Method Article

ラット精巣挙筋の細動脈における無細胞層の可視化と定量化

DOI:

10.3791/54550

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October 19th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore, 2Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

In This Article

Summary

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この研究は、in vivoの無細胞層を可視化するためのラットクレマスター筋の外科的準備を示しています。この研究では、セルフリー層幅測定の精度に影響を与える重要な要因について説明します。

Abstract

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無細胞層は、赤血球を欠いた微小血管の流れにおける頭頂血漿層として定義されます。in vivoの無細胞層幅とその時空間変動を測定することで、微小循環における血行動態を包括的に理解することができます。本研究では、生体内顕微鏡システムと高速度ビデオカメラを併用し、細動脈の無細胞層幅をin vivoで定量化しました。Sprague-Dawleyラットの火葬筋は、血流を視覚化するために外科的に外部化されました。また、セルフリー層幅の画像処理と解析を自動化するために、カスタムメイドのイメージングスクリプトも開発されました。このアプローチにより、従来の手動測定よりも一貫して時空間変動を定量化できます。ただし、測定の精度は、ブルーフィルターの使用と適切なしきい値アルゴリズムの選択に部分的に依存します。具体的には、ブルーフィルターを使用した場合と使用しない場合で取得した画像のコントラストと品質を評価しました。さらに、5つの異なる画像ヒストグラムベースの閾値化アルゴリズム(Otsu、最小、インターモード、反復選択、ファジーエントロピー閾値)を比較し、セルフリー層幅の決定における違いを示しました。

Introduction

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In vivoの動物研究は、人間の生理学と病理を理解するための基礎科学に役立っています。特に、in vivo微小血行動態研究は、血液の異常なレオロジー状態によって変化する微小循環機能の潜在的な障害を解明することができます。これまでの多くの微小血行動態研究1では、ラット火葬筋モデルを用いて微小血管の血流を可視化してきました。火葬筋は、精巣を囲む横紋筋の薄い層です。したがって、筋肉内の血流は、外科的曝露によってトランスイルミネーション顕微鏡で視覚化することができます。これにより、蛍光剤や造影剤を使用せずに生体内の血流画像を取得することができます。また、腹部大動脈閉塞2により上流の血流を減少させることにより、筋網の全血液灌流を制御することができる。これらの利点により、クレマスター筋モデルは、微小血管1,3における無細胞層(CFL)の形成を調査するために広く使用されています。

CFL幅は、微小循環における顕著な血行動態パラメータであり、微小循環機能の調節におけるその重要な役割について非常に興味深いものでした。CFLは、赤血球(RBC)のせん断誘発性横方向内方移動によって形成されます4。その結果、この移動により、血管壁付近の赤血球が枯渇し、最終的には無細胞プラズマ層が生じます。したがって、頭頂CFLは、RBCコアから組織への酸素(O2<....

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Protocol

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この研究は、シンガポール国立大学の施設内動物管理使用委員会（承認されたプロトコルがない。R15-0225）によるものです。

動物モデルの1外科の準備

  1. 血管カニューレ挿入
    1. ケタミン（37.5 mg / mlで）および腹腔内を介して、キシラジン（5 mg / mlで）カクテル（IP）注射（2ミリリットル/ kg）でグラム - （7週齢6）（203±20）のオスのSprague-Dawleyラットを麻酔。針をリキャップまたは注射後に注射器からそれを削除しないでください。
    2. 動物は（爪先つまんで確認）、麻酔された後、37℃で、その体温を維持するために加温パッド上に置きます。そっと肩甲骨、前頸部、下腹部、内側後肢と陰嚢の毛を剃ります。ゆっくりと粘着紙テープを使用して足を拘束。
    3. 見ながら顕微解剖ハサミと角度のついたピンセットを使用して、すべての外科的処置を実行します実体顕微鏡。手術中にけがを防ぐために、パンク防止トレイ上のすべての鋭い手術器具を配置します。
    4. 切開を行う前に、すべての手術部位を交互にヨウ素、70％アルコールで3回スクラブ。 30 IU / mlのヘパリン - 食塩水溶液を持つすべてのカテーテルをフラッシュします。
    5. 右頸静脈の上に手術用ハサミを使用して、肩甲骨1.5センチ正中皮膚切開 - 1を加えます。頸静脈を露出させるために鈍的切開に....

