ショウジョウバエおよび哺乳動物の造血系は、 ショウジョウバエの造血を研究するための魅力的な遺伝モデル作り、多くの共通の特徴を共有します。ここでは、免疫組織化学のための主要な幼虫の造血器官の解剖と取り付けを示しています。また、循環血球と固着液晶セルを含む様々な幼虫の造血コンパートメントをアッセイする方法を記載しています。
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この記事について
サマリー
要約
多くの類似点は、 ショウジョウバエ、哺乳動物の適応免疫を特徴付けるリンパ系統を欠いていても、 ショウジョウバエおよび哺乳動物の造血系の間に存在し、ショウジョウバエおよび哺乳動物の造血は、いくつかの血液細胞系統を生成するために空間的および時間的に異なる段階で起こります。両方のシステムが成熟した系統を展開したり交換すると、血液前駆細胞の貯水池を維持します。造血系は、 ショウジョウバエや哺乳類が応答すると免疫の課題に適応することができます。重要なのは、生成、保守、および造血系の機能を制御する転写調節因子およびシグナル伝達経路は、哺乳動物へのハエから保存されています。これらの類似性は、 ショウジョウバエは遺伝的モデル造血開発および疾患に使用することができます。
ここでは詳細なアッセイは、 ショウジョウバエの幼虫の造血系を検討しました。に特に、我々は、血液細胞数および濃度を測定生体内で特定の成熟した系統を視覚化し、循環中および造血器官に血液細胞の免疫組織化学法を実行するための方法を概説します。これらのアッセイは、遺伝子発現の変化及びシグナリング、生存、増殖、および分化を含む細胞プロセスを明らかにすることができるし、造血に関する質問の様々な調査するために使用することができます。 ショウジョウバエで利用可能な遺伝子ツールと組み合わせて、これらのアッセイは、定義された遺伝的改変の際に造血系を評価するために使用することができます。具体的にここで説明されていないが、これらのアッセイは、造血系の、そのような感染症や食事などの環境変化の影響を調べるために使用できます。
概要
血液疾患における造血系の開発とその誤動作の座標転写因子およびシグナル伝達経路を調節する複雑なメカニズムはよくわかっていないままです。これらの転写因子およびシグナル伝達経路、ならびにそれらの調節は、非常にショウジョウバエおよび哺乳動物の造血1~5の間で保存されています。したがってショウジョウバエ造血系は、造血及び下地血液疾患を制御する分子機構を定義するための優れた遺伝的モデルを表します。
哺乳類と同様に、 ショウジョウバエは、造血の空間的および時間的に別個の相では、血球と呼ばれる、血液細胞を生成します。伝統的に、 ショウジョウバエの造血は、胚中胚葉にし、幼虫のリンパ腺に段階に限定されると考えられていました。最近の研究は、造血はまた、幼虫の無茎性のCLUで発生するという証拠を提供しますstersと6-8腹部大人インチplasmatocytesと液晶セル：すべての造血相は、成熟血球の2種類を生成します。 Plasmatocytesは食作用、先天性免疫、および創傷治癒に関与するマクロファージ様細胞です。クリスタル細胞がメラニン化のために必要なプロphenoloxidases、昆虫の免疫応答および創傷治癒に使用される反応が含まれています。幼虫の造血は、このような寄生蜂感染9,10などの特定の免疫の課題に応じて、lamellocyteと呼ばれる第三の成熟した血球タイプを、生成することができます。 Lamellocytesは、 ショウジョウバエの幼虫に敷設されたスズメバチの卵をカプセル化し、中和するために、plasmatocytesと液晶セルと組み合わせて、機能大、接着細胞です。寄生虫感染の非存在下で、lamellocytes野生型幼虫では見られません。メラニン質量はメラニン、カプセル化されたスズメバチの卵に似ています。多くの変異体ショウジョウバエ株は、寄生虫感染の非存在下での黒色腫瘤を開発します。 lamelloの存在球および/またはメラニンの塊は、造血異常を示すことができます。実際には、黒色質量表現型は、造血11-14に関与する遺伝子および経路を同定するために使用されています。
