ラット精巣挙筋の細動脈における無細胞層の可視化と定量化

Summary

この研究は、in vivoの無細胞層を可視化するためのラットクレマスター筋の外科的準備を示しています。この研究では、セルフリー層幅測定の精度に影響を与える重要な要因について説明します。

Abstract

無細胞層は、赤血球を欠いた微小血管の流れにおける頭頂血漿層として定義されます。in vivoの無細胞層幅とその時空間変動を測定することで、微小循環における血行動態を包括的に理解することができます。本研究では、生体内顕微鏡システムと高速度ビデオカメラを併用し、細動脈の無細胞層幅をin vivoで定量化しました。Sprague-Dawleyラットの火葬筋は、血流を視覚化するために外科的に外部化されました。また、セルフリー層幅の画像処理と解析を自動化するために、カスタムメイドのイメージングスクリプトも開発されました。このアプローチにより、従来の手動測定よりも一貫して時空間変動を定量化できます。ただし、測定の精度は、ブルーフィルターの使用と適切なしきい値アルゴリズムの選択に部分的に依存します。具体的には、ブルーフィルターを使用した場合と使用しない場合で取得した画像のコントラストと品質を評価しました。さらに、5つの異なる画像ヒストグラムベースの閾値化アルゴリズム(Otsu、最小、インターモード、反復選択、ファジーエントロピー閾値)を比較し、セルフリー層幅の決定における違いを示しました。

Introduction

In vivoの動物研究は、人間の生理学と病理を理解するための基礎科学に役立っています。特に、in vivo微小血行動態研究は、血液の異常なレオロジー状態によって変化する微小循環機能の潜在的な障害を解明することができます。これまでの多くの微小血行動態研究¹では、ラット火葬筋モデルを用いて微小血管の血流を可視化してきました。火葬筋は、精巣を囲む横紋筋の薄い層です。したがって、筋肉内の血流は、外科的曝露によってトランスイルミネーション顕微鏡で視覚化することができます。これにより、蛍光剤や造影剤を使用せずに生体内の血流画像を取得することができます。また、腹部大動脈閉塞²により上流の血流を減少させることにより、筋網の全血液灌流を制御することができる。これらの利点により、クレマスター筋モデルは、微小血管^1,3における無細胞層(CFL)の形成を調査するために広く使用されています。

CFL幅は、微小循環における顕著な血行動態パラメータであり、微小循環機能の調節におけるその重要な役割について非常に興味深いものでした。CFLは、赤血球(RBC)のせん断誘発性横方向内方移動によって形成^{されます4。}その結果、この移動により、血管壁付近の赤血球が枯渇し、最終的には無細胞プラズマ層が生じます。したがって、頭頂CFLは、RBCコアから組織への酸素(O₂)送達、および^RBC5,6による一酸化窒素(NO)の捕捉に対する拡散障壁となる。さらに、NOの生成は、CFL幅^7,8の動的変動によっても調整することができます。したがって、微小循環における血流をよりよく理解するためには、ガス輸送と微小循環における恒常性の調節の両方におけるCFLの役割を完全に確認する必要があります。最近の研究では、微小循環^9-12におけるCFLの血行動態とガス輸送機能の橋渡しに焦点を当てています。さらに、別の一連の研究では、RBC凝集の病理学的上昇がCFL形成と組織^13,14の_O2およびNOバイオアベイラビリティに対するその影響をどのように調節するかについても調査されています。

CFLの役割は、容器の直径に対するCFLの幅の相対的なサイズが顕著な微小循環においてより重要になります。そのためには、in vivo血流中のCFLを定量化する効果的なアプローチが必要です。特に、画像取得と画像解析は、CFL幅測定の精度を決定する2つの重要な要素です。組織の血流をうまく視覚化するには、動物モデルの適切な外科的準備を行う必要があります。さらに、主に人為的エラーによって引き起こされる従来の手動測定の限界を克服するために、適切な画像分析技術が必要です^15,16。デジタル画像処理のための光学計測と計算能力の進歩により、CFL幅^17-19のより正確で一貫した測定を実現することが可能になりました。それにもかかわらず、これらの測定の精度は、画像ベースであるため、最終的には画像の品質に依存します。

したがって、この研究では、in vivo CFL幅の測定に影響を与える要因を調査します。特に、ラット火葬筋の細動脈のCFL幅を測定するための外科的準備とデジタル画像解析のデモンストレーションに焦点を当てました。