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Results

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in vivoでの CFLの可視化は、動物の外科的な準備に大きく依存しています。過度の失血または拡張手術時間は収差を衝撃や血流ために動物を供することができます。手術と実験中加熱パッドだけでなく、カスタマイズされたプラットフォームを使用して、組織の温度の維持はまた、ラットの生理学的条件を維持するために重要です。顕微鏡システム100 Wのハロゲンランプを使用して、識別可能な組織の損傷があっても、実験の終了時に観察されませんでした。

図2Aは、CFLがRBCコアと内側容器壁（ 図2C）との間で観察することができるラット精巣挙筋における非分枝動脈を介して典型的なRBCの流れを示しています。実験中のこれらの構成要素間の良好なコントラストがCFL幅測定の精度を確保するために重要です。画像解析の初期位相を含みます内側の血管壁を検出します。容器に垂直な分析線に沿った光強度分布を取得することにより、場所が暗いから遷移が2ピクセル（ 図2B）の上に点灯することをピークに近似されま.......

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Discussion

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CFL幅の測定は、微小循環における血行動態のより良い理解のために不可欠です。具体的には、CFL幅の測定は腸間膜6で行われた、24および脳25微小循環をspinotrapezius。 in vivoでの CFL幅の従来の測定は、記録されたビデオフレームの手動検査によって推定に制限されていました。マニュアル測定は、視覚的にRBCコアと血管壁15,16の境界を特定する前に、いくつかの連続するビデオフレームの平均化を必要としました。別の研究では、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）は、赤血球及びローダミンBイソチオシアネート（RITC）はプラズマがネコ脳微小血管25の平均CFL幅を決定するために使用された標識-標識。これらの以前の測定方法は非常に時間がかかり、CFLのwiの空間分解能と時間分解能を制限する蛍光標識のための追加の手順が必要ですDTH測定。対照的に、効果的な画像セグメント化及び分析に高速度カメラの記録を結合することによって、技術はここで実証RBCの大きさよりも小さいオーダーの空間分解能（0.42ミ.......

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Disclosures

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

Acknowledgements

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この作業は、National Medical Research Council (NMRC)/Cooperative Basic Research Grant (CBRG)/0078/2014の支援を受けました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
生体内顕微鏡オリンパスBX51WI装置
ハイスピードカメラフォトロン1024PCI装置
ブルーフィルターHOYAB390装置
圧力センサー&バイオパックシステムバイオパックシステムTSD104A、MP100装置
温度調節器島電SR1装置
Plasma Lyte ABaxterNDC:0338-022137°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前に
生理食塩水0.9%ブラウン
ヘパリン(5,000 IU / ml)LEO
PE-10ポリエチレンチューブベクトンディキンソン427400.024"OD x .011" ID 
PE-50 ポリエチレン チューブベクトン ディキンソン427411.038" OD x .023" ID
PE-205 ポリエチレン チューブベクトン ディキンソン427446.082" OD x .062" ID
2-0 非吸収性シルク縫合糸Deknatel113-S
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マイクロ解剖鉗子ケントサイエンティフィックINS15915手術器具
アイリス鉗子 1 x 2 歯ケントサイエンティフィックINS15917サージカル器具
血管カニューレ挿入鉗子ケントサイエンティフィックINS500377手術器具
マイクロハサミケントサイエンティフィックINS14177手術器具
アイリスシザーケントサイエンティフィックINS14225手術器具
ベッセルクリップケントサイエンティフィックINS14120手術器具
ジェミニ焼灼システムBraintree ScientificGEM 5917手術器具
糸 ック

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).
  2. Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S.

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