幼虫の造血系は、最も広く今日までに研究されています。それは、血リンパ中を循環血球、キューティクルの下にパターン化さ固着血球クラスター、およびリンパ腺に存在する血球から構成されています。リンパ腺は背容器に取り付けられた二国間のローブのシリーズです。リンパ腺の各一次ローブは、3つの主要な領域に分割されます。最も外側のゾーンは、皮質ゾーンとして知られており、成熟血球が含まれます。最も内側のゾーンは、髄質ゾーンと呼ばれ、静止血球前駆体から構成されています。第三ゾーン、後部のシグナリングセンターでは、幹細胞様ニッチとして機能リンパ腺の基部にある細胞の小グループです。初期の研究は、Notch 15-18のための重要な機能を確立しました、ヘッジホッグ19,20、JAK-STAT 18、および無翅21の活動は、幼虫のリンパ腺の開発を規制します。より最近の研究は、BMP 22、FGF-RAS 23、およびカバ24,25シグナリングはまた幼虫のリンパ腺内で機能することを実証しました。
ここで説明四幼虫造血アッセイ1を説明する）3） インビボでの液晶セルを可視化する、2）免疫組織化学のために循環血球を単離し、固定し、単位体積あたりの細胞数として定義血球濃度が、循環、及び4）、解剖固定、実装測定免疫組織化学のための腺リンパ。これらのアッセイは、幼虫の造血系内シグナル伝達経路の機能および規則を評価するために、造血読み出しとして使用することができます。これらのメソッドは、フィールドで以前に使用されてきたが、これらのアッセイの視覚的なドキュメントは、ごく最近8,26-30を開始しました。ここで引用したいくつかの刊行物は、ヘルプです同様の方法および造血マーカー26,31-33を説明FUL資源。さらに、TROLとバイキングは、リンパ腺の基底膜の有用なマーカーです。
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プロトコル
1.循環血球濃度
- 6時間 - このアッセイのために、ほぼ同じ発達段階の幼虫を得るためには、女性は2の一定期間のための卵を産むようにすることによって卵のコレクションを制限します。
- 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS、 表1）を充填した皿のウェルの解剖に幼虫を集めます。
- 各幼虫のために、氷と10μlの上にマイクロチューブに10μlの1×PBSを置くクリーンな解剖パッドの上にPBSを1倍。照らさ実体顕微鏡ベースに解剖パッドを配置します。
- 組織上に置くことによって、個々の幼虫を乾燥解剖パッド上PBSのドロップにそれを転送する前に拭きます。
- ピンセットを使用して、静かに開いて涙、慎重に血リンパを解放するためにキューティクルを反転。
注：これは、潜在的に固着血球29をリリースする可能性があるのでキューティクルをこすりまたはジャブしないように注意してください。 - ピペットを用いて、解剖パッドから体液を収集します。共同を避けますこのような脂肪体として幼虫破片をllecting。
- マイクロ遠心チューブに血リンパを追加し、ピペッティングにより混合します。
注：いくつかのサンプルを一度に収集し、時間まで氷上に保持することができます。 - オプション：死細胞を染色し、排除するために等分に血リンパのサンプルとトリパンブルーを混ぜます。それが細胞に対して毒性であるので、トリパンブルーを追加した3分以内に細胞を数えます。
- ピペッティングにより上下血球計数器室に10μLをロードする前にサンプルを混ぜます。