Protocol

この研究は、シンガポール国立大学の施設内動物管理使用委員会（承認されたプロトコルがない。R15-0225）によるものです。

動物モデルの1外科の準備

1. 血管カニューレ挿入
   1. ケタミン（37.5 mg / mlで）および腹腔内を介して、キシラジン（5 mg / mlで）カクテル（IP）注射（2ミリリットル/ kg）でグラム - （7週齢6）（203±20）のオスのSprague-Dawleyラットを麻酔。針をリキャップまたは注射後に注射器からそれを削除しないでください。
   2. 動物は（爪先つまんで確認）、麻酔された後、37℃で、その体温を維持するために加温パッド上に置きます。そっと肩甲骨、前頸部、下腹部、内側後肢と陰嚢の毛を剃ります。ゆっくりと粘着紙テープを使用して足を拘束。
   3. 見ながら顕微解剖ハサミと角度のついたピンセットを使用して、すべての外科的処置を実行します実体顕微鏡。手術中にけがを防ぐために、パンク防止トレイ上のすべての鋭い手術器具を配置します。
   4. 切開を行う前に、すべての手術部位を交互にヨウ素、70％アルコールで3回スクラブ。 30 IU / mlのヘパリン - 食塩水溶液を持つすべてのカテーテルをフラッシュします。
   5. 右頸静脈の上に手術用ハサミを使用して、肩甲骨1.5センチ正中皮膚切開 - 1を加えます。頸静脈を露出させるために鈍的切開により筋膜を分離し、これをポリエチレンチューブ（PE-50）5-0絹縫合糸を用いて、ヘパリン生理食塩水で満たされてカニューレを挿入。補足麻酔を注入する際に必要な（1/3初期投与量の1/2に、静脈内（IV））手術と実験の過程を通して。
   6. 気道開存性を維持するために気管切開を行います。前頸部エリア1.5センチ切開 - 1を加えます。所定の位置にカテーテルを固定するために2-0絹縫合糸でポリエチレンチューブ（PE-205）を使用して、気管にカニューレを挿入。
   7. 血圧を測定します大腿動脈にカニュレーションを通じて。後肢の左内側面で1.5センチ切開 - 1を加えます。鈍的切開によって大腿動脈を分離します。ヘパリン生理食塩水は、5-0絹縫合糸を用いて充填したポリエチレンチューブ（PE-10）と大腿動脈にカニューレを挿入。
2. 精巣挙筋の準備と流れの可視化
   1. それを拡張するために陰嚢の頂部を通って5-0絹縫合糸を挿入します。陰嚢の腹側表面に沿って切開を行います。露出した筋肉に、定期的に暖かい等張液（pH 7.4、37℃）を適用します。
   2. 慎重に周囲の結合組織を削除し、徹底的に綿棒を使用して。
   3. 精巣挙筋の頂点を通って5-0絹縫合糸を挿入します。同じ長さの2つのピースに縫合糸をカットし、それぞれの側に結び目を作ります。 2ノットの間の筋肉をカットし、静かに縫合糸を引っ張ることにより、カスタマイズされた透明なプレキシグラスのプラットフォームにそれを伸ばします。フィックスブルータックとプラットフォームへの縫合糸の終わり。
      注：周囲の結合組織の徹底的な除去は、最適な画像コントラストを得る上で重要です。
   4. 5〜6凝視が行われるまで、ステップ1.2.3を繰り返します。慎重に高温焼灼を使用して、精巣上体から精巣挙筋を取り除きます。組織の脱水を防ぐために露出した筋肉に温かい等張液を表面かん流します。
      1. ガーゼの折り返し片と精巣挙筋を囲みます。ポリビニルフィルムで露出した筋肉をカバーしています。フィルムとガーゼ片は、水浸顕微鏡対物レンズ（ 図1A）のための温かい等張液を保持するために浅い盆地を形成しています。
   5. 生体顕微鏡（ 図1C）の動物ステージ上に動物を転送します。連続圧力監視（ 図1E）のための生理的データ収集システムに動脈カニュレーションを接続します。
   6. 筋肉temperatを維持動物のプラットフォーム（ 図1B）の下に取り付けられた発熱体と35℃でURE。加熱素子（ 図1D）のパワー・コントローラへの負のフィードバックを提供するために、筋肉の横に温度プローブを配置します。
   7. 環境と平衡に15分間のステージ上で動物を残します。
   8. 40X水浸対物レンズと長い作業冷却器を備えた生体顕微鏡で血液の流れを可視化します。
   9. 血管の直径平面上に顕微鏡を集中させるためにはRBCコア、CFLと血管壁との間に明確な映像のピントやコントラストに基づいて分岐していない細動脈を（<60μm）で、選択してください。垂直方向に血管壁を整列させるために、顕微鏡に取り付けたカメラを回転させます。
   10. 1秒間3,000 /秒のフレームレートの高速ビデオカメラを使用して血流を記録します。画像品質を維持するために、非圧縮8ビットグレースケールAVI形式として記録されたビデオを保存します。
       注意： 3000フレーム/秒の最小記録フレームレートがCFLの測定は、生理的細動脈の流れの条件の下で少なくとも一回RBCあたりに実行できることを確認することをお勧めします。
   11. 赤血球と血漿との間のコントラストを高めるために、510 nmの - 310で394 nmおよびスペクトル帯域の波長でピーク透過と青色フィルタを使用してください。
       注：光スペクトルは、微小光源（100 Wハロゲンランプ）からの青色フィルタを通過したことを確認し、任意の潜在的な組織の損傷を防止するために、低光強度です。
   12. 実験の最後に、ペントバルビタールナトリウムの過剰投与により動物を安楽死させます。

