統的に、 ショウジョウバエの造血は、胚中胚葉にし、幼虫のリンパ腺に段階に限定されると考えられていました。最近の研究は、造血はまた、幼虫の無茎性のCLUで発生するという証拠を提供しますstersと6-8腹部大人インチplasmatocytesと液晶セル：すべての造血相は、成熟血球の2種類を生成します。 Plasmatocytesは食作用、先天性免疫、および創傷治癒に関与するマクロファージ様細胞です。クリスタル細胞がメラニン化のために必要なプロphenoloxidases、昆虫の免疫応答および創傷治癒に使用される反応が含まれています。幼虫の造血は、このような寄生蜂感染9,10などの特定の免疫の課題に応じて、lamellocyteと呼ばれる第三の成....
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プロトコル
1.循環血球濃度
- 6時間 - このアッセイのために、ほぼ同じ発達段階の幼虫を得るためには、女性は2の一定期間のための卵を産むようにすることによって卵のコレクションを制限します。
- 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS、 表1）を充填した皿のウェルの解剖に幼虫を集めます。
- 各幼虫のために、氷と10μlの上にマイクロチューブに10μlの1×PBSを置くクリーンな解剖パッドの上にPBSを1倍。照らさ実体顕微鏡ベースに解剖パッドを配置します。
- 組織上に置くことによって、個々の幼虫を乾燥解剖パッド上PBSのドロップにそれを転送する前に拭きます。
- ピンセットを使用して、静かに開いて涙、慎重に血リンパを解放するためにキューティクルを反転。
注：これは、潜在的に固着血球29をリリースする可能性があるのでキューティクルをこすりまたはジャブしないように注意してください。 - ピペットを用いて、解剖パッドから体液を収集します。共同を避けますこのような脂肪体として幼虫破片をllecting。
- マイクロ遠心チューブに血リンパを追加し、ピペッティングにより混合します。
注：いくつかのサンプルを一度に収集し、時間まで氷上に保持することができます。 - オプション：死細胞を染色し、排除するために等分に血リンパのサンプルとトリパン....
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結果
循環血球濃度
血球数は、幼虫の発育35全体で増加します。この方法は、血球数と濃度の違いを検出することを説明するために、関係なく、生物学的原因の、私たちは、遅延および非遅延幼虫の血球濃度を測定しました。 PTTH-産生ニューロン（PTTH>厳しい）の遺伝的アブレーションによる前胸腺刺激ホルモン（PTTH）の損失は、幼虫の発育36の遅延を生成します。 25℃に上昇させ、少なくとも8個体幼虫のプロトコル1で説明したように、各遺伝子型について、血球濃度を測定しました。 2時間の採卵後120時間で、（PTTH>厳しい）遅延幼虫あたりの平均血球濃度が制御幼虫（PTTH）あたりの平均血球濃度未満です。わずか9日後にそのコントロールの遅延幼虫のアプローチ当たりの平均血球濃度を行います（ 図1B）。この方法は、血球濃度の差を検出するために使用される別の例では、37の公開されています。 .......
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ディスカッション
遺伝的または環境の変化に応じ、ここで説明した4つの方法は、シグナル伝達、生存、増殖、および分化のような造血中に別個のプロセスを分析するために、個別に、または組み合わせて使用することができるショウジョウバエ造血は、動的なプロセスです。動物あたりの血球数が35増加し、リンパ腺の構造と遺伝子発現は、開発中に32を変更します 。これらのアッセイを実施する前に、したがって、女性が一定の時間卵を産むために、目的の幼虫発育段階を確認できるようにすることで、卵のコレクションを制限することが重要です。短い卵コレクション（未満6時間）のために、または女性が不健康または希少である、インスタンスについて、産卵は、食品中の割れ目を作成することによって促すことができます。このエタノール洗浄スパチュラで食品の一部を除去することによって達成することができます。過剰な液体が食品に蓄積する場合には、日光浴する組織ワイプを使用液体。 （ 図1Aを参照してください。）
単.......
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開示事項
著者は、彼らが何の競合や金融利害関係を持たないことを宣言します。
謝辞
私たちは、Matthew O'Connell、Maryam Jahanshahi、Andreas Jennyの支援に感謝します。血漿細胞特異的抗体のIstván Andó氏、ドームメソEBFP2のハエのUtpal Banerjee氏、antp>GFPのハエのJulian Martinez-Agosto氏、PTTHおよびptth>grimのハエのMichael O'Connor氏に感謝します。これらの方法は、Kimmel Foundation、Leukemia & Lymphoma Society、NIH/NCI R01CA140451、NSF 1257939、DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059、NIH/NCI T32CA078207の支援を受けて開発されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| PBSタブレット | MPバイオメディカル2810305 | ||
| 解剖皿 | コーニング | 7220-85 | |
| 微量遠心チューブ | デンビル | C2170 | |
| シリコーン解剖パッド、シルガード184キット | クレイデン(フィッシャーを通じて配布) | NC9644388(フィッシャーカタログ番号) | シルガードエラストマーキットの成分をメーカーの指示に従って混合することにより、シャーレで作られています。 |
| 実体顕微鏡 | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | ||
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess細胞計数室スライド | Invitrogen | C10283 | |
| 血球計算盤 | Hausser Scientific | 3200 | |
| トリパンブルーステイン | Life Technologies | T10282 | |
| ホルムアルデヒド | フィッシャー | BP531-500 | |
| トリトン | フィッシャー | BP151-500 | |
| トゥイーン 20 | フィッシャー | BP337-500 | |
| ウシ血清アルブミン | ロッキーマウンテンバイオロジカルズ | BSA-BSH-01K | |
| 正常ヤギ血清 | シグマ | G9023-10ML | |
| 正常ロバ血清 | シグマ | D9663-10ML | |
| 200プルーフエタノール | VWR | V1001 | |
| N-プロピルガレート | MPバイオメディカル102747 | ||
| グリセロール | VWR | EM-4750 | |
| DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6ウェルプレート | Corning | 351146 | |
| 12ウェルプレート | Corning | 351143 | |
| 顕微鏡カバーガラス、22 mm角 | Fisher | 12-544-10 | |
| カバーガラス、18 mm円形 | Fisher | 12-545-100 | |
| ガラス顕微鏡スライド | フィッシャー | 22-034-980 | |
| サーマルサイクラー | エッペンドルフ | E950010037 | マスターサイクラー EP グラジエント S |
| PCRチューブ | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24ウェルプレート | コーニング | 351147 | |
| 使い捨てトランスファーピペット | フィッシャー | 13-711-9AM | |
| 蛍光顕微鏡 | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
参考文献
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
- Crozatier, M.....
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