- 自動細胞カウンターを使用している場合は、セルサイズと円形のための適切なパラメータを設定します。通常の、ラウンド血球34を検出するために、80％の丸み-例えば、2μmの最小セルサイズ、22ミクロンの最大セルサイズ、および75の真円度を設定します。このようなlamellocytesとして大きく、紡錘状の血球を検出するために異なるパラメータを試してみてください。また、手動で血球を計数する血球計数器を使用しています。
2. Cirのculating血球免疫組織化学
- 6時間 - このアッセイのために、ほぼ同じ発達段階の幼虫を得るためには、女性は2の一定期間のための卵を産むようにすることによって卵のコレクションを制限します。
- 6または12ウェルプレートの各ウェルに1カバーガラスを置きます。
注：スクエアカバースリップ（22ミリメートル）6ウェルプレートとラウンドカバースリップ（直径18mm）に嵌合12ウェルプレートに収まります。 - 1×PBSで満たされた皿の井戸を解剖に幼虫を収集します。
- 各カバースリップの中央に5μlの1×PBSを置きます。
- 照らさ実体顕微鏡ベースにプレートを置きます。
- ワイプ組織上の個々の幼虫を乾燥した後、カバースリップ上でPBSに置きます。
- ピンセットを使用して、静かに涙と慎重にキューティクルを反転。幼虫の死骸を削除する前に、均等に血リンパを広めるためにそれを使用。
注：これは、潜在的に固着血球29をリリースする可能性があるのでキューティクルをこすりまたはジャブしないように注意してください。 - Repeaカバースリップあたり1幼虫の血リンパを収集し、すべての幼虫用にはt。血球は5のためにカバースリップに付着することを許可する- 。室温RTで8分の固定前に30分を超えないようにしてください。
- 室温で15分間、各カバースリップに7.5％ホルムアルデヒド（ 表1）の5μLを添加することにより、血球を修正しました。
- 洗浄は、1×PBSで3回カバースリップ。プレートをヒントし、各洗浄後、PBSを吸引します。次のステップで透過処理液の流出を防ぐために、カバースリップの周囲から過剰のPBSを除去するための吸引器を使用しています。
- 室温で20分間、各カバースリップに100μlの透過化溶液（ 表1）を加えます。
- ヒントと穏やかに透過処理液を吸引するためのプレートをタップします。
- プロバイダの仕様に従って抗体溶液（ 表1）を用いて一次抗体を希釈します。 12ウェルプレート中の少なくとも500μLをカバースリップに対する一次抗体溶液を加えます。6ウェルプレート中に少なくとも1.5ミリリットルを追加します。 4℃で一晩インキュベートします。
- 一次抗体溶液を除去し、オービタルシェーカー上で10分間、1×PBSでカバーグラスを洗って、3回。
- プロバイダーの仕様に応じて抗体溶液を用いて二次抗体を希釈します。 12ウェルプレート中のカバースリップに少なくとも500μlの二次抗体溶液を加えます。 6ウェルプレートのために少なくとも1.5ミリリットルを追加します。室温で少なくとも2時間インキュベートします。
- 二次抗体溶液を除去し、ステップ2.10のように、オービタルシェーカー上で10分間、1×PBSでカバーグラスを洗って、3回。
- 洗浄工程の間に、清浄なガラス顕微鏡組織ワイプを用いて70％エタノール（ 表1）を用いてスライド。各カバースリップのために、スライドガラス上の5μlの取り付けバッファー（ 表1）を配置。
注：二つのカバースリップは、1スライドに収まります。 - 最後のPBS洗浄を吸引。
- 慎重にプレートと場所、INVからカバースリップを除去するために鉗子を使用して、取付バッファの上に、erted。
注：顕微鏡スライド前の撮像に4℃で保存することができます。最大ストレージ時間は、使用される抗体の安定性に依存します。 6および12ウェルプレートを洗浄し、再利用することができます。
インビボでの液晶セルメラニン3.