2.画像解析

1. CFL幅測定のための前処理
   1. MATLABを開き、「CFL_pre.m 'ファイルを実行します。 （これと他のMATLABファイルはで見つけることができますIP ">補足MATLABアーカイブ。）
   2. 分析するために、ビデオファイルを選択するには、「ファイルを開く」をクリックしてください。
   3. 垂直方向に血管壁を整列させるために「回転」スライダを調整します。
      注：ユーザーは「グリッドオン]ラジオボタンを選択することで、血管の位置合わせのための補助グリッド線を表示し、「ズーム」スライダーをスライドさせることにより、画像のズームレベルを調整することができます。
   4. 血管の位置合わせを確認する「確認して編集」ボタンをクリックします。
   5. 関心領域（ROI）を定義する」に設定したROI作物へ」ボタンをクリックします。配置画像がポップアップウィンドウに表示されます。画像上に長方形の目標を調整し、二重のROIをクリックして確認します。画像のトリミングが必要とされない場合は、このステップをスキップします。
      注：のみ容器からCFL幅を分析するためのROI内の単一の容器が含まれます。必要に応じて、元の形にイメージを復元するには、「リセットイメージ」ボタンをクリックします。
   6. クリック9; '（BMP'形式の連続したビットマップ画像の8ビットグレースケール）に、すべての編集されたビデオフレームを抽出するためにボタン 'イメージを抽出します。抽出された画像は、選択したビデオファイルと同じ名前のフォルダに格納されています。
2. CFL幅の測定
   1. MATLABを開き、「CFL_measure.m 'ファイルを実行します。
   2. 抽出された画像を含むフォルダを選択するには、「[フォルダの選択]をクリックします。
   3. 画像を含むフォルダをクリックし、「フォルダの選択」をクリックします。フォルダ内の最初の画像フレームがロードされ、「画像のヒストグラム」パネルで、その灰色の強度ヒストグラムと一緒に、「グレースケール画像」パネルに表示されます。
   4. 分析を実行するために、リストボックスから所望の画像フレームを選択し、そうでなければ第1の画像フレームが選択されます。
   5. 位置で決定された画像で血管内壁を識別するために、「血管壁を探す」をクリックします暗いから2ピクセル以上の光に光強度プロファイルのピーク遷移します。
   6. 「塩、コショウ」ノイズを低減する画像にメディアンフィルタを適用するには、「メジアンフィルタ」を確認してください。
   7. 画像のコントラストを向上させるために、デジタル画像強度を調整する「自動コントラスト」を確認してください。
   8. τ（RBCコア）以下のグレーレベルでτ上記のグレーレベル（CFL）と白画素と黒画素 - 自動的に2つのクラスにグレイレベルを分割しきい値値（τ）を決定するリストボックスのしきい値アルゴリズムを選択します。
      注：自動化された閾値処理アルゴリズムのいずれも適切な画像閾値化を提供しない場合は別の方法としては、手動のしきい値を使用します。 「マニュアル」のラジオボタンをクリックして、手動のしきい値の値を定義するには、スライダを調整します。
   9. 、CFL幅の空間的変化を測定する「ピクセル解像度」ボックス内のピクセル解像度（解像度を入力するにはこの実験で0.42ミクロン/ピクセル）でした。
   10. CFL幅の空間的な変化を得るために「計算」ボタンをクリックします。集計形式でCFL幅データをエクスポートするには、「書き出した.csv]をクリックします。
   11. 、血管に沿った特定の分析線でCFL幅の時間変化を測定する「時間変化]ラジオボタンをクリックして、フレームレート情報を入力します（この実験で使用されるフレームレートは3000フレーム/秒でした）。
   12. それぞれ、「フレームを起動 'と'最後のフレーム」ボックスに最初のフレームおよび分析のための画像の最後のフレームを入力します。
   13. 「分析ライン」のスライドバーをスライドさせることにより、血管に沿って分析線の位置を選択します。 「グレースケール画像」と「バイナリイメージ」の両方に示されている分析線の位置を確認してください。
   14. CFL幅の時間変化を取得するために「計算」をクリックしてください。 CLICKを表形式でCFL幅データをエクスポートするには、「エクスポートは.csvファイル」。