- このアッセイのために、ほぼ同じ発達段階の幼虫を得るためには、女性は2〜6時間の一定期間のための卵を産むようにすることによって卵のコレクションを制限します。
- 開始する前に、60℃に加熱源を設定します。
注：10分間60℃のサーマルサイクラープログラムは、（25°Cホールドが続く）最適に動作しますが、水浴または他の加熱源は、長い熱が各幼虫の上に一貫して均等に分散されるように十分です。 - 1×PBS（ 表1）で満たされた皿の井戸を解剖に幼虫を収集します。
- 一度に一つ、組織ワイプとPCRチューブの底に置くの幼虫を乾燥させます。各幼虫を置きます別々のPCRチューブインチ（ 図3Aを参照してください。）
- 15分および/または穏やかに加熱前にチューブをタップ - 一貫性のある結果を得るために、10 4℃でチューブ内の幼虫を冷却することによりPCRチューブの下部にその幼虫のご滞在をお約束します。
- サーマルサイクラー（または水浴）にPCRチューブを置きます。 10分間60℃で加熱。
- 慎重に新鮮な1×PBSで満たされた皿の井戸を解剖にPCRチューブから幼虫を削除します。
- 組織上の乾燥幼虫はワイプや実体顕微鏡下イメージングのための平らな面を上に配置します。
- 複数の個人によって盲目的に幼虫の画像をスコア。
4.幼虫リンパ腺免疫組織化学
注：リンパ腺が少し背側の脳下記の幼虫の前端から約3分の1の長さに位置しています。 （ 図3Bの矢印を参照してください。）リンパ腺は、背の容器に隣接し、最も簡単に口のHOOに取り付けられて解剖され、KSまたは脳へ。野生型、3齢リンパ腺が非常に小さい構造体です。長さが200ミクロン - プライマリローブが約100あります。 （ 図4Aを参照してください。）
- 6時間 - このアッセイのために、ほぼ同じ発達段階の幼虫を得るためには、女性は2の一定期間のための卵を産むようにすることによって卵のコレクションを制限します。
- リンパ腺郭清
- 各実験条件については、24ウェルプレートの1ウェルにPBS 1×1 mlである（ 表1）を加えます。
- 各ウェル使い捨てトランスファーピペットを用いて、0.1％のPBST（ 表1）の1滴を追加します。
注：洗剤、例えばツイーン20などの組織は、ウェルの底に沈むできるように、表面張力を低下させるために添加されます。 - 氷の上で平板を置きます。
- 1×PBSで満たされた皿の井戸を解剖に幼虫を収集します。
- 照らさ実体顕微鏡をベースにクリーンな解剖パッドを配置します。 Smalのを配置する使い捨て転送ピペットを使用してくださいlはパッドの上に0.01％PBST（ 表1）の低下します。解剖用PBSTドロップに1幼虫を転送します。
- 鉗子の一組と幼虫後端から約4分の1の長さ、背側を上にして持ちます。
- すぐに幼虫を保持している鉗子の前方キューティクルをつかむために鉗子の別のペアを使用してください。口のフックが露出するまで、慎重に前方端部に向かってキューティクルを引っ張ります。
注：目的は、任意の内部構造を乱すことなく、キューティクルを剥離することです。 - キューティクルをリリースし、2に幼虫をカットするために、両方の鉗子を使用しています。 PBSTドロップから後端を削除します。
注：キューティクルが口のフックにすべての方法をはがしていない場合は、2に幼虫をカットし、後端を削除します。キューティクルのエッジを保持し、開口部を介して口のフックをプッシュするために鉗子の他のペアを使用する鉗子のペアを1つ使用します。これは、キューティクルを反転し、口のフックを公開します。これはalternとして使用することができ同様に解剖法を食べました。 - 安定性のためにキューティクル（腹側クチクラ、背側クチクラフラップのどちらか、または両方）を突き止めるために鉗子のペアを1つ使用します。
- 露出された口のフックをつかみ、静かにそれらを引き出すために鉗子の別のペアを使用してください。
注：これは内部の構造からキューティクルを分離します。理想的には、眼/触角成虫、脳、リング腺、および背容器に隣接リンパ腺は、口のフックに取り付けたままになります。 - まだ口のフックを押しながら、慎重にそのような唾液腺、脂肪体、および腸のように不要な構造を削除します。
注：脳は、口のフックから離れる場合は、リンパ腺はまだに取り付けられ、脳で採取される場合があります。この場合、腹側神経索の代わりに口のフックを保持します。 - ハンドルとして口のフックまたは腹側神経索を使用して、氷上のウェルにリンパ腺を含む解剖複合体を転送する。30分を超えないようにしてください固定の前に。
- 固定および免疫組織化学
- 実体顕微鏡をベースに、24ウェルプレートを置きます。
- 慎重に井戸からPBSTを除去するために、P200ピペットを使用してください。
注：空、隣のウェルは、一時的に廃棄物を堆積するのに有用です。 - ゆっくりウェルの側面下に200μlの3.7％ホルムアルデヒド（ 表1）を追加し、解剖組織が完全に水没していることを確認するために、プレートを旋回。
- 30分間氷上にプレートを返します。リンパ腺は、蛍光タンパク質（複数可）を発現した場合、光退色を防ぐために覆われたプレートを保ちます。
- 慎重に固定液を除去するために、P200ピペットを使用してください。
- ウェルに200μlの1×PBSを添加し、室温で5分間オービタルシェーカー上でプレートを配置することによって洗浄します。慎重にPBSを除去するために、P200ピペットを使用してください。
注：すべての実験条件のためのリンパ腺がDになるまで固定リンパ腺は、PBS中で氷上に放置することができますissectedと固定。 - 洗浄は、2回以上のステップを繰り返します。
- ウェルに200μlの透過化溶液（ 表1）を追加します。 RTで45分間、オービタルシェーカー上でプレートを設定します。
注：45分リンパ腺の透過性のための「ゴールドスタンダード」であるが、著者らは、わずか20分後に成功を持っています。 - P200ピペットで溶液を除去します。
- プロバイダの仕様に従って抗体溶液（ 表1）を用いて一次抗体を希釈します。ウェルに300μlの一次抗体溶液を追加し、解剖組織が完全に水没していることを確認してください。 4℃で一晩インキュベートします。
- 一次抗体を除去するために、P200ピペットを使用してください。
- ウェルに200μlの1×PBSを添加し、室温で10分間オービタルシェーカー上でプレートを配置することによって洗浄します。慎重にPBSを除去するために、P200ピペットを使用してください。
- 洗浄は、2回以上のステップを繰り返します。
- 二次Aを希釈プロバイダーの仕様に応じて抗体溶液とntibody。ウェルに300μlの二次抗体溶液を追加し、解剖組織が完全に水没していることを確認してください。 RTで少なくとも2時間、オービタルシェーカー上でインキュベートします。
- 二次抗体を除去し、ステップ4.3.12＆4.3.13で説明したように洗浄するためにP200ピペットを使用してください。最終洗浄後、PBSを削除しないでください。
- リンパ腺の取り付け
- 清浄なガラス顕微鏡を70％エタノール（ 表1）および組織ワイプを使用してスライドさせます。
- 各実験条件については、スライドガラス上にマウント緩衝液（ 表1）の1滴を置きます。
注：2つの条件は、1スライドに収まります。バッファボリュームをマウントするマウントするリンパ腺の数によって異なります。 20リンパ腺、10のための1μL - - 12、5以下のために0.5μlの約18のために2μLを使用してください。 - 照らさ実体顕微鏡のベース上の顕微鏡スライドを配置します。
- 一度に最大2つの条件については、ハンドルとして口のフックまたは腹側神経索を使用して、鉗子で取り付けバッファによくからリンパ腺のすべてを転送します。
- スペースプロセスにおける実装のバッファを拡散に均等に円形または長方形状の解剖組織。
- 解剖組織のそれぞれについて、個別に、背容器の下に鉗子の1トングをスライドさせ、ゆっくりと取り付けバッファの周辺に向かって引っ張ります。
注：これはリンパ液を解剖組織の残りの部分から外腺とガラス上のリンパ腺を平らに描画します。 - 1鉗子のトングとソーイングモーションを使用して、リンパ腺と脳の間に背容器を切りました。