Results

in vivoでの CFLの可視化は、動物の外科的な準備に大きく依存しています。過度の失血または拡張手術時間は収差を衝撃や血流ために動物を供することができます。手術と実験中加熱パッドだけでなく、カスタマイズされたプラットフォームを使用して、組織の温度の維持はまた、ラットの生理学的条件を維持するために重要です。顕微鏡システム100 Wのハロゲンランプを使用して、識別可能な組織の損傷があっても、実験の終了時に観察されませんでした。

図2Aは、CFLがRBCコアと内側容器壁（ 図2C）との間で観察することができるラット精巣挙筋における非分枝動脈を介して典型的なRBCの流れを示しています。実験中のこれらの構成要素間の良好なコントラストがCFL幅測定の精度を確保するために重要です。画像解析の初期位相を含みます内側の血管壁を検出します。容器に垂直な分析線に沿った光強度分布を取得することにより、場所が暗いから遷移が2ピクセル（ 図2B）の上に点灯することをピークに近似されま...

Discussion

CFL幅の測定は、微小循環における血行動態のより良い理解のために不可欠です。具体的には、CFL幅の測定は腸間膜⁶で行われた^、24および脳²⁵微小循環をspinotrapezius。 in vivoでの CFL幅の従来の測定は、記録されたビデオフレームの手動検査によって推定に制限されていました。マニュアル測定は、視覚的にRBCコアと血管壁^15,16の境界を特定する前に、いくつかの連続するビデオフレームの平均化を必要としました。別の研究では、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）は、赤血球及びローダミンBイソチオシアネート（RITC）はプラズマがネコ脳微小血管²⁵の平均CFL幅を決定するために使用された標識-標識。これらの以前の測定方法は非常に時間がかかり、CFLのwiの空間分解能と時間分解能を制限する蛍光標識のための追加の手順が必要ですDTH測定。対照的に、効果的な画像セグメント化及び分析に高速度カメラの記録を結合することによって、技術はここで実証RBCの大きさよりも小さいオーダーの空間分解能（0.42ミ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
生体内顕微鏡	オリンパス	BX51WI	装置
ハイスピードカメラ	フォトロン	1024PCI	装置
ブルーフィルター	HOYA	B390	装置
圧力センサー&バイオパックシステム	バイオパックシステム	TSD104A、MP100	装置
温度調節器	島電	SR1	装置
Plasma Lyte A	Baxter	NDC:0338-0221	37°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前に
生理食塩水0.9%	ブラウン
ヘパリン(5,000 IU / ml)	LEO
PE-10ポリエチレンチューブ	ベクトンディキンソン	427400.024	"OD x .011" ID
PE-50 ポリエチレン チューブ	ベクトン ディキンソン		427411.038" OD x .023" ID
PE-205 ポリエチレン チューブ	ベクトン ディキンソン		427446.082" OD x .062" ID
2-0 非吸収性シルク縫合糸	Deknatel	113-S
5-0 非吸収性シルク縫合	Deknatel	106-S
水循環加熱パッド	ゲイマー
ウォーターバス	フィッシャーサイエンティフィック	アイソテンプ205	機器
滅菌コットンガーゼ	フィッシャーサイエンティフィ	22-415-468
コットンチップアプリケーター	フィッシャーサイエンティフィック	23-400-124
デュモン鉗子	ケントサイエンティフィック	INS14188	手術器具
マイクロ解剖鉗子	ケントサイエンティフィック	INS15915	手術器具
アイリス鉗子 1 x 2 歯	ケントサイエンティフィック	INS15917	サージカル器具
血管カニューレ挿入鉗子	ケントサイエンティフィック	INS500377	手術器具
マイクロハサミ	ケントサイエンティフィック	INS14177	手術器具
アイリスシザー	ケントサイエンティフィック	INS14225	手術器具
ベッセルクリップ	ケントサイエンティフィック	INS14120	手術器具
ジェミニ焼灼システム	Braintree Scientific	GEM 5917	手術器具