- バッファの最外縁で、リンパ腺の反対側に解剖組織の残りの部分を移動します。
注：不要な解剖組織は、最終的にリンパ腺の周りの周囲を形成し、whic時のサポートとして機能しますhはカバースリップを休まます。 - リンパ腺のすべてが中央に配置するため、不要な解剖組織のいずれかを予約し、解剖組織から分離されるまで繰り返します。
- 2本の指の間カバースリップを取ります。カバースリップは、ホコリや指紋の自由であることを確認してください。必要に応じて、カバーガラスを洗浄するために組織がワイプを使用し、70％エタノール。
- カバーガラスのエッジを慎重に取り付け、バッファ上にカバーガラスを下げ、スライドガラスの縁に平行であることを保証します。
注：顕微鏡スライド前の撮像に4℃で保存することができます。最大ストレージ時間は、使用される抗体の安定性に依存します。 24ウェルプレートを洗浄し、再利用することができます。
5.イメージング
- 画像は、血球を固定し、製造業者の操作マニュアルに従って20X以上の倍率で、適切な標準的な蛍光または共焦点顕微鏡でリンパ腺を搭載しています。スタンド上の画像全体の幼虫メーカーの操作マニュアルに従って2倍の倍率でARD実体顕微鏡。
- 必要に応じて、デコンボリューションのためのソフトウェアプロバイダの指示に従ってください。
| 溶液 | 組成 | ストレージ | 注釈 |
| 1×PBS | 200 mg / Lの塩化カリウム | 室温 | |
| 200 mg / Lのリン酸二水素カリウム | |||
| 8,000 mg / Lの塩化ナトリウム | |||
| 1,150 mg / Lのリン酸ナトリウム二塩基性 | |||
| dH 2 O | |||
| 固定液 | 1×PBS中の3.7％または7.5％ホルムアルデヒド | 暗所で室温 | ホルムアルデヒドは有毒です。 |
| 透過液/抗体希釈液 | 0.4％トリトン | 4°C | 標準式は、0.4％トリトンを使用していますが、著者は、成功とのTween 20 0.1％を使用します。プロバイダの推奨濃度に応じて一次および二次抗体を希釈するために使用します。 |
| 5％ウシ血清アルブミン、正常ヤギ血清、または正常ロバ血清 | |||
| 1×PBS | |||
| 70％エタノール | dH 2 O中70％200プルーフのエタノール | 室温 | |
| 取付バッファ | 0.5％のN-プロピル没食子酸 | 暗所で4°C | N-プロピルガレートは有害です。 DAPIは変異原です。 |
| 80％グリセロール | |||
| オプション：を1μg/ mlのDAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール） | |||
| 1×PBS | |||
| 0.1％PBST | 1×PBS中0.1％のTween 20 | 室温 | |
| 0.01％PBST | 0.1％の1:10希釈PBST | 室温 |
この議定書で使用される表1.ソリューション。
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結果
循環血球濃度
血球数は、幼虫の発育35全体で増加します。この方法は、血球数と濃度の違いを検出することを説明するために、関係なく、生物学的原因の、私たちは、遅延および非遅延幼虫の血球濃度を測定しました。 PTTH-産生ニューロン（PTTH>厳しい）の遺伝的アブレーションによる前胸腺刺激ホルモン（PTTH）の損失は、幼虫の発育36の遅延を生成します。 25℃に上昇させ、少なくとも8個体幼虫のプロトコル1で説明したように、各遺伝子型について、血球濃度を測定しました。 2時間の採卵後120時間で、（PTTH>厳しい）遅延幼虫あたりの平均血球濃度が制御幼虫（PTTH）あたりの平均血球濃度未満です。わずか9日後にそのコントロールの遅延幼虫のアプローチ当たりの平均血球濃度を行います（ 図1B）。この方法は、血球濃度の差を検出するために使用される別の例では、37の公開されています。 ...
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ディスカッション
遺伝的または環境の変化に応じ、ここで説明した4つの方法は、シグナル伝達、生存、増殖、および分化のような造血中に別個のプロセスを分析するために、個別に、または組み合わせて使用することができるショウジョウバエ造血は、動的なプロセスです。動物あたりの血球数が35増加し、リンパ腺の構造と遺伝子発現は、開発中に32を変更します 。これらのアッセイを実施する前に、したがって、女性が一定の時間卵を産むために、目的の幼虫発育段階を確認できるようにすることで、卵のコレクションを制限することが重要です。短い卵コレクション（未満6時間）のために、または女性が不健康または希少である、インスタンスについて、産卵は、食品中の割れ目を作成することによって促すことができます。このエタノール洗浄スパチュラで食品の一部を除去することによって達成することができます。過剰な液体が食品に蓄積する場合には、日光浴する組織ワイプを使用液体。 （ 図1Aを参照してください。）
単...
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開示事項
著者は、彼らが何の競合や金融利害関係を持たないことを宣言します。
謝辞
私たちは、Matthew O'Connell、Maryam Jahanshahi、Andreas Jennyの支援に感謝します。血漿細胞特異的抗体のIstván Andó氏、ドームメソEBFP2のハエのUtpal Banerjee氏、antp>GFPのハエのJulian Martinez-Agosto氏、PTTHおよびptth>grimのハエのMichael O'Connor氏に感謝します。これらの方法は、Kimmel Foundation、Leukemia & Lymphoma Society、NIH/NCI R01CA140451、NSF 1257939、DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059、NIH/NCI T32CA078207の支援を受けて開発されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| PBSタブレット | MPバイオメディカル2810305 | ||
| 解剖皿 | コーニング | 7220-85 | |
| 微量遠心チューブ | デンビル | C2170 | |
| シリコーン解剖パッド、シルガード184キット | クレイデン(フィッシャーを通じて配布) | NC9644388(フィッシャーカタログ番号) | シルガードエラストマーキットの成分をメーカーの指示に従って混合することにより、シャーレで作られています。 |
| 実体顕微鏡 | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | ||
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess細胞計数室スライド | Invitrogen | C10283 | |
| 血球計算盤 | Hausser Scientific | 3200 | |
| トリパンブルーステイン | Life Technologies | T10282 | |
| ホルムアルデヒド | フィッシャー | BP531-500 | |
| トリトン | フィッシャー | BP151-500 | |
| トゥイーン 20 | フィッシャー | BP337-500 | |
| ウシ血清アルブミン | ロッキーマウンテンバイオロジカルズ | BSA-BSH-01K | |
| 正常ヤギ血清 | シグマ | G9023-10ML | |
| 正常ロバ血清 | シグマ | D9663-10ML | |
| 200プルーフエタノール | VWR | V1001 | |
| N-プロピルガレート | MPバイオメディカル102747 | ||
| グリセロール | VWR | EM-4750 | |
| DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6ウェルプレート | Corning | 351146 | |
| 12ウェルプレート | Corning | 351143 | |
| 顕微鏡カバーガラス、22 mm角 | Fisher | 12-544-10 | |
| カバーガラス、18 mm円形 | Fisher | 12-545-100 | |
| ガラス顕微鏡スライド | フィッシャー | 22-034-980 | |
| サーマルサイクラー | エッペンドルフ | E950010037 | マスターサイクラー EP グラジエント S |
| PCRチューブ | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24ウェルプレート | コーニング | 351147 | |
| 使い捨てトランスファーピペット | フィッシャー | 13-711-9AM | |
| 蛍光顕微鏡 | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
参考文